Введение

Бактерия, инструмент генной инженерии

Speciesbox
| image = Agrobacterium tumefaciens.png
| image caption = Agrobacterium tumefaciens, прикрепляющийся к клетке моркови
| genus = Agrobacterium
| species = tumefaciens
| authority = (Smith and Townsend 1907) Conn 1942 (Approved Lists 1980)
| type strain = ATCC 4720efn|also known as: CCM:1000, CCUG:3555, CFBP:2412, CIP:104335, DSM:30150, ICMP:5793, BCCM/LMG:182, NCIMB:8150, NCPPB:2992, IAM:14141, IAM:1524, JCM:21034, personal::A1
Pseudomonas tumefaciens (Smith and Townsend 1907) Duggar 1909
Phytomonas tumefaciens (Smith and Townsend 1907) Bergey et al. 1923
Polymonas tumefaciens (Smith and Townsend 1900) Lieske 1928

Гетеротипные синонимы
Agrobacterium fabacearum Delamuta et al 2020 (по ANI) на основе необоснованного изменения типа штамма в Approved Lists 1980 года, которое было отменено. который внедряется в геном растения в полуслучайном месте. Геном растений может быть модифицирован с использованием Agrobacterium для доставки последовательностей, содержащихся в бинарных векторах T-ДНК. Agrobacterium tumefaciens – это альфа-протеобактерия семейства Rhizobiaceae, включающего азотфиксирующие симбионты бобовых. В отличие от азотфиксирующих симбионтов, опухолеобразующие виды Agrobacterium являются патогенными и не приносят растению пользы. Широкий спектр растений, поражаемых Agrobacterium, вызывает серьезную обеспокоенность в сельском хозяйстве. С экономической точки зрения A. tumefaciens является серьезным патогеном для грецкого ореха, виноградной лозы, косточковых плодов, ореховых деревьев, сахарной свеклы, хрена и ревеня, а устойчивость вызываемых им опухолей или галлов особенно вредна для многолетних культур. Agrobacterium tumefaciens оптимально растет при. Время удвоения может варьироваться от 2,5 до 4 часов в зависимости от среды, формата культуры и уровня аэрации. При температурах выше, A. tumefaciens начинает испытывать тепловой шок, что, вероятно, приведет к ошибкам при делении клеток. Многие штаммы A. tumefaciens не содержат pTi. Поскольку Ti-плазмида необходима для развития заболевания, в ризосфере происходят события предпенетрации, способствующие бактериальной конъюгации и обмену плазмидами между бактериями. В присутствии опинов A. tumefaciens производит диффузионный сигнал конъюгации, называемый N-(3-оксооктаноил)-L-гомосеринлактоном (3OC8HSL) или аутоиндуктором Agrobacterium. Это активирует транскрипционный фактор TraR, положительно регулируя транскрипцию генов, необходимых для конъюгации.

Формирование T-пилуса

Для передачи Т-ДНК в растительную клетку *A. tumefaciens* использует механизм секреции IV типа, включающий в себя производство Т-пилуса. При обнаружении ацетосирингона и других веществ, событие передачи сигнала активирует экспрессию 11 генов в опероне *VirB*, которые отвечают за формирование Т-пилуса. Первым формируется пропилин. Это полипептид из 121 аминокислоты, которому требуется процессинг – удаление 47 остатков – для образования субъединицы Т-пилуса. Ранее считалось, что субъединица циклизуется за счет образования пептидной связи между двумя концами полипептида. Однако высокоразрешающая структура Т-пилуса не выявила циклизации пилина, а общая организация субъединиц пилина оказалась очень похожей на организацию других конъюгативных пилов, таких как F-пилюс. Продукты других генов *VirB* используются для переноса субъединиц через плазматическую мембрану. Исследования методом двух гибридов показали, что VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 и VirB10, вероятно, кодируют компоненты транспортера. Для активной транспортировки субъединиц также потребуется АТФаза.

Передача Т-ДНК в растительную клетку

Т-ДНК должна быть вырезана из круговой плазмиды. Это обычно осуществляется генами *vir* внутри плазмиды-помощника. Комплекс VirD1/D2 делает надрезы в ДНК на левой и правой пограничных последовательностях. Белок VirD2 ковалентно присоединен к 5'-концу. VirD2 содержит мотив, который направляет нуклеопротеиновый комплекс к системе секреции типа IV (T4SS). Структура T-пилуса показала, что центральный канал пилуса слишком узок для переноса свернутого VirD2, что позволяет предположить, что VirD2 должен быть частично развернут в процессе конъюгации. Опины – это класс химических веществ, служащих источником азота для *A. tumefaciens*, но не для большинства других организмов. Специфическим типом опина, продуцируемого растениями, инфицированными *A. tumefaciens* C58, является нопалин. Два Ti-плазмида нопалинового типа, pTi SAKURA и pTiC58, были полностью секвенированы. "*A. fabrum*" C58, первый полностью секвенированный патовар, был впервые выделен из краун-галловой опухоли вишни. Геном был одновременно секвенирован Goodner et al. и Wood et al. в 2001 году. Геном *A. tumefaciens* C58 состоит из круговой хромосомы, двух плазмид и линейной хромосомы. Наличие ковалентно замкнутой круговой хромосомы характерно для бактерий, за редкими исключениями. Однако наличие как одной круговой, так и одной линейной хромосомы уникально для группы в этом роде. Две плазмиды – pTiC58, отвечающий за процессы, связанные с вирулентностью, и pAtC58, ранее названный "криптической" плазмидой. Если удалить Ti-плазмиду, то опухолевый рост, являющийся основой для классификации этого вида бактерий, не происходит.

Биотехнологическое применение

На конференции в Асиломаре в 1975 году был достигнут широкий консенсус относительно того, что рекомбинантные технологии недостаточно изучены и требуют жесткого контроля. Способность Agrobacterium к передаче ДНК широко изучалась в биотехнологии как способ введения чужеродных генов в растения. Вскоре после конференции в Асиломаре Марк Ван Монтагю и Джефф Шелл открыли механизм передачи генов между Agrobacterium и растениями, что привело к разработке методов модификации бактерии для превращения ее в эффективную систему доставки для генетической инженерии растений. Плазмидная Т-ДНК, передаваемая растению, является идеальным вектором для генетической инженерии. Это достигается путем клонирования желаемой последовательности гена в бинарные векторы Т-ДНК, которые используются для доставки интересующей последовательности в эукариотические клетки. Этот процесс был реализован с использованием гена люциферазы светлячка для создания светящихся растений. Также возможно трансформировать Arabidopsis thaliana путем погружения цветков в суспензию Agrobacterium: полученные семена будут трансгенными. В лабораторных условиях Т-ДНК также была успешно перенесена в клетки человека, демонстрируя широкий спектр возможностей ее применения. Механизм, посредством которого Agrobacterium вводит материалы в клетку-хозяина, основан на системе секреции типа IV, которая очень похожа на механизмы, используемые патогенами для введения материалов (обычно белков) в клетки человека с помощью системы секреции типа III. Agrobacterium также использует тип сигнализации, консервативный для многих грамотрицательных бактерий, известный как кворумное зондирование. Это делает Agrobacterium важным объектом медицинских исследований.

Естественная генетическая трансформация

Естественная генетическая трансформация у бактерий – это половой процесс, включающий перенос ДНК из одной клетки в другую через окружающую среду и интеграцию донорной последовательности в геном реципиента посредством гомологичной рекомбинации. A. tumefaciens способна к естественной трансформации в почве без какого-либо специального физического или химического воздействия.

Цикл болезни

Agrobacterium tumefaciens зимует в зараженных почвах. Виды Agrobacterium живут преимущественно сапрофитным образом, поэтому даже растительнопаразитические виды этого рода способны выживать в почве в течение длительного времени, даже при отсутствии растения-хозяина. Однако, при наличии растения-хозяина, бактерии проникают в ткани растения через свежие раны или естественные отверстия корней и стеблей вблизи земли. Эти раны могут быть вызваны агротехническими приемами, прививкой, насекомыми и т.д. Попав в растение, бактерии располагаются межклеточно и стимулируют пролиферацию окружающих тканей за счет клеточной трансформации. Agrobacterium осуществляет этот контроль, встраивая Т-ДНК плазмиды в геном растения. Подробности процесса встраивания плазмидной ДНК в геном хозяина см. выше. Избыточный рост тканей растения приводит к образованию наростов на стебле и корнях. Эти опухоли оказывают значительное давление на окружающие ткани растения, вызывая их сдавливание и/или деформацию. Сдавленные сосуды приводят к снижению водного потока в ксилеме. Молодые опухоли мягкие и, следовательно, уязвимы для вторичного заражения насекомыми и сапрофитными микроорганизмами. Это вторичное заражение вызывает разрушение периферических клеточных слоев, а также изменение окраски опухоли из-за гниения. Разрушение мягких тканей приводит к высвобождению Agrobacterium tumefaciens в почву, что позволяет перезапустить цикл заболевания на новом растении-хозяине.

Управление болезнями

Болезнь коронарной галли, вызываемая Agrobacterium tumefaciens, может контролироваться различными методами. Наиболее эффективный способ борьбы с этим заболеванием – применение профилактических мер, таких как стерилизация инструментов для обрезки, чтобы избежать заражения новых растений. Проведение обязательных инспекций посадочного материала и отбраковка зараженных растений, а также отказ от посадки восприимчивых растений на инфицированных полях также являются ценными практиками. Важно избегать повреждения кроны/корней растений в процессе выращивания для предотвращения заболевания. В садоводческих техниках, объединяющих несколько растений для совместного роста, таких как окулировка и прививка, эти методы приводят к образованию растительных ран. Раны являются основным путем проникновения бактерий в растение-хозяина. Поэтому рекомендуется проводить эти процедуры в периоды года, когда агробактерии неактивны. Контроль над насекомыми, повреждающими корни, также помогает снизить уровень заражения, поскольку они вызывают раны (то есть точки входа для бактерий) в корнях растений. Для борьбы с этим заболеванием также используются методы биологического контроля. В 1970-х и 1980-х годах обычной практикой обработки пророщенных семян, рассады и подвоев было погружение их в суспензию K84. K84 состоит из A. radiobacter, вида, близкого к A. tumefaciens, но не патогенного. K84 производит бактериоцин (агроцин 84), который является антибиотиком, специфичным для родственных бактерий, включая A. tumefaciens. Этот метод, успешно применявшийся для контроля заболевания в коммерческих масштабах, сопряжен с риском передачи гена устойчивости от K84 к патогенным агробактериям. Поэтому в 1990-х годах был создан генетически модифицированный штамм K84, известный как K 1026. Этот штамм так же эффективно контролирует коронарную галль, как и K84, но без риска передачи генов устойчивости.

Окружающая среда

Хозяин, среда и патоген – чрезвычайно важные понятия в области патологии растений. Агробактерии обладают самым широким кругом хозяев среди всех растительных патогенов, поэтому основным фактором, который следует учитывать при короновой гнили, является окружающая среда. Существуют различные условия и факторы, создающие благоприятную среду для A. tumefaciens при заражении различных хозяев. Бактерия не может проникнуть в растение без точки входа, такой как рана. Факторы, приводящие к образованию ран на растениях, включают агротехнические приемы, прививку, повреждения от заморозков, трещины роста, почвенных насекомых и других животных, наносящих повреждения растению. Следовательно, в особенно суровые зимы часто наблюдается увеличение заболеваемости короновой гнилью из-за повреждений, связанных с погодными условиями. Помимо этого, существуют способы опосредованного заражения растения-хозяина. Например, нематоды могут выступать в качестве вектора для внесения Agrobacterium в корни растений. В частности, корнепаразитические нематоды повреждают клетки растений, создавая рану, через которую бактерии могут проникнуть. Наконец, температура является важным фактором при рассмотрении инфекции A. tumefaciens. Оптимальная температура для формирования короновой гнили, вызванной этой бактерией, обусловлена термочувствительностью переноса Т-ДНК. Образование опухолей значительно снижается при более высоких температурах.