Механизмы восстановления ДНК и их роль в клетке.

Ремонт ДНК: механизмы выявления и исправления повреждений в геноме клеток человека. Защита от мутаций, вызванных радиацией и метаболизмом.

34 мин чтения

100%

Источник: DNA repair — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Клеточный механизм

журнал

Ремонт ДНК – это совокупность процессов, посредством которых клетка выявляет и исправляет повреждения молекул ДНК, кодирующих её геном. В клетках человека как нормальная метаболическая активность, так и факторы окружающей среды, такие как радиация, могут вызывать повреждение ДНК, приводя к образованию десятков тысяч отдельных молекулярных повреждений на клетку в день. Многие из этих повреждений вызывают структурные нарушения молекулы ДНК и могут изменять или устранять способность клетки к транскрипции гена, кодируемого поврежденной ДНК. Другие повреждения индуцируют потенциально вредные мутации в геноме клетки, которые влияют на выживание её дочерних клеток после митоза. В результате процесс восстановления ДНК постоянно активен, реагируя на повреждения структуры ДНК. Когда нормальные процессы восстановления дают сбой, а клеточный апоптоз не происходит, может возникнуть непоправимое повреждение ДНК. Это в конечном итоге может привести к злокачественным опухолям, или раку, согласно гипотезе двух ударов. Скорость восстановления ДНК зависит от многих факторов, включая тип клетки, возраст клетки и внеклеточную среду. Клетка, накопившая большое количество повреждений ДНК, или утратившая способность эффективно восстанавливать повреждения, нанесенные её ДНК, может перейти в одно из трех возможных состояний: необратимое состояние покоя, известное как клеточное старение, клеточное самоубийство, также известное как апоптоз или запрограммированная клеточная смерть, и нерегулируемое деление клеток, которое может привести к образованию раковой опухоли.

Способность клетки к восстановлению ДНК жизненно важна для целостности её генома и, следовательно, для нормальной функциональности организма. Многие гены, которые изначально считалось, что влияют на продолжительность жизни, оказались вовлечены в восстановление и защиту ДНК. Нобелевская премия по химии 2015 года была присуждена Томасу Линдалу, Полу Модриху и Азизу Санкару за их работу над молекулярными механизмами процессов восстановления ДНК.

Повреждение ДНК

Повреждение ДНК, вызванное факторами окружающей среды и нормальными метаболическими процессами внутри клетки, происходит со скоростью от 10 000 до 1 000 000 молекулярных повреждений на клетку в день. Репликация поврежденной ДНК перед делением клетки может привести к включению неверных оснований напротив поврежденных. Дочерние клетки, унаследовавшие эти неверные основания, несут мутации, из которых исходная последовательность ДНК не может быть восстановлена (за исключением редких случаев обратной мутации, например, посредством конверсии генов).

Ядерная и митохондриальная

В клетках человека и эукариотических клетках в целом ДНК находится в двух клеточных локациях – внутри ядра и внутри митохондрий. Ядерная ДНК (n ДНК) существует в виде хроматина на нерепликативных стадиях клеточного цикла и конденсируется в агрегатные структуры, известные как хромосомы, во время деления клетки. В любом из этих состояний ДНК сильно компактирована и свернута вокруг белков, подобных бусинам, называемых гистонами. Когда клетке необходимо экспрессировать генетическую информацию, закодированную в ее n ДНК, необходимый хромосомный участок раскручивается, гены, расположенные на нем, экспрессируются, а затем участок вновь конденсируется до своего покоящегося состояния. Митохондриальная ДНК (мтДНК) находится внутри митохондриальных органелл, существует в нескольких копиях и также тесно связана с рядом белков, образуя комплекс, известный как нуклеоид. Внутри митохондрий реактивные формы кислорода (ROS) или свободные радикалы, побочные продукты постоянного производства аденозинтрифосфата (АТФ) посредством окислительного фосфорилирования, создают высокоокислительную среду, которая, как известно, повреждает мтДНК. Критически важным ферментом, противодействующим токсичности этих форм, является супероксиддисмутаза, которая присутствует как в митохондриях, так и в цитоплазме эукариотических клеток.

Старение и апоптоз

Старение, необратимый процесс, при котором клетка перестает делиться, является защитной реакцией на укорочение концов хромосом, называемых теломерами. Теломеры – это протяженные участки повторяющейся некодирующей ДНК, которые защищают хромосомы и частично разрушаются при каждом делении клетки (см. Предел Хейфлика). В отличие от этого, quiescence (клеточное покояние) – это обратимое состояние клеточной спячки, не связанное с повреждением генома (см. клеточный цикл). Старение клеток может служить функциональной альтернативой апоптозу в тех случаях, когда физическое присутствие клетки необходимо организму по пространственным причинам, выступая в качестве механизма "последней надежды" для предотвращения репликации клетки с поврежденной ДНК в отсутствие сигналов, стимулирующих рост. Нерегулируемое деление клеток может привести к образованию опухоли (см. рак), что потенциально смертельно для организма. Следовательно, индукция старения и апоптоза рассматривается как часть стратегии защиты от рака.

Мутация

Важно различать повреждение ДНК и мутацию – два основных типа ошибок в ДНК. Повреждение ДНК и мутация – это принципиально разные явления. Повреждение ДНК приводит к физическим аномалиям в ДНК, таким как одно- и двухцепочечные разрывы, остатки 8-гидроксидеоксигуанозина и аддукты полициклических ароматических углеводородов. Повреждение ДНК может быть распознано ферментами и, следовательно, может быть правильно восстановлено, если доступна избыточная информация, такая как неповрежденная последовательность в комплементарной цепи ДНК или в гомологичной хромосоме, для копирования. Если клетка сохраняет повреждение ДНК, транскрипция гена может быть предотвращена, а следовательно, блокируется и трансляция в белок. Репликация также может быть заблокирована или клетка может погибнуть. В отличие от повреждения ДНК, мутация – это изменение в последовательности оснований ДНК. Мутацию не могут распознать ферменты, как только изменение основания присутствует в обеих цепях ДНК, и, следовательно, мутацию нельзя исправить. На клеточном уровне мутации могут вызывать изменения в функции и регуляции белка. Мутации реплицируются при делении клетки. В популяции клеток частота мутантных клеток будет увеличиваться или уменьшаться в зависимости от влияния мутации на способность клетки выживать и размножаться. Хотя повреждение ДНК и мутации сильно отличаются друг от друга, они связаны, поскольку повреждение ДНК часто вызывает ошибки синтеза ДНК во время репликации или репарации; эти ошибки являются основным источником мутаций. Учитывая эти свойства повреждения ДНК и мутаций, можно увидеть, что повреждение ДНК представляет собой особую проблему для не делящихся или медленно делящихся клеток, где непоправленное повреждение будет иметь тенденцию накапливаться со временем. С другой стороны, в быстро делящихся клетках непоправленное повреждение ДНК, которое не убивает клетку, блокируя репликацию, будет иметь тенденцию вызывать ошибки репликации и, следовательно, мутации. Подавляющее большинство мутаций, которые не являются нейтральными по своему воздействию, вредны для выживания клетки. Таким образом, в популяции клеток, составляющих ткань с делящимися клетками, мутантные клетки будут, как правило, вымирать. Однако редкие мутации, обеспечивающие преимущество в выживании, будут иметь тенденцию к клональному расширению за счет соседних клеток в ткани. Это преимущество для клетки невыгодно для всего организма, поскольку такие мутантные клетки могут привести к раку. Таким образом, повреждение ДНК в часто делящихся клетках, поскольку оно приводит к мутациям, является одной из основных причин рака. В отличие от этого, повреждение ДНК в клетках, которые редко делятся, вероятно, является одной из основных причин старения.

It is important to distinguish between DNA damage and mutation, the two major types of error in DNA. DNA damage and mutation are fundamentally different. Damage results in physical abnormalities in the DNA, such as single and double strand breaks, 8 hydroxydeoxyguanosine residues, and polycyclic aromatic hydrocarbon adducts. DNA damage can be recognized by enzymes, and thus can be correctly repaired if redundant information, such as the undamaged sequence in the complementary DNA strand or in a homologous chromosome, is available for copying. If a cell retains DNA damage, transcription of a gene can be prevented, and thus translation into a protein will also be blocked. Replication may also be blocked or the cell may die. In contrast to DNA damage, a mutation is a change in the base sequence of the DNA. A mutation cannot be recognized by enzymes once the base change is present in both DNA strands, and thus a mutation cannot be repaired. At the cellular level, mutations can cause alterations in protein function and regulation. Mutations are replicated when the cell replicates. In a population of cells, mutant cells will increase or decrease in frequency according to the effects of the mutation on the ability of the cell to survive and reproduce. Although distinctly different from each other, DNA damage and mutation are related because DNA damage often causes errors of DNA synthesis during replication or repair; these errors are a major source of mutation. Given these properties of DNA damage and mutation, it can be seen that DNA damage is a special problem in non dividing or slowly dividing cells, where unrepaired damage will tend to accumulate over time. On the other hand, in rapidly dividing cells, unrepaired DNA damage that does not kill the cell by blocking replication will tend to cause replication errors and thus mutation. The great majority of mutations that are not neutral in their effect are deleterious to a cell's survival. Thus, in a population of cells composing a tissue with replicating cells, mutant cells will tend to be lost. However, infrequent mutations that provide a survival advantage will tend to clonally expand at the expense of neighboring cells in the tissue. This advantage to the cell is disadvantageous to the whole organism because such mutant cells can give rise to cancer. Thus, DNA damage in frequently dividing cells, because it gives rise to mutations, is a prominent cause of cancer. In contrast, DNA damage in infrequently dividing cells is likely a prominent cause of aging.

Механизмы

Клетки не могут функционировать, если повреждение ДНК нарушает целостность и доступность необходимой информации в геноме (но клетки остаются внешне функциональными, когда отсутствуют или повреждены неважные гены). В зависимости от типа повреждения, нанесенного двойной спиральной структуре ДНК, эволюционировали различные стратегии восстановления для возвращения утраченной информации. Если это возможно, клетки используют неповрежденную комплементарную нить ДНК или сестринскую хроматиду в качестве шаблона для восстановления исходной информации. При отсутствии доступа к шаблону клетки используют подверженный ошибкам механизм восстановления, известный как транслезионный синтез, в качестве крайней меры. Повреждение ДНК изменяет пространственную конфигурацию спирали, и клетка способна обнаруживать эти изменения. После локализации повреждения, специфические молекулы восстановления ДНК связываются в месте повреждения или рядом с ним, индуцируя связывание других молекул и формирование комплекса, обеспечивающего фактическое восстановление.

Прямая обратная передача

Известно, что клетки устраняют три типа повреждений ДНК, химически обращая их вспять. Эти механизмы не требуют матрицы, поскольку типы повреждений, которые они нейтрализуют, могут возникать только в одном из четырех оснований. Такие механизмы прямого восстановления специфичны для типа повреждения и не связаны с разрывом фосфодиэфирной цепи. Образование пиримидиновых димеров при облучении УФ-светом приводит к образованию аномальной ковалентной связи между соседними пиримидиновыми основаниями. Процесс фотореактивации непосредственно устраняет это повреждение посредством действия фермента фотолиазы, активация которого обязательно зависит от энергии, поглощаемой синим/УФ-светом (длина волны 300–500 нм) для стимуляции катализа. Фотолиаза, древний фермент, присутствующий в бактериях, грибах и большинстве животных, больше не функционирует у человека, который вместо этого использует иссечение нуклеотидов для восстановления повреждений, вызванных УФ-излучением. Другой тип повреждения, метилирование гуаниновых оснований, непосредственно восстанавливается ферментом метилгуанинметилтрансферазой (MGMT), бактериальным эквивалентом которой является ogt. Это дорогостоящий процесс, поскольку каждая молекула MGMT может быть использована только один раз; то есть реакция стехиометрическая, а не каталитическая. Обобщенный ответ на метилирующие агенты у бактерий известен как адаптивный ответ и обеспечивает определенный уровень устойчивости к алкилирующим агентам при продолжительном воздействии за счет повышения уровня экспрессии ферментов, осуществляющих восстановление алкилирования. Третий тип повреждения ДНК, восстанавливаемый клетками, – это специфическое метилирование оснований цитозина и аденина.

Одноцепочечные повреждения

Когда только одна из двух цепей двойной спирали имеет дефект, другая цепь может быть использована в качестве матрицы для направления коррекции поврежденной цепи. Для восстановления повреждений в одной из двух парных молекул ДНК существует ряд механизмов репарации, которые удаляют поврежденный нуклеотид и заменяют его неповрежденным нуклеотидом, комплементарным тому, что находится в неповрежденной цепи ДНК. Фермент удаляет поврежденное основание из ДНК, разрывая связь между основанием и дезоксирибозой. Эти ферменты удаляют одно основание, создавая апуринический или апиримидинический участок (AP-участок). Репарация вырезанием нуклеотидов (NER): объемные повреждения, искажающие спираль, такие как димеризация пиримидинов, вызванная ультрафиолетовым светом, обычно восстанавливаются в три этапа. Сначала повреждение распознается, затем эндонуклеазы удаляют участки ДНК длиной 12-24 нуклеотида как выше, так и ниже места повреждения, после чего удаленный участок ДНК ресинтезируется. NER – высококонсервативный механизм репарации, используемый почти во всех эукариотических и прокариотических клетках.

Двухстворчатые разрывы

Двойные разрывы нитей, при которых обе нити в двойной спирали прерываются, особенно опасны для клетки, поскольку они могут приводить к перестройке генома. Фактически, когда разрыв двойной нити сопровождается перекрестной сшивкой, соединяющей две нити в одной точке, ни одна из нитей не может быть использована в качестве матрицы для механизмов репарации, в результате чего клетка не сможет завершить митоз при следующем делении и либо погибнет, либо, в редких случаях, подвергнется мутации. Существуют три механизма репарации разрывов двойных нитей (DSB): не гомологичное соединение концов (NHEJ), соединение концов, опосредованное микрогомологией (MMEJ), и гомологичная рекомбинация (HR).

В NHEJ ДНК-лигаза IV, специализированная ДНК-лигаза, формирующая комплекс с кофактором XRCC4, непосредственно соединяет два конца. Для обеспечения точной репарации NHEJ опирается на короткие гомологичные последовательности, называемые микрогомологиями, присутствующие на одноцепочечных выступах концов ДНК, которые должны быть соединены. Если эти выступы совместимы, репарация обычно точна. NHEJ также может вносить мутации в процессе репарации. Потеря поврежденных нуклеотидов в месте разрыва может приводить к делециям, а соединение несоответствующих концов – к вставкам или транслокациям. NHEJ особенно важен до репликации ДНК клеткой, поскольку отсутствует матрица для репарации посредством гомологичной рекомбинации. В высших эукариотах существуют "резервные" пути NHEJ. Помимо своей роли хранителя генома, NHEJ необходим для соединения двойных разрывов, индуцированных во время V(D)J-рекомбинации – процесса, генерирующего разнообразие в рецепторах B-клеток и T-клеток в иммунной системе позвоночных. MMEJ начинается с короткого диапазона ресекции концов ДНК нуклеазой MRE11 с обеих сторон от разрыва двойной нити для выявления областей микрогомологии. На последующих этапах требуется поли(АДФ-рибоза)полимераза 1 (PARP1) и она может быть ранним этапом в MMEJ. Происходит спаривание областей микрогомологии, за которым следует привлечение эндонуклеазы 1 (FEN1), специфичной для структуры отворота, для удаления выступающих отворотов. Затем происходит привлечение XRCC1–LIG3 к месту для лигирования концов ДНК, что приводит к восстановлению целостности ДНК. MMEJ всегда сопровождается делецией, поэтому MMEJ является мутагенным путем репарации ДНК. HR требует наличия идентичной или почти идентичной последовательности, которая будет использоваться в качестве матрицы для репарации разрыва. Ферментативный аппарат, ответственный за этот процесс репарации, почти идентичен аппарату, ответственному за хромосомный кроссинговер во время мейоза. Этот путь позволяет восстановить поврежденную хромосому, используя в качестве матрицы сестринскую хроматиду (доступную в G2 после репликации ДНК) или гомологичную хромосому. DSB, вызванные репликационным аппаратом, пытающимся синтезировать через одноцепочечный разрыв или неисправленную повреждение, приводят к коллапсу репликационной вилки и обычно репарируются посредством рекомбинации. В системе in vitro MMEJ происходила в клетках млекопитающих на уровне 10–20% от HR, когда механизмы HR и NHEJ также были доступны. Топоизомеразы вводят как одноцепочечные, так и двойные разрывы в процессе изменения суперспиральности ДНК, что особенно часто встречается в регионах вблизи открытой репликационной вилки. Такие разрывы не считаются повреждением ДНК, поскольку они являются естественным промежуточным звеном в биохимическом механизме топоизомеразы и немедленно репарируются ферментами, которые их создали. Другой тип разрывов ДНК двойной нити происходит из теплочувствительных или теплолабильных участков ДНК. Эти участки ДНК не являются первичными DSB. Однако они превращаются в DSB после обработки повышенной температурой. Ионизирующее излучение может индуцировать высококомплексную форму повреждения ДНК в виде кластерного повреждения. Оно состоит из различных типов повреждений ДНК в различных местах спирали ДНК. Некоторые из этих близко расположенных повреждений, вероятно, могут превратиться в DSB при воздействии высоких температур. Но точная природа этих повреждений и их взаимодействие пока неизвестны.

In NHEJ, DNA Ligase IV, a specialized DNA ligase that forms a complex with the cofactor XRCC4, directly joins the two ends. To guide accurate repair, NHEJ relies on short homologous sequences called microhomologies present on the single stranded tails of the DNA ends to be joined. If these overhangs are compatible, repair is usually accurate. NHEJ can also introduce mutations during repair. Loss of damaged nucleotides at the break site can lead to deletions, and joining of nonmatching termini forms insertions or translocations. NHEJ is especially important before the cell has replicated its DNA, since there is no template available for repair by homologous recombination. There are "backup" NHEJ pathways in higher eukaryotes. Besides its role as a genome caretaker, NHEJ is required for joining hairpin capped double strand breaks induced during V(D)J recombination, the process that generates diversity in B cell and T cell receptors in the vertebrate immune system. MMEJ starts with short range end resection by MRE11 nuclease on either side of a double strand break to reveal microhomology regions. In further steps, Poly (ADP ribose) polymerase 1 (PARP1) is required and may be an early step in MMEJ. There is pairing of microhomology regions followed by recruitment of flap structure specific endonuclease 1 (FEN1) to remove overhanging flaps. This is followed by recruitment of XRCC1–LIG3 to the site for ligating the DNA ends, leading to an intact DNA. MMEJ is always accompanied by a deletion, so that MMEJ is a mutagenic pathway for DNA repair. HR requires the presence of an identical or nearly identical sequence to be used as a template for repair of the break. The enzymatic machinery responsible for this repair process is nearly identical to the machinery responsible for chromosomal crossover during meiosis. This pathway allows a damaged chromosome to be repaired using a sister chromatid (available in G2 after DNA replication) or a homologous chromosome as a template. DSBs caused by the replication machinery attempting to synthesize across a single strand break or unrepaired lesion cause collapse of the replication fork and are typically repaired by recombination. In an in vitro system, MMEJ occurred in mammalian cells at the levels of 10–20% of HR when both HR and NHEJ mechanisms were also available. Topoisomerases introduce both single and double strand breaks in the course of changing the DNA's state of supercoiling, which is especially common in regions near an open replication fork. Such breaks are not considered DNA damage because they are a natural intermediate in the topoisomerase biochemical mechanism and are immediately repaired by the enzymes that created them. Another type of DNA double strand breaks originates from the DNA heat sensitive or heat labile sites. These DNA sites are not initial DSBs. However, they convert to DSB after treating with elevated temperature. Ionizing irradiation can induces a highly complex form of DNA damage as clustered damage. It consists of different types of DNA lesions in various locations of the DNA helix. Some of these closely located lesions can probably convert to DSB by exposure to high temperatures. But the exact nature of these lesions and their interactions is not yet known

Транслесионный синтез

Транслезионный синтез (TLS) – это процесс толерантности к повреждениям ДНК, позволяющий механизму репликации ДНК реплицировать участки с повреждениями ДНК, такие как тиминные димеры или сайты AP. Он включает в себя замену обычных ДНК-полимераз на специализированные транслезионные полимеразы (например, ДНК-полимераза IV или V из семейства Y-полимераз), часто обладающие более крупными активными центрами, способствующими встраиванию оснований напротив поврежденных нуклеотидов. Считается, что переключение полимеразы опосредовано, в частности, посттрансляционной модификацией фактора процессивности репликации PCNA. Транслезионные полимеразы часто характеризуются низкой точностью (высокой склонностью к встраиванию неправильных оснований) на неповрежденных матрицах по сравнению с обычными полимеразами. Однако многие из них чрезвычайно эффективны во встраивании правильных оснований напротив определенных типов повреждений. Например, Pol η обеспечивает безошибочный обход повреждений, вызванных УФ-излучением, в то время как Pol ι вносит мутации в этих участках. Pol η добавляет первый аденин к T^T фотодимеру, используя ватсон-криковское спаривание оснований, а второй аденин добавляется в син-конформации, используя спаривание оснований Хугстина. С точки зрения клетки, риск введения точечных мутаций во время транслезионного синтеза может быть предпочтительнее, чем обращение к более радикальным механизмам репарации ДНК, которые могут привести к грубым хромосомным аберрациям или гибели клеток. Вкратце, процесс включает в себя специализированные полимеразы, которые либо обходят, либо восстанавливают повреждения в местах остановки репликации ДНК. Например, человеческая ДНК-полимераза η способна обходить сложные повреждения ДНК, такие как внутрицепочечная сшивка гуанин-тимин, G[8,5 Me]T, хотя она может вызывать направленные и полунаправленные мутации. Паромита Райчаудхури и Ашис Басу изучили токсичность и мутагенность того же повреждения у Escherichia coli, реплицируя плазмиду, модифицированную G[8,5 Me]T, в E. coli со специфическими нокаутами генов ДНК-полимераз. Жизнеспособность была очень низкой в штамме, лишенном pol II, pol IV и pol V – трех ДНК-полимераз, индуцируемых SOS, что указывает на то, что транслезионный синтез в основном осуществляется этими специализированными ДНК-полимеразами. Платформу для обхода этих полимераз обеспечивает пролиферирующий клеточный ядерный антиген (PCNA). В нормальных условиях PCNA, связанная с полимеразами, реплицирует ДНК. В месте повреждения PCNA подвергается убиквитинированию или модификации белками RAD6/RAD18, чтобы предоставить платформу для специализированных полимераз, позволяющую обойти повреждение и возобновить репликацию ДНК. После транслезионного синтеза требуется удлинение. Это удлинение может быть выполнено репликативной полимеразой, если TLS не содержит ошибок, как в случае Pol η, но если TLS приводит к несоответствию, для его удлинения необходима специализированная полимераза – Pol ζ. Pol ζ уникальна тем, что способна удлинять терминальные несоответствия, в то время как более процессивные полимеразы не могут. Таким образом, при встрече с повреждением репликационная вилка останавливается, PCNA переключается с процессивной полимеразы на TLS-полимеразу, такую как Pol ι, для устранения повреждения, затем PCNA может переключиться на Pol ζ для удлинения несоответствия, и, наконец, PCNA переключается на процессивную полимеразу для продолжения репликации.

Translesion synthesis (TLS) is a DNA damage tolerance process that allows the DNA replication machinery to replicate past DNA lesions such as thymine dimers or AP sites. It involves switching out regular DNA polymerases for specialized translesion polymerases (i. e. DNA polymerase IV or V, from the Y Polymerase family), often with larger active sites that can facilitate the insertion of bases opposite damaged nucleotides. The polymerase switching is thought to be mediated by, among other factors, the post translational modification of the replication processivity factor PCNA. Translesion synthesis polymerases often have low fidelity (high propensity to insert wrong bases) on undamaged templates relative to regular polymerases. However, many are extremely efficient at inserting correct bases opposite specific types of damage. For example, Pol η mediates error free bypass of lesions induced by UV irradiation, whereas Pol ι introduces mutations at these sites. Pol η is known to add the first adenine across the T^T photodimer using Watson Crick base pairing and the second adenine will be added in its syn conformation using Hoogsteen base pairing. From a cellular perspective, risking the introduction of point mutations during translesion synthesis may be preferable to resorting to more drastic mechanisms of DNA repair, which may cause gross chromosomal aberrations or cell death. In short, the process involves specialized polymerases either bypassing or repairing lesions at locations of stalled DNA replication. For example, Human DNA polymerase eta can bypass complex DNA lesions like guanine thymine intra strand crosslink, G[8,5 Me]T, although it can cause targeted and semi targeted mutations. Paromita Raychaudhury and Ashis Basu studied the toxicity and mutagenesis of the same lesion in Escherichia coli by replicating a G[8,5 Me]T modified plasmid in E. coli with specific DNA polymerase knockouts. Viability was very low in a strain lacking pol II, pol IV, and pol V, the three SOS inducible DNA polymerases, indicating that translesion synthesis is conducted primarily by these specialized DNA polymerases. A bypass platform is provided to these polymerases by Proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Under normal circumstances, PCNA bound to polymerases replicates the DNA. At a site of lesion, PCNA is ubiquitinated, or modified, by the RAD6/RAD18 proteins to provide a platform for the specialized polymerases to bypass the lesion and resume DNA replication. After translesion synthesis, extension is required. This extension can be carried out by a replicative polymerase if the TLS is error free, as in the case of Pol η, yet if TLS results in a mismatch, a specialized polymerase is needed to extend it; Pol ζ. Pol ζ is unique in that it can extend terminal mismatches, whereas more processive polymerases cannot. So when a lesion is encountered, the replication fork will stall, PCNA will switch from a processive polymerase to a TLS polymerase such as Pol ι to fix the lesion, then PCNA may switch to Pol ζ to extend the mismatch, and last PCNA will switch to the processive polymerase to continue replication.

Глобальная реакция на повреждение ДНК

Клетки, подверженные воздействию ионизирующего излучения, ультрафиолетового света или химических веществ, склонны к образованию множественных участков объемных повреждений ДНК и разрывов двойных нитей. Более того, агенты, повреждающие ДНК, могут повреждать и другие биомолекулы, такие как белки, углеводы, липиды и РНК. Накопление повреждений, в частности, разрывов двойных нитей или аддуктов, блокирующих репликационные вилки, является одним из известных сигналов, стимулирующих глобальный ответ на повреждение ДНК. Глобальный ответ на повреждение – это механизм, направленный на самосохранение клеток, который активирует множество путей макромолекулярного восстановления, обхода повреждений, толерантности или апоптоза. Общими чертами глобального ответа являются индукция множественных генов, остановка клеточного цикла и ингибирование клеточного деления.

Первые шаги

Упаковка эукариотической ДНК в хроматин представляет собой препятствие для всех процессов, основанных на ДНК, требующих рекрутирования ферментов к местам их действия. Для обеспечения репарации ДНК хроматин должен быть ремоделирован. У эукариот, АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие комплексы и гистон-модифицирующие ферменты являются двумя основными факторами, используемыми для осуществления этого процесса ремоделирования. Расслабление хроматина происходит быстро в месте повреждения ДНК. На одном из самых ранних этапов, стресс-активированная протеинкиназа, c-Jun N-концевая киназа (JNK), фосфорилирует SIRT6 на серине 10 в ответ на разрывы двойной нити или другое повреждение ДНК. Эта посттрансляционная модификация облегчает мобилизацию SIRT6 к местам повреждения ДНК и необходима для эффективного рекрутирования поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 (PARP1) к местам разрыва ДНК и для эффективной репарации разрывов двойной нити (DSB). PARP1 синтезирует полимерные цепи аденозиндифосфатрибозы (поли(АДФ-рибоза) или PAR) на себе. Далее, хроматин-ремоделер ALC1 быстро связывается с продуктом действия PARP1 – поли(АДФ-рибозной) цепью, и ALC1 завершает прибытие к поврежденной ДНК в течение 10 секунд после возникновения повреждения. γH2AX (H2AX, фосфорилированный на серине 139) может быть обнаружен уже через 20 секунд после облучения клеток (при образовании разрывов двойной нити ДНК), а достижение половины максимального накопления γH2AX происходит в течение одной минуты. RNF8 опосредует обширную деконденсацию хроматина посредством последующего взаимодействия с CHD4, компонентом комплекса ремоделирования нуклеосом и деацетилазы NuRD. DDB2 существует в гетеродимерном комплексе с DDB1. Этот комплекс далее взаимодействует с белком убиквитин-лигазы CUL4A и с PARP1. Этот более крупный комплекс быстро ассоциируется с повреждениями, вызванными УФ-излучением, в хроматине, при этом половина максимальной ассоциации завершается за 40 секунд.

Контрольные пункты повреждения ДНК

После повреждения ДНК активируются контрольные точки клеточного цикла. Активация контрольной точки приостанавливает клеточный цикл и дает клетке время на восстановление повреждений, прежде чем продолжить деление. Контрольные точки повреждения ДНК возникают на границах G1/S и G2/M, а также существует внутриклеточная контрольная точка S. Активация контрольной точки контролируется двумя основными киназами – ATM и ATR. ATM реагирует на разрывы двойных нитей ДНК и нарушения структуры хроматина, в то время как ATR преимущественно реагирует на остановленные репликационные вилки. Эти киназы фосфорилируют нижележащие мишени в каскаде передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к остановке клеточного цикла. Также был идентифицирован класс белков-медиаторов контрольных точек, включающий BRCA1, MDC1 и 53BP1. Эти белки, по-видимому, необходимы для передачи сигнала активации контрольной точки нижележащим белкам. Контрольная точка повреждения ДНК – это путь передачи сигналов, который блокирует прогрессирование клеточного цикла в фазах G1, G2 и метафазы, а также замедляет скорость прохождения фазы S при повреждении ДНК. Это приводит к паузе в клеточном цикле, позволяя клетке восстановить повреждения перед продолжением деления. Белки контрольных точек можно разделить на четыре группы: белковые киназы, подобные фосфатидилинозитол-3-киназе (PI3K), группа, подобная пролиферирующему клеточному ядерному антигену (PCNA), две серин/треонин (S/T) киназы и их адапторы. Центральное место во всех ответах на повреждение ДНК занимает пара крупных белковых киназ, принадлежащих к первой группе PI3K-подобных киназ – ATM (Ataxia telangiectasia mutated) и ATR (Ataxia and Rad related), последовательность и функции которых хорошо сохранились в ходе эволюции. Любой ответ на повреждение ДНК требует либо ATM, либо ATR, поскольку они способны связываться с хромосомами в месте повреждения ДНК вместе с вспомогательными белками, которые служат платформами для сборки компонентов ответа на повреждение ДНК и комплексов репарации ДНК. Важной нижележащей мишенью ATM и ATR является p53, поскольку он необходим для индуцирования апоптоза после повреждения ДНК. Ингибитор циклинозависимой киназы p21 индуцируется как p53-зависимыми, так и p53-независимыми механизмами и может остановить клеточный цикл в контрольных точках G1/S и G2/M путем деактивации комплексов циклин/циклинозависимая киназа.

After DNA damage, cell cycle checkpoints are activated. Checkpoint activation pauses the cell cycle and gives the cell time to repair the damage before continuing to divide. DNA damage checkpoints occur at the G1/S and G2/M boundaries. An intra S checkpoint also exists. Checkpoint activation is controlled by two master kinases, ATM and ATR. ATM responds to DNA double strand breaks and disruptions in chromatin structure, whereas ATR primarily responds to stalled replication forks. These kinases phosphorylate downstream targets in a signal transduction cascade, eventually leading to cell cycle arrest. A class of checkpoint mediator proteins including BRCA1, MDC1, and 53BP1 has also been identified. These proteins seem to be required for transmitting the checkpoint activation signal to downstream proteins. DNA damage checkpoint is a signal transduction pathway that blocks cell cycle progression in G1, G2 and metaphase and slows down the rate of S phase progression when DNA is damaged. It leads to a pause in cell cycle allowing the cell time to repair the damage before continuing to divide. Checkpoint Proteins can be separated into four groups: phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) like protein kinase, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) like group, two serine/threonine(S/T) kinases and their adaptors. Central to all DNA damage induced checkpoints responses is a pair of large protein kinases belonging to the first group of PI3K like protein kinases the ATM (Ataxia telangiectasia mutated) and ATR (Ataxia and Rad related) kinases, whose sequence and functions have been well conserved in evolution. All DNA damage response requires either ATM or ATR because they have the ability to bind to the chromosomes at the site of DNA damage, together with accessory proteins that are platforms on which DNA damage response components and DNA repair complexes can be assembled. An important downstream target of ATM and ATR is p53, as it is required for inducing apoptosis following DNA damage. The cyclin dependent kinase inhibitor p21 is induced by both p53 dependent and p53 independent mechanisms and can arrest the cell cycle at the G1/S and G2/M checkpoints by deactivating cyclin/cyclin dependent kinase complexes.

Реакция SOS прокариотов

SOS-ответ – это изменения в экспрессии генов у *Escherichia coli* и других бактерий в ответ на значительные повреждения ДНК. Прокариотическая система SOS регулируется двумя ключевыми белками: LexA и RecA. Гомодимер LexA является транскрипционным репрессором, который связывается с операторными последовательностями, обычно называемыми SOS-боксами. У *Escherichia coli* известно, что LexA регулирует транскрипцию примерно 48 генов, включая гены *lexA* и *recA*. SOS-ответ широко распространен в домене Bacteria, но в основном отсутствует в некоторых бактериальных типах, таких как спирохеты. Наиболее распространенными клеточными сигналами, активирующими SOS-ответ, являются области одноцепочечной ДНК (ssDNA), возникающие при остановке вилок репликации или при разрывах двойной спирали, которые обрабатываются ДНК-геликазой для разделения двух цепей ДНК. После восстановления повреждения ДНК или его обхода с помощью полимераз или посредством рекомбинации, количество одноцепочечной ДНК в клетках уменьшается, что снижает количество филаментов RecA и, следовательно, уменьшает расщепляющую активность гомодимера LexA, который затем связывается с SOS-боксами вблизи промоторов и восстанавливает нормальную экспрессию генов.

Транскрипционные реакции эукариотов на повреждение ДНК

Эукариотические клетки, подверженные воздействию повреждающих ДНК агентов, также активируют важные защитные механизмы, индуцируя множество белков, участвующих в восстановлении ДНК, контроле контрольных точек клеточного цикла, транспорте и деградации белков. Такой геномный транскрипционный ответ очень сложен и строго регулируется, что обеспечивает координированную глобальную реакцию на повреждение. Воздействие повреждающих ДНК агентов на дрожжи Saccharomyces cerevisiae приводит к перекрывающимся, но различным профилям транскрипции. Сходство с реакцией на экологический стресс указывает на существование общего глобального пути ответа на стресс на уровне транскрипционной активации. В отличие от этого, различные типы клеток человека по-разному реагируют на повреждения, что свидетельствует об отсутствии единого глобального ответа. Вероятным объяснением этой разницы между клетками дрожжей и клеток человека может быть гетерогенность клеток млекопитающих. У животных различные типы клеток распределены между разными органами, которые развили различную чувствительность к повреждению ДНК. В целом, глобальный ответ на повреждение ДНК включает экспрессию множества генов, ответственных за пострепликационный ремонт, гомологичную рекомбинацию, нуклеотидное иссечение, контрольные точки повреждения ДНК, глобальную транскрипционную активацию, гены, контролирующие распад мРНК, и многие другие. Значительное повреждение клетки ставит перед ней важный выбор: подвергнуться апоптозу и погибнуть или выжить, заплатив цену жизни с измененным геномом. Повышение толерантности к повреждениям может привести к увеличению выживаемости и, следовательно, к большему накоплению мутаций. Дрожжевой Rev1 и человеческая полимераза η относятся к Y-семейству транслезионных ДНК-полимераз, присутствующих во время глобального ответа на повреждение ДНК и отвечающих за усиленный мутагенез при глобальном ответе на повреждение ДНК у эукариот. Аналогичным образом, мыши с дефицитом ключевого белка, участвующего в восстановлении и транскрипции, который раскручивает ДНК-спирали, демонстрируют преждевременное развитие заболеваний, связанных со старением, и, как следствие, сокращение продолжительности жизни. Однако не каждый дефицит репарации ДНК вызывает именно предсказанные эффекты; мыши с дефицитом пути NER имели сокращенную продолжительность жизни без соответствующего увеличения частоты мутаций. Максимальная продолжительность жизни мышей, голых землекопов и людей составляет примерно ~3, ~30 и ~129 лет соответственно. Из них самый короткоживущий вид – мышь – экспрессирует гены репарации ДНК, включая основные гены в нескольких путях репарации ДНК, на более низком уровне, чем люди и голые землекопы.

Eukaryotic cells exposed to DNA damaging agents also activate important defensive pathways by inducing multiple proteins involved in DNA repair, cell cycle checkpoint control, protein trafficking and degradation. Such genome wide transcriptional response is very complex and tightly regulated, thus allowing coordinated global response to damage. Exposure of yeast Saccharomyces cerevisiae to DNA damaging agents results in overlapping but distinct transcriptional profiles. Similarities to environmental shock response indicates that a general global stress response pathway exist at the level of transcriptional activation. In contrast, different human cell types respond to damage differently indicating an absence of a common global response. The probable explanation for this difference between yeast and human cells may be in the heterogeneity of mammalian cells. In an animal different types of cells are distributed among different organs that have evolved different sensitivities to DNA damage. In general global response to DNA damage involves expression of multiple genes responsible for postreplication repair, homologous recombination, nucleotide excision repair, DNA damage checkpoint, global transcriptional activation, genes controlling mRNA decay, and many others. A large amount of damage to a cell leaves it with an important decision: undergo apoptosis and die, or survive at the cost of living with a modified genome. An increase in tolerance to damage can lead to an increased rate of survival that will allow a greater accumulation of mutations. Yeast Rev1 and human polymerase η are members of Y family translesion DNA polymerases present during global response to DNA damage and are responsible for enhanced mutagenesis during a global response to DNA damage in eukaryotes. In similar manner, mice deficient in a key repair and transcription protein that unwinds DNA helices have premature onset of aging related diseases and consequent shortening of lifespan. However, not every DNA repair deficiency creates exactly the predicted effects; mice deficient in the NER pathway exhibited shortened life span without correspondingly higher rates of mutation. The maximum life spans of mice, naked mole rats and humans are respectively ~3, ~30 and ~129 years. Of these, the shortest lived species, mouse, expresses DNA repair genes, including core genes in several DNA repair pathways, at a lower level than do humans and naked mole rats.

Долговечность и ограничение калорий

Было выявлено, что ряд отдельных генов влияет на вариации продолжительности жизни в популяции организмов. Эффект этих генов сильно зависит от окружающей среды, в частности, от диеты организма. Ограничение калорийности воспроизводимо приводит к увеличению продолжительности жизни в различных организмах, вероятно, посредством путей восприятия питательных веществ и снижения скорости метаболизма. Молекулярные механизмы, посредством которых такое ограничение приводит к увеличению продолжительности жизни, пока неясны (см. обсуждение); однако поведение многих генов, известных своей ролью в репарации ДНК, изменяется в условиях ограничения калорий. Показано, что несколько веществ, обладающих антивозрастными свойствами, ослабляют конститутивный уровень mTOR-сигналинга, что является свидетельством снижения метаболической активности, и одновременно снижают конститутивный уровень повреждения ДНК, индуцированного эндогенно генерируемыми реактивными формами кислорода. Например, увеличение дозы гена SIR 2, который регулирует упаковку ДНК у нематоды Caenorhabditis elegans, может значительно продлить продолжительность жизни. Млекопитающий гомолог SIR 2 известен своей способностью индуцировать факторы репарации ДНК, участвующие в NHEJ, активность которой особенно усиливается в условиях ограничения калорий. Ограничение калорийности тесно связано со скоростью эксцизионной репарации оснований в ядерной ДНК грызунов, хотя аналогичные эффекты не наблюдались в митохондриальной ДНК. Ген AGE 1 у C. elegans, восходящий регулятор путей репарации ДНК, значительно увеличивает продолжительность жизни в условиях свободного кормления, но приводит к снижению репродуктивной приспособленности в условиях ограничения калорий. Это наблюдение подтверждает теорию плейотропии биологического происхождения старения, которая предполагает, что гены, обеспечивающие значительное преимущество в выживании на ранних этапах жизни, будут отбираться, даже если они несут соответствующий недостаток в позднем возрасте.

Рак

Из-за присущих ограничений в механизмах восстановления ДНК, если бы люди жили достаточно долго, у всех них в конечном итоге развился бы рак. Существует по крайней мере 34 унаследованных мутации генов, участвующих в восстановлении ДНК человека, которые повышают риск развития рака. Многие из этих мутаций приводят к тому, что восстановление ДНК становится менее эффективным, чем обычно. В частности, наследственный неполипозный колоректальный рак (HNPCC) тесно связан со специфическими мутациями в пути восстановления неспаренных оснований ДНК. BRCA1 и BRCA2, два важных гена, мутации в которых значительно повышают риск развития рака молочной железы у носителей, связаны с большим количеством путей восстановления ДНК, особенно с NHEJ и гомологичной рекомбинацией. Методы лечения рака, такие как химиотерапия и лучевая терапия, действуют, подавляя способность клетки восстанавливать повреждения ДНК, что приводит к гибели клеток. Клетки, которые наиболее быстро делятся – как правило, раковые клетки – поражаются в первую очередь. Побочным эффектом является то, что другие, нераковые, но быстро делящиеся клетки, такие как прогениторные клетки кишечника, кожи и кроветворной системы, также страдают. Современные методы лечения рака стремятся локализовать повреждение ДНК в клетках и тканях, связанных только с раком, либо физическими средствами (концентрируя терапевтический агент в области опухоли), либо биохимическими средствами (используя особенности, уникальные для раковых клеток в организме). В контексте терапии, направленной на гены, отвечающие за реакцию на повреждение ДНК, последний подход был назван «синтетической летальностью». Вероятно, наиболее известным препаратом, использующим принцип «синтетической летальности», является ингибитор поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 (PARP1) олапариб, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в 2015 году для лечения женщин с BRCA-дефектным раком яичников. Опухолевые клетки с частичной потерей функции ответа на повреждение ДНК (в частности, гомологичного восстановления) зависят от другого механизма – восстановления одноцепочечных разрывов, который частично состоит из продукта гена PARP1. Олапариб комбинируют с химиотерапевтическими препаратами для ингибирования восстановления одноцепочечных разрывов, вызванного повреждением ДНК, индуцированным сопутствующей химиотерапией. Опухолевые клетки, полагающиеся на этот механизм восстановления остаточного ДНК, не могут восстановить повреждение и, следовательно, не могут выжить и пролиферировать, в то время как нормальные клетки могут восстановить повреждение с помощью функционирующего механизма гомологичной рекомбинации. В настоящее время исследуется множество других препаратов для воздействия на другие механизмы восстановления остаточного ДНК, часто встречающиеся при раке. Однако терапевтические подходы, основанные на принципе синтетической летальности, подвергаются сомнению из-за появляющихся данных о приобретенной устойчивости, достигаемой путем перестройки путей ответа на повреждение ДНК и восстановления ранее ингибированных дефектов.

Because of inherent limitations in the DNA repair mechanisms, if humans lived long enough, they would all eventually develop cancer. There are at least 34 Inherited human DNA repair gene mutations that increase cancer risk. Many of these mutations cause DNA repair to be less effective than normal. In particular, Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) is strongly associated with specific mutations in the DNA mismatch repair pathway. BRCA1 and BRCA2, two important genes whose mutations confer a hugely increased risk of breast cancer on carriers, are both associated with a large number of DNA repair pathways, especially NHEJ and homologous recombination. Cancer therapy procedures such as chemotherapy and radiotherapy work by overwhelming the capacity of the cell to repair DNA damage, resulting in cell death. Cells that are most rapidly dividing – most typically cancer cells – are preferentially affected. The side effect is that other non cancerous but rapidly dividing cells such as progenitor cells in the gut, skin, and hematopoietic system are also affected. Modern cancer treatments attempt to localize the DNA damage to cells and tissues only associated with cancer, either by physical means (concentrating the therapeutic agent in the region of the tumor) or by biochemical means (exploiting a feature unique to cancer cells in the body). In the context of therapies targeting DNA damage response genes, the latter approach has been termed 'synthetic lethality'. Perhaps the most well known of these 'synthetic lethality' drugs is the poly(ADP ribose) polymerase 1 (PARP1) inhibitor olaparib, which was approved by the Food and Drug Administration in 2015 for the treatment in women of BRCA defective ovarian cancer. Tumor cells with partial loss of DNA damage response (specifically, homologous recombination repair) are dependent on another mechanism – single strand break repair – which is a mechanism consisting, in part, of the PARP1 gene product. Olaparib is combined with chemotherapeutics to inhibit single strand break repair induced by DNA damage caused by the co administered chemotherapy. Tumor cells relying on this residual DNA repair mechanism are unable to repair the damage and hence are not able to survive and proliferate, whereas normal cells can repair the damage with the functioning homologous recombination mechanism. Many other drugs for use against other residual DNA repair mechanisms commonly found in cancer are currently under investigation. However, synthetic lethality therapeutic approaches have been questioned due to emerging evidence of acquired resistance, achieved through rewiring of DNA damage response pathways and reversion of previously inhibited defects.

Дефекты эпигенетического восстановления ДНК при раке

Классически рак рассматривался как группа заболеваний, обусловленных прогрессирующими генетическими аномалиями, включая мутации в генах-супрессорах опухолей и онкогенах, а также хромосомные аберрации. Однако стало очевидно, что рак также обусловлен эпигенетическими изменениями. Эпигенетические изменения – это функционально значимые модификации генома, не сопровождающиеся изменением нуклеотидной последовательности. Примерами таких модификаций являются изменения в метилировании ДНК (гиперметилирование и гипометилирование) и модификации гистонов, изменения в хромосомной архитектуре (вызванные неадекватной экспрессией белков, таких как HMGA2 или HMGA1) и изменения, вызванные микроРНК. Каждое из этих эпигенетических изменений регулирует экспрессию генов, не изменяя при этом основную последовательность ДНК. Эти изменения обычно сохраняются при клеточном делении, передаются на протяжении нескольких поколений клеток и могут рассматриваться как эпимутации (эквивалентные мутациям). Хотя в раковых клетках обнаруживается большое количество эпигенетических изменений, особенно важными представляются эпигенетические изменения в генах репарации ДНК, приводящие к снижению экспрессии белков, участвующих в репарации ДНК. Считается, что такие изменения возникают на ранних этапах развития рака и являются вероятной причиной генетической нестабильности, характерной для рака. Снижение экспрессии генов репарации ДНК приводит к дефектам репарации ДНК. При дефектной репарации ДНК повреждения ДНК накапливаются в клетках в концентрациях выше обычного, что вызывает увеличение частоты мутаций или эпимутаций. Скорость мутаций существенно возрастает в клетках с дефектами в репарации неспаренных оснований ДНК или в гомологичной рекомбинационной репарации (HRR). Хромосомные перестройки и анеуплоидия также увеличиваются в клетках с дефектами HRR. Повышенный уровень повреждений ДНК не только увеличивает частоту мутаций, но и частоту эпимутаций. В процессе репарации разрывов двойной спирали ДНК или других повреждений ДНК неполное удаление участков репарации может приводить к эпигенетическому сайленсингу генов. Дефицит экспрессии белков репарации ДНК, вызванный унаследованной мутацией, может повысить риск развития рака. У людей с наследственным дефектом любого из 34 генов репарации ДНК (см. статью «Синдром дефицита репарации ДНК») повышен риск развития рака, при этом некоторые дефекты могут приводить к 100% вероятности развития рака в течение жизни (например, мутации p53). Однако такие мутации зародышевой линии (вызывающие высокопроникающие раковые синдромы) являются причиной лишь около 1 процента всех случаев рака.

Classically, cancer has been viewed as a set of diseases that are driven by progressive genetic abnormalities that include mutations in tumour suppressor genes and oncogenes, and chromosomal aberrations. However, it has become apparent that cancer is also driven by epigenetic alterations. Epigenetic alterations refer to functionally relevant modifications to the genome that do not involve a change in the nucleotide sequence. Examples of such modifications are changes in DNA methylation (hypermethylation and hypomethylation) and histone modification, changes in chromosomal architecture (caused by inappropriate expression of proteins such as HMGA2 or HMGA1) and changes caused by microRNAs. Each of these epigenetic alterations serves to regulate gene expression without altering the underlying DNA sequence. These changes usually remain through cell divisions, last for multiple cell generations, and can be considered to be epimutations (equivalent to mutations). While large numbers of epigenetic alterations are found in cancers, the epigenetic alterations in DNA repair genes, causing reduced expression of DNA repair proteins, appear to be particularly important. Such alterations are thought to occur early in progression to cancer and to be a likely cause of the genetic instability characteristic of cancers. Reduced expression of DNA repair genes causes deficient DNA repair. When DNA repair is deficient DNA damages remain in cells at a higher than usual level and these excess damages cause increased frequencies of mutation or epimutation. Mutation rates increase substantially in cells defective in DNA mismatch repair or in homologous recombinational repair (HRR). Chromosomal rearrangements and aneuploidy also increase in HRR defective cells. Higher levels of DNA damage not only cause increased mutation, but also cause increased epimutation. During repair of DNA double strand breaks, or repair of other DNA damages, incompletely cleared sites of repair can cause epigenetic gene silencing. Deficient expression of DNA repair proteins due to an inherited mutation can cause increased risk of cancer. Individuals with an inherited impairment in any of 34 DNA repair genes (see article DNA repair deficiency disorder) have an increased risk of cancer, with some defects causing up to a 100% lifetime chance of cancer (e. g. p53 mutations). However, such germline mutations (which cause highly penetrant cancer syndromes) are the cause of only about 1 percent of cancers.

Частота эпимутаций в генах по ремонту ДНК

Дефицит ферментов репарации ДНК иногда обусловлен вновь возникшей соматической мутацией в гене репарации ДНК, но гораздо чаще – эпигенетическими изменениями, снижающими или подавляющими экспрессию генов репарации ДНК. Например, при секвенировании 113 случаев колоректального рака, у четырех была обнаружена миссенс-мутация в гене репарации ДНК MGMT, в то время как у большинства наблюдалось снижение экспрессии MGMT из-за метилирования промоторной области MGMT (эпигенетическое изменение). Пять различных исследований показали, что снижение экспрессии MGMT из-за метилирования промоторной области MGMT наблюдается от 40% до 90% случаев колоректального рака. Аналогично, из 119 случаев колоректального рака с дефицитом репарации неспаренных оснований, у которых отсутствовала экспрессия гена репарации ДНК PMS2, у шести дефицит PMS2 был вызван мутациями в гене PMS2, а в 103 случаях дефицит экспрессии PMS2 был обусловлен подавлением его парного партнера MLH1 из-за метилирования промотора (белок PMS2 нестабилен в отсутствие MLH1). В остальных 10 случаях потеря экспрессии PMS2, вероятно, была вызвана эпигенетической переэкспрессией микроРНК miR155, которая снижает регуляцию MLH1. В качестве другого примера, эпигенетические дефекты были обнаружены при различных видах рака (например, раке молочной железы, яичников, колоректальном раке и раке головы и шеи). У большинства из 49 случаев рака толстой кишки, оцененных Facista et al., одновременно наблюдались два или три дефицита экспрессии ERCC1, XPF или PMS2. В таблице в этом разделе представлены некоторые частые агенты, повреждающие ДНК, примеры повреждений ДНК, которые они вызывают, и пути, которые справляются с этими повреждениями ДНК. По крайней мере 169 ферментов либо непосредственно участвуют в репарации ДНК, либо влияют на процессы репарации ДНК. Из них 83 непосредственно участвуют в репарации 5 типов повреждений ДНК, проиллюстрированных на диаграмме. На диаграмме показаны некоторые из наиболее изученных генов, играющих центральную роль в этих процессах репарации. Обозначения генов, выделенные красным, серым или голубым цветом, указывают на гены, часто подвергающиеся эпигенетическим изменениям при различных типах рака. Статьи Википедии по каждому из генов, выделенных красным, серым или голубым цветом, описывают эпигенетические изменения и рак, в которых обнаружены эти эпимутации. Обзорные статьи и масштабные экспериментальные исследования также документируют большинство этих эпигенетических дефектов репарации ДНК при раке. Гены, выделенные красным цветом, часто снижаются или замалчиваются эпигенетическими механизмами при различных видах рака. При низкой или отсутствующей экспрессии этих генов повреждения ДНК могут накапливаться. Ошибки репликации, возникающие на этих повреждениях (см. транслезионный синтез), могут привести к увеличению числа мутаций и, в конечном итоге, к раку. Эпигенетическое подавление генов репарации ДНК в точных путях репарации ДНК, по-видимому, играет центральную роль в канцерогенезе. Два гена, RAD51 и BRCA2, выделенные серым цветом, необходимы для гомологичной рекомбинационной репарации. Они иногда эпигенетически переэкспрессируются, а иногда недоэкспрессируются при определенных видах рака. Как указано в статьях Википедии о RAD51 и BRCA2, такие раковые заболевания обычно имеют эпигенетические дефициты в других генах репарации ДНК. Эти дефициты репарации, вероятно, вызывают увеличение числа непоправленных повреждений ДНК. Переэкспрессия RAD51 и BRCA2, наблюдаемая при этих раковых заболеваниях, может отражать селективное давление для компенсаторной переэкспрессии RAD51 или BRCA2 и увеличения гомологичной рекомбинационной репарации, чтобы хотя бы частично справиться с избытком повреждений ДНК. В тех случаях, когда RAD51 или BRCA2 недоэкспрессируются, это само по себе приведет к увеличению числа непоправленных повреждений ДНК. Ошибки репликации, возникающие на этих повреждениях (см. транслезионный синтез), могут вызвать увеличение числа мутаций и рака, поэтому недоэкспрессия RAD51 или BRCA2 сама по себе будет канцерогенной. Гены, выделенные голубым цветом, участвуют в пути соединения концов, опосредованном микрогомологией (MMEJ), и регулируются при раке. MMEJ – это дополнительный, склонный к ошибкам, неточный путь репарации двухцепочечных разрывов. При репарации двухцепочечного разрыва MMEJ для выравнивания цепей достаточно гомологии 5–25 комплементарных пар оснований между двумя спаренными цепями, но обычно присутствуют несовпадающие концы (выступы). MMEJ удаляет дополнительные нуклеотиды (выступы) в местах соединения цепей, а затем лигирует цепи для создания неповрежденной двойной спирали ДНК. MMEJ почти всегда включает в себя хотя бы небольшую делецию, поэтому это мутагенный путь. простата, желудок, нейробластомы, поджелудочная железа и легкие. PARP1 также переэкспрессируется при эпигенетическом гипометилировании ETS-сайта в его промоторной области, что способствует прогрессированию рака эндометрия и серозного рака яичников с мутациями в BRCA. Другие гены в пути MMEJ также переэкспрессируются при ряде видов рака (см. MMEJ для обзора) и также показаны голубым цветом.

Deficiencies in DNA repair enzymes are occasionally caused by a newly arising somatic mutation in a DNA repair gene, but are much more frequently caused by epigenetic alterations that reduce or silence expression of DNA repair genes. For example, when 113 colorectal cancers were examined in sequence, only four had a missense mutation in the DNA repair gene MGMT, while the majority had reduced MGMT expression due to methylation of the MGMT promoter region (an epigenetic alteration). Five different studies found that between 40% and 90% of colorectal cancers have reduced MGMT expression due to methylation of the MGMT promoter region. Similarly, out of 119 cases of mismatch repair deficient colorectal cancers that lacked DNA repair gene PMS2 expression, PMS2 was deficient in 6 due to mutations in the PMS2 gene, while in 103 cases PMS2 expression was deficient because its pairing partner MLH1 was repressed due to promoter methylation (PMS2 protein is unstable in the absence of MLH1). In the other 10 cases, loss of PMS2 expression was likely due to epigenetic overexpression of the microRNA, miR 155, which down regulates MLH1. In a further example, epigenetic defects were found in various cancers (e. g. breast, ovarian, colorectal and head and neck). Two or three deficiencies in the expression of ERCC1, XPF or PMS2 occur simultaneously in the majority of 49 colon cancers evaluated by Facista et al. The chart in this section shows some frequent DNA damaging agents, examples of DNA lesions they cause, and the pathways that deal with these DNA damages. At least 169 enzymes are either directly employed in DNA repair or influence DNA repair processes. Of these, 83 are directly employed in repairing the 5 types of DNA damages illustrated in the chart. Some of the more well studied genes central to these repair processes are shown in the chart. The gene designations shown in red, gray or cyan indicate genes frequently epigenetically altered in various types of cancers. Wikipedia articles on each of the genes highlighted by red, gray or cyan describe the epigenetic alteration(s) and the cancer(s) in which these epimutations are found. Review articles, and broad experimental survey articles also document most of these epigenetic DNA repair deficiencies in cancers. Red highlighted genes are frequently reduced or silenced by epigenetic mechanisms in various cancers. When these genes have low or absent expression, DNA damages can accumulate. Replication errors past these damages (see translesion synthesis) can lead to increased mutations and, ultimately, cancer. Epigenetic repression of DNA repair genes in accurate DNA repair pathways appear to be central to carcinogenesis. The two gray highlighted genes RAD51 and BRCA2, are required for homologous recombinational repair. They are sometimes epigenetically over expressed and sometimes under expressed in certain cancers. As indicated in the Wikipedia articles on RAD51 and BRCA2, such cancers ordinarily have epigenetic deficiencies in other DNA repair genes. These repair deficiencies would likely cause increased unrepaired DNA damages. The over expression of RAD51 and BRCA2 seen in these cancers may reflect selective pressures for compensatory RAD51 or BRCA2 over expression and increased homologous recombinational repair to at least partially deal with such excess DNA damages. In those cases where RAD51 or BRCA2 are under expressed, this would itself lead to increased unrepaired DNA damages. Replication errors past these damages (see translesion synthesis) could cause increased mutations and cancer, so that under expression of RAD51 or BRCA2 would be carcinogenic in itself. Cyan highlighted genes are in the microhomology mediated end joining (MMEJ) pathway and are up regulated in cancer. MMEJ is an additional error prone inaccurate repair pathway for double strand breaks. In MMEJ repair of a double strand break, an homology of 5–25 complementary base pairs between both paired strands is sufficient to align the strands, but mismatched ends (flaps) are usually present. MMEJ removes the extra nucleotides (flaps) where strands are joined, and then ligates the strands to create an intact DNA double helix. MMEJ almost always involves at least a small deletion, so that it is a mutagenic pathway. prostate, stomach, neuroblastomas, pancreas, and lung. PARP1 is also over expressed when its promoter region ETS site is epigenetically hypomethylated, and this contributes to progression to endometrial cancer and BRCA mutated serous ovarian cancer. Other genes in the MMEJ pathway are also over expressed in a number of cancers (see MMEJ for summary), and are also shown in cyan.

Распределение восстановления ДНК в соматических клетках человека по всему геному

Дифференциальная активность путей репарации ДНК в различных регионах генома человека приводит к крайне неравномерному распределению мутаций в геномах опухолей. В частности, гены-богатые, ранне реплицирующиеся области генома человека демонстрируют более низкую частоту мутаций, чем гены-бедные, поздне реплицирующийся гетерохроматин. Один из механизмов, лежащих в основе этого, связан с модификацией гистона H3K36me3, которая способна рекрутировать белки репарации неспаренных оснований, тем самым снижая частоту мутаций в регионах, меченных H3K36me3. Другой важный механизм касается нуклеотидной эксцизионной репарации, которая может быть активирована транскрипционным аппаратом, снижая частоту соматических мутаций в активных генах.

Эпигенетические изменения, вызванные восстановлением ДНК

Повреждения ДНК очень распространены и постоянно подвергаются восстановлению. Эпигенетические изменения могут сопутствовать восстановлению ДНК при окислительных повреждениях или разрывах двойных нитей. В клетках человека окислительные повреждения ДНК происходят примерно 10 000 раз в день, а разрывы двойных нитей ДНК – от 10 до 50 раз за клеточный цикл в соматических реплицирующихся клетках (см. повреждение ДНК (естественное)). Селективное преимущество восстановления ДНК заключается в обеспечении выживания клетки в условиях повреждения ДНК. Селективное преимущество эпигенетических изменений, возникающих в процессе восстановления ДНК, остается неясным.

Ремонт окислительного повреждения ДНК может изменить эпигенетические маркеры

В устойчивом состоянии (при возникновении и восстановлении эндогенных повреждений) в ДНК средней клетки млекопитающего содержится около 2400 окислительно поврежденных гуанинов, образующих 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG). 8-OHdG составляет около 5% от общего количества окислительных повреждений, обычно присутствующих в ДНК. Окисленные гуанины не распределены случайным образом среди всех гуанинов в ДНК. Существует предпочтение последовательности для гуанина в метилированном CpG-сайте (цитозин, за которым следует гуанин в направлении 5' → 3', где цитозин метилирован – 5mCpG). CpG-сайт с 5mC имеет наименьший потенциал ионизации для окисления гуанина. Окисленный гуанин обладает потенциалом к неправильному спариванию и является мутагенным. Оксигуанин-гликозилаза (OGG1) является основным ферментом, ответственным за удаление окисленного гуанина в процессе репарации ДНК. OGG1 обнаруживает и связывается с 8-OHdG в течение нескольких секунд. Однако OGG1 не удаляет 8-OHdG немедленно. В клетках HeLa полумаксимальное удаление 8-OHdG происходит через 30 минут, а у облученных мышей 8-OHdG, индуцированные в печени мыши, удаляются с периодом полураспада 11 минут. В клетках, обработанных H2O2, был исследован один конкретный ген – BACE1. Это может привести к увеличению метилирования цитозинов (эпигенетические изменения) в этих участках. Цзян и соавторы обрабатывали клетки HEK 293 агентами, вызывающими окислительное повреждение ДНК (броматом калия (KBrO3) или хроматом калия (K2CrO4)). Репарация окислительного повреждения (BER) происходила с участием фермента полимеразы бета, локализующейся к окисленным гуанинам. Полимераза бета является основной человеческой полимеразой при короткопластырной BER окислительного повреждения ДНК. Цзян и соавторы. Во время гомологичной рекомбинационной репарации (HR) двухцепочечного разрыва участие DNMT1 приводит к тому, что две восстановленные цепи ДНК имеют разные уровни метилирования цитозинов. Одна цепь часто метилируется примерно в 21 сайте CpG ниже по течению от восстановленного двухцепочечного разрыва. Другая цепь ДНК теряет метилирование примерно в шести участках CpG, которые ранее были метилированы ниже по течению от разрыва двухцепочечной нити, а также теряет метилирование примерно в пяти участках CpG, которые ранее были метилированы выше по течению от разрыва двухцепочечной нити. При репликации хромосомы это приводит к образованию одной дочерней хромосомы, сильно метилированной ниже по течению от предыдущего места разрыва, и одной, которая не метилирована в области как выше, так и ниже по течению от предыдущего места разрыва. Что касается гена, поврежденного в результате двухцепочечного разрыва, половина потомственных клеток экспрессирует этот ген на высоком уровне, а в другой половине потомственных клеток экспрессия этого гена подавлена. Когда клоны этих клеток поддерживались в течение трех лет, новые паттерны метилирования сохранялись в течение этого периода времени. У мышей с CRISPR-опосредованной гомологичной рекомбинационной вставкой в их геноме наблюдалось большое количество повышенных метилирований CpG-сайтов в области двухцепочечного разрыва, связанного с вставкой.

In the steady state (with endogenous damages occurring and being repaired), there are about 2,400 oxidatively damaged guanines that form 8 oxo 2' deoxyguanosine (8 OHdG) in the average mammalian cell DNA. 8 OHdG constitutes about 5% of the oxidative damages commonly present in DNA. The oxidized guanines do not occur randomly among all guanines in DNA. There is a sequence preference for the guanine at a methylated CpG site (a cytosine followed by guanine along its 5' → 3' direction and where the cytosine is methylated (5 mCpG)). A 5 mCpG site has the lowest ionization potential for guanine oxidation. Oxidized guanine has mispairing potential and is mutagenic. Oxoguanine glycosylase (OGG1) is the primary enzyme responsible for the excision of the oxidized guanine during DNA repair. OGG1 finds and binds to an 8 OHdG within a few seconds. However, OGG1 does not immediately excise 8 OHdG. In HeLa cells half maximum removal of 8 OHdG occurs in 30 minutes, and in irradiated mice, the 8 OHdGs induced in the mouse liver are removed with a half life of 11 minutes. In cells treated with H2O2, one particular gene was examined, BACE1. This could cause increased methylation of cytosines (epigenetic alterations) at these locations. Jiang et al. treated HEK 293 cells with agents causing oxidative DNA damage, (potassium bromate (KBrO3) or potassium chromate (K2CrO4)). Base excision repair (BER) of oxidative damage occurred with the DNA repair enzyme polymerase beta localizing to oxidized guanines. Polymerase beta is the main human polymerase in short patch BER of oxidative DNA damage. Jiang et al. During homologous recombinational repair (HR) of the double strand break, the involvement of DNMT1 causes the two repaired strands of DNA to have different levels of methylated cytosines. One strand becomes frequently methylated at about 21 CpG sites downstream of the repaired double strand break. The other DNA strand loses methylation at about six CpG sites that were previously methylated downstream of the double strand break, as well as losing methylation at about five CpG sites that were previously methylated upstream of the double strand break. When the chromosome is replicated, this gives rise to one daughter chromosome that is heavily methylated downstream of the previous break site and one that is unmethylated in the region both upstream and downstream of the previous break site. With respect to the gene that was broken by the double strand break, half of the progeny cells express that gene at a high level and in the other half of the progeny cells expression of that gene is repressed. When clones of these cells were maintained for three years, the new methylation patterns were maintained over that time period. In mice with a CRISPR mediated homology directed recombination insertion in their genome there were a large number of increased methylations of CpG sites within the double strand break associated insertion.

Негомологичное окончание соединения может вызвать некоторые изменения эпигенетических маркеров

Ремонт негомологичного соединения концов (NHEJ) двойного разрыва нити может вызывать небольшое количество деметилирований уже существующих метилирований цитозина в ДНК ниже по течению от отремонтированного разрыва. Показано, что NHEJ двойного разрыва ДНК в клетке может приводить к появлению потомков клеток с подавленной экспрессией гена, содержащего исходный двойной разрыв, и потомков с высокой экспрессией этого гена вследствие эпигенетических изменений, связанных с репарацией NHEJ. Частота эпигенетических изменений, вызывающих подавление гена после репарации NHEJ двойного разрыва ДНК в этом гене, может составлять около 0,9%. Способность большого числа структурных мотивов белков катализировать соответствующие химические реакции сыграла значительную роль в развитии механизмов репарации в ходе эволюции. Для крайне подробного обзора гипотез, касающихся эволюции репарации ДНК, см. Палеонтологические данные свидетельствуют о том, что одноклеточная жизнь начала размножаться на планете в какой-то момент прекамбрийского периода, хотя точное время появления узнаваемой современной жизни остается неясным. Нуклеиновые кислоты стали единственным и универсальным средством кодирования генетической информации, что потребовало механизмов репарации ДНК, которые в своей базовой форме были унаследованы всеми существующими формами жизни от их общего предка. Появление на Земле богатой кислородом атмосферы (известной как "кислородная катастрофа") из-за фотосинтезирующих организмов, а также присутствие потенциально повреждающих свободных радикалов в клетке вследствие окислительного фосфорилирования, потребовало эволюции механизмов репарации ДНК, которые специфически противодействуют типам повреждений, вызванных окислительным стрессом. Однако механизм, посредством которого это произошло, остается неясным.

Скорость эволюционных изменений

В некоторых случаях повреждение ДНК не восстанавливается или восстанавливается с помощью механизма, склонного к ошибкам, что приводит к изменению исходной последовательности. Когда это происходит, мутации могут распространяться в геномы потомства клетки. Если такое событие происходит в клетке зародышевой линии, которая в конечном итоге образует гамету, мутация может передаваться потомству организма. Скорость эволюции у конкретного вида (или у конкретного гена) является функцией скорости мутаций. Следовательно, скорость и точность механизмов репарации ДНК влияют на процесс эволюционных изменений. Защита и репарация повреждений ДНК не влияют на скорость адаптации посредством регуляции генов, рекомбинации и отбора аллелей. С другой стороны, репарация и защита повреждений ДНК влияют на скорость накопления необратимых, выгодных, расширяющих генетический код, наследственных мутаций и замедляют эволюционный механизм расширения генома организмов с новыми функциями. Напряжение между способностью к эволюции и репарацией и защитой от мутаций требует дальнейшего изучения.

Технология

Технология, известная как кластерное регулярно интерпассированное короткое палиндромное повторение (сокращенно CRISPR Cas9), была открыта в 2012 году. Эта новая технология позволяет любому, обладающему знаниями в области молекулярной биологии, с высокой точностью изменять гены любого вида, вызывая повреждение ДНК в конкретной точке и затем изменяя механизмы репарации ДНК для вставки новых генов. Она дешевле, эффективнее и точнее других технологий. С помощью CRISPR–Cas9 ученые могут редактировать геном, удаляя, добавляя или изменяя фрагменты последовательности ДНК.