Рентгеновская микроскопия: принципы и развитие

Введение

Тип микроскопа, использующего рентгеновское излучение.

Рентгеновский микроскоп использует электромагнитное излучение в рентгеновском диапазоне для получения увеличенных изображений объектов. Поскольку рентгеновские лучи проникают сквозь большинство материалов, специальная подготовка образцов для рентгеновской микроскопии не требуется. В отличие от видимого света, рентгеновские лучи слабо отражаются и преломляются и невидимы для человеческого глаза. Поэтому рентгеновский микроскоп экспонирует пленку или использует детекторы с зарядовой связью (CCD) для регистрации рентгеновских лучей, прошедших через образец. Это технология контрастной визуализации, основанная на различии в поглощении мягкого рентгеновского излучения в области "водного окна" (длина волны: 2,34–4,4 нм, энергия: 280–530 эВ) атомами углерода (основной элемент, составляющий живые клетки) и кислорода (элемент воды). Микрофокусное рентгеновское излучение также позволяет достичь высокого увеличения методом проецирования. Микрофокусная рентгеновская трубка генерирует рентгеновские лучи из чрезвычайно малого фокуса (от 5 мкм до 0,1 мкм). Рентгеновское излучение находится в более традиционном диапазоне (20–300 кэВ) и не подвергается перефокусировке.

Изобретение и разработка

История рентгеновской микроскопии берет свое начало в начале 20-го века. После того как немецкий физик Рентген открыл рентгеновские лучи в 1895 году, ученые вскоре стали освещать объект точечным источником рентгеновского излучения и получать теневые изображения объекта с разрешением в несколько микрометров. В 1918 году Эйнштейн указал на то, что показатель преломления для рентгеновских лучей в большинстве сред должен быть лишь немного больше 1, что затрудняет использование преломляющих оптических элементов в рентгеновских приложениях. Ранние рентгеновские микроскопы, разработанные Полом Киркпатриком и Альбертом Баезом, использовали отражающую рентгеновскую оптику для фокусировки рентгеновских лучей, отражая их от параболически изогнутых зеркал под очень высоким углом падения. Альтернативным методом фокусировки рентгеновских лучей является использование крошечной пластины зоны Френеля, состоящей из концентрических колец из золота или никеля на подложке из диоксида кремния. Сэр Лоуренс Брэгг создал одни из первых полезных рентгеновских изображений с помощью своего аппарата в конце 1940-х годов. В 1950-х годах Стерлинг Ньюберри создал теневой рентгеновский микроскоп, в котором образец помещался между источником и мишенью, что стало основой для первых коммерческих рентгеновских микроскопов компании General Electric. После периода затишья в 1960-х годах, рентгеновская микроскопия вновь привлекла внимание в 1970-х годах. В 1972 году Горовиц и Хауэлл построили первый рентгеновский микроскоп на основе синхротрона в Кембриджском электронном ускорителе. Этот микроскоп сканировал образцы с помощью синхротронного излучения через крошечное отверстие и продемонстрировал возможности как просвечивающей, так и флуоресцентной микроскопии. Другие разработки этого периода включают первую голографическую демонстрацию, проведенную Садао Аоки и Сейси Кикута в Японии, первые TXM с использованием зональных пластин Шмалем и др., а также эксперименты Стони Брука в STXM. Использование источников синхротронного излучения открыло новые возможности для рентгеновской микроскопии в 1980-х годах. Однако, по мере создания новых микроскопов на основе синхротронных источников в различных группах, ученые осознали, что проведение таких экспериментов затруднено из-за недостаточного уровня технологической оснащенности того времени, включая низкое когерентное освещение, невысокое качество рентгеновских оптических элементов и неудобные для пользователя источники света. В 1990-х годах новые инструменты и источники света значительно ускорили развитие рентгеновской микроскопии. Успешно были продемонстрированы методы микроскопии, такие как томография, криомикроскопия и криотомография. Благодаря быстрому развитию, рентгеновская микроскопия нашла новые применения в почвоведении, геохимии, полимерных науках и магнетизме. Аппаратное обеспечение также было миниатюризировано, что позволило исследователям проводить эксперименты в собственных лабораториях. С расширением областей применения, рентгеновская микроскопия стала рутинной и проверенной техникой, используемой в науках об окружающей среде и почве, геохимии и космохимии, полимерных науках, биологии, магнетизме и материаловедении. В связи с растущим спросом на рентгеновскую микроскопию в этих областях, по всему миру строятся микроскопы на основе синхротронов, жидких металлических анодов и других лабораторных источников света. Рентгеновская оптика и ее компоненты также быстро коммерциализируются. В ALS также расположен первый в мире микроскоп мягкого рентгеновского излучения, предназначенный для биологических и биомедицинских исследований. Этот новый прибор, XM 2, был спроектирован и построен учеными из Национального центра рентгеновской томографии. XM 2 способен создавать трехмерные томограммы клеток.

The history of X ray microscopy can be traced back to the early 20th century. After the German physicist Röntgen discovered X rays in 1895, scientists soon illuminated an object using an X ray point source and captured the shadow images of the object with a resolution of several micrometers. In 1918, Einstein pointed out that the refractive index for X rays in most mediums should be just slightly greater than 1, which means that refractive optical parts would be difficult to use for X ray applications. Early X ray microscopes by Paul Kirkpatrick and Albert Baez used grazing incidence reflective X ray optics to focus the X rays, which grazed X rays off parabolic curved mirrors at a very high angle of incidence. An alternative method of focusing X rays is to use a tiny Fresnel zone plate of concentric gold or nickel rings on a silicon dioxide substrate. Sir Lawrence Bragg produced some of the first usable X ray images with his apparatus in the late 1940s. In the 1950s Sterling Newberry produced a shadow X ray microscope, which placed the specimen between the source and a target plate, this became the basis for the first commercial X ray microscopes from the General Electric Company. After a silent period in the 1960s, X ray microscopy regained people's attention in the 1970s. In 1972, Horowitz and Howell built the first synchrotron based X ray microscope at the Cambridge Electron Accelerator. This microscope scanned samples using synchrotron radiation from a tiny pinhole and showed the abilities of both transmission and fluorescence microscopy. Other developments in this period include the first holographic demonstration by Sadao Aoki and Seishi Kikuta in Japan, the first TXMs using zone plates by Schmahl et al., and Stony Brook's experiments in STXM. The uses of synchrotron light sources brought new possibilities for X ray microscopy in the 1980s. However, as new synchrotron source based microscopes were built in many groups, people realized that it was difficult to perform such experiments due to insufficient technological capabilities at that time, such as poor coherent illuminations, poor quality x ray optical elements, and user unfriendly light sources. Entering the 1990s, new instruments and new light sources greatly fueled the improvement of X ray microscopy. Microscopy methods including tomography, cryo , and cryo tomography were successfully demonstrated. With rapid development, X ray microscopy found new applications in soil science, geochemistry, polymer sciences, and magnetism. The hardware was also miniaturized, so that researchers could perform experiments in their own laboratories. With the applications continuing to grow, X ray microscopy has become a routine, proven technique used in environmental and soil sciences, geo and cosmo chemistry, polymer sciences, biology, magnetism, material sciences. With this increasing demand for X ray microscopy in these fields, microscopes based on synchrotron, liquid metal anode, and other laboratory light sources are being built around the world. X ray optics and components are also being commercialized rapidly. The ALS is also home to the world's first soft x ray microscope designed for biological and biomedical research. This new instrument, XM 2 was designed and built by scientists from the National Center for X ray Tomography. XM 2 is capable of producing 3 dimensional tomograms of cells.

Источник рентгеновского излучения с жидким металлическим анодом

Источники рентгеновского излучения с исключительно высокой интенсивностью 9,25 кэВ (линия галлия K-альфа) для рентгеновской фазово-контрастной микроскопии, с фокусным пятном размером около 10 мкм x 10 мкм, могут быть получены с помощью рентгеновского источника, использующего жидкий металлический анод из галинстана. Это было продемонстрировано в 2003 году.

Сканирование передачи

Источники мягкого рентгеновского излучения, пригодные для микроскопии, такие как источники синхротронного излучения, обладают относительно низкой яркостью на требуемых длинах волн, поэтому альтернативным методом формирования изображения является сканирующая просвечивающая мягкорентгеновская микроскопия. В этом методе рентгеновские лучи фокусируются в точку, а образец механически перемещается через сфокусированное пятно. В каждой точке прошедшие рентгеновские лучи регистрируются детектором, например, пропорциональным счетчиком или лавинным фотодиодом. Этот тип сканирующего просвечивающего рентгеновского микроскопа (STXM) был впервые разработан исследователями из Университета Стоуни-Брук и использовался в Национальном источнике синхротронного излучения при Национальной лаборатории Брукхейвена.

Резолюция

Разрешение рентгеновской микроскопии лежит между разрешением оптического и электронного микроскопов. Ее преимущество перед обычной электронной микроскопией заключается в возможности изучения биологических образцов в их естественном состоянии. Электронная микроскопия широко используется для получения изображений с разрешением от нанометров до долей ангстрема, но относительно толстую живую клетку невозможно наблюдать, так как образец необходимо химически фиксировать, обезвоживать, заключать в смолу и затем нарезать на ультратонкие срезы. Однако стоит отметить, что криоэлектронная микроскопия позволяет наблюдать биологические объекты в их гидратированном естественном состоянии, хотя и заключенными в водяной лёд. До настоящего времени, с помощью линзы Френеля, формирующей изображение с использованием мягкого рентгеновского излучения, получаемого от синхротрона, возможно достижение разрешения в 30 нанометров. В последнее время всё большую популярность приобретает использование мягкого рентгеновского излучения, генерируемого лазерной плазмой, вместо синхротронного излучения.

Анализ

Кроме того, рентгеновские лучи вызывают флуоресценцию в большинстве материалов, и эти излучения могут быть проанализированы для определения химического состава исследуемого объекта. Другое применение – получение дифракционных картин, процесс, используемый в рентгеновской кристаллографии. Анализируя внутренние отражения дифракционной картины (обычно с помощью компьютерной программы), можно определить трехмерную структуру кристалла вплоть до расположения отдельных атомов в его молекулах. Рентгеновские микроскопы иногда используются для этих анализов, поскольку образцы слишком малы для анализа другими методами.

Биологические применения

Одним из первых применений рентгеновской микроскопии в биологии была контактная визуализация, разработанная Гоби в 1913 году. В этой технике мягкие рентгеновские лучи облучают образец и экспонируют расположенные под ним рентгеночувствительные эмульсии. Затем, с помощью светового или электронного микроскопа регистрируются увеличенные томографические изображения эмульсий, соответствующие картам рентгеновской непрозрачности образца. Уникальным преимуществом рентгеновской контактной визуализации перед электронной микроскопией была возможность визуализации влажных биологических материалов. Благодаря этому она использовалась для изучения микро- и наноструктур растений, насекомых и клеток человека. Однако разрешение контактной визуализации ограничено рядом факторов, включая искажения эмульсии, неблагоприятные условия освещения и низкое разрешение методов анализа эмульсий. Повреждение эмульсий электронами и дифракционные эффекты также могут приводить к артефактам на итоговых изображениях. Рентгеновская микроскопия обладает уникальными преимуществами в отношении наноразрешения и высокой проникающей способности, которые важны для биологических исследований. Благодаря недавнему значительному прогрессу в инструментах и фокусировке, все три классические формы оптики – дифракционная, отражающая и преломляющая – успешно расширились в рентгеновский диапазон и применяются для изучения структур и динамики на клеточном и субклеточном уровнях. В 2005 году Шапиро и соавторы сообщили о клеточной визуализации дрожжей с разрешением 30 нм, используя когерентную дифракционную микроскопию мягкого рентгеновского излучения. В 2008 году была продемонстрирована рентгеновская визуализация не окрашенного вируса. Год спустя дифракция рентгеновских лучей была применена для визуализации трехмерной структуры не окрашенной человеческой хромосомы. Таким образом, рентгеновская микроскопия показала свою способность преодолевать дифракционный предел классических световых микроскопов; однако дальнейшее повышение разрешения ограничено размером пикселей детектора, оптическими приборами и размерами источника излучения. Давно существующей серьезной проблемой рентгеновской микроскопии является радиационное повреждение, поскольку высокоэнергетические рентгеновские лучи генерируют сильные радикалы и вызывают нежелательные реакции в влажных образцах. Поэтому биологические образцы обычно фиксируют или лиофилизируют перед облучением рентгеновскими лучами высокой мощности. Для сохранения целостности гидратированных структур также часто используются методы быстрой криообработки.

One early applications of X ray microscopy in biology was contact imaging, pioneered by Goby in 1913. In this technique, soft x rays irradiate a specimen and expose the x ray sensitive emulsions beneath it. Then, magnified tomographic images of the emulsions, which correspond to the x ray opacity maps of the specimen, are recorded using a light microscope or an electron microscope. A unique advantage that X ray contact imaging offered over electron microscopy was the ability to image wet biological materials. Thus, it was used to study the micro and nanoscale structures of plants, insects, and human cells. However, several factors, including emulsion distortions, poor illumination conditions, and low resolutions of ways to examine the emulsions, limit the resolution of contacting imaging. Electron damage of the emulsions and diffraction effects can also result in artifacts in the final images. X ray microscopy has its unique advantages in terms of nanoscale resolution and high penetration ability, both of which are needed in biological studies. With the recent significant progress in instruments and focusing, the three classic forms of optics—diffractive, reflective, refractive optics—have all successfully expanded into the X ray range and have been used to investigate the structures and dynamics at cellular and sub cellular scales. In 2005, Shapiro et al. reported cellular imaging of yeasts at a 30 nm resolution using coherent soft X ray diffraction microscopy. In 2008, X ray imaging of an unstained virus was demonstrated. A year later, X ray diffraction was further applied to visualize the three dimensional structure of an unstained human chromosome. X ray microscopy has thus shown its great ability to circumvent the diffractive limit of classic light microscopes; however, further enhancement of the resolution is limited by detector pixels, optical instruments, and source sizes. A longstanding major concern of X ray microscopy is radiation damage, as high energy X rays produce strong radicals and trigger harmful reactions in wet specimens. As a result, biological samples are usually fixated or freeze dried before being irradiated with high power X rays. Rapid cryo treatments are also commonly used in order to preserve intact hydrated structures.