Паркин: структура, функции и роль в патогенезе болезни Паркинсона.

Введение

Паркин – это E3 убиквитин-лигаза, состоящая из 465 аминокислотных остатков, белок, кодируемый геном PARK2 у человека и мыши. Паркин играет ключевую роль в убиквитинизации – процессе, при котором молекулы ковалентно маркируются убиквитином (Ub) и направляются на деградацию в протеасомах или лизосомах. Убиквитинизация включает последовательное действие трех ферментов. Сначала E1 убиквитин-активирующий фермент связывается с неактивным Ub в эукариотических клетках посредством тиоэфирной связи и мобилизует его в АТФ-зависимом процессе. Затем Ub переносится на E2 убиквитин-конъюгирующий фермент, после чего конъюгируется с белком-мишенью посредством E3 убиквитин-лигазы. Существует множество E3 лигаз, различающихся по структуре и специфичности к субстратам, что обеспечивает селективное нацеливание белков на внутриклеточную деградацию. В частности, паркин распознает белки на внешней мембране митохондрий при клеточном повреждении и опосредует удаление поврежденных митохондрий посредством аутофагии и протеасомальных механизмов. Паркин также усиливает выживаемость клеток, подавляя как митохондриально-зависимый, так и митохондриально-независимый апоптоз. Мутации, связанные с дисфункцией митохондрий, приводят к гибели нейронов при болезни Паркинсона и нарушению метаболизма при канцерогенезе.

Структура

Точная функция паркина неизвестна; однако, белок является компонентом мультипротеинового комплекса E3 убиквитин-лигазы, который, в свою очередь, входит в систему убиквитин-протеазомы, опосредующую таргетирование белков для деградации. Мутации в этом гене вызывают семейную форму болезни Паркинсона, известную как аутосомно-рецессивная ювенильная болезнь Паркинсона (AR JP). Кроме того, паркин необходим для митофагии (автофагии митохондрий). Однако, механизм, посредством которого потеря функции белка паркина приводит к гибели дофаминергических клеток при этом заболевании, неясен. Преобладающая гипотеза заключается в том, что паркин способствует деградации одного или нескольких белков, токсичных для дофаминергических нейронов. Предполагаемыми субстратами паркина являются синфилин 1, CDC rel1, циклин E, p38 тРНК-синтаза, Pael R, синаптотагмин XI, sp22 и сам паркин (см. также убиквитин-лигазу). Кроме того, паркин содержит C-концевой мотив, который связывает PDZ-домены. Показано, что паркин ассоциирует, зависимым от PDZ-доменов образом, с белками, содержащими PDZ-домены CASK и PICK1. Как и другие члены семейства E3-лигаз RING between RING (RBR), паркин обладает двумя RING-пальцевыми доменами и областью между RING (IBR). RING1 формирует сайт связывания для E2 убиквитин-конъюгирующего фермента, в то время как RING2 содержит каталитический остаток цистеина (Cys431), который отщепляет Ub от E2 и временно связывает его с E3 посредством тиоэфирной связи. Вместе они образуют каталитическую триаду, сборка которой необходима для активации паркина. Паркин также содержит N-концевой Ub-подобный домен (Ubl) для специфического распознавания субстрата, уникальный RING0-домен и репрессорную область (REP), которая тонически подавляет активность лигазы. В состоянии покоя плотно свернутая конформация паркина делает его неактивным, поскольку доступ к каталитическому остатку RING2 стерически заблокирован RING0, а E2-связывающий домен на RING1 окклюдирован Ubl и REP. Мутации Ser65Ala приводят к нарушению связывания Ub с паркином и препятствуют рекрутированию паркина к поврежденным митохондриям. PINK1 также фосфорилирует Ub в Ser65, ускоряя его высвобождение из E2 и повышая его аффинность к паркину. Учитывая, что RING0 уникален для паркина и что его гидрофобный интерфейс с RING1 скрывает Cys431 в неактивном паркине, митофагия представляет собой элиминацию поврежденных митохондрий в аутофагосомах и зависит от положительного цикла обратной связи, включающего синергическое действие паркина и PINK1. После сильного клеточного повреждения снижение потенциала митохондриальной мембраны препятствует импорту PINK1 в митохондриальный матрикс и приводит к его агрегации на внешней митохондриальной мембране (OMM). Паркин рекрутируется к митохондриям после деполяризации и фосфорилируется PINK1, который одновременно фосфорилирует Ub, предварительно конъюгированный с белками митохондриальной мембраны. Фосфорилирование PINK1 и Ub способствует активации паркина и дальнейшей сборке моно- и поли-Ub цепей. Однако при повреждении митохондрий необходима деградация белков деления для их отделения от сети посредством митохондриального деления и предотвращения повреждения здоровых митохондрий. Следовательно, паркин необходим перед митофагией, поскольку он убиквитинирует Mfn1/2, маркируя его для протеасомальной деградации. Протеомические исследования выявили дополнительные белки OMM в качестве субстратов паркина, включая белок деления FIS, его адаптер TBC1D15 и транслоказы TOMM20 и TOMM70, которые облегчают перемещение белков, таких как PINK1, через OMM. Miro (или RHOT1/RHOT2) является OMM-белком, критически важным для аксонального транспорта, и может быть убиквитинирован и направлен на протеасомальную деградацию паркином. Распад Miro привел к заметному снижению миграции поврежденных митохондрий вдоль аксонов нейронов гиппокампа мыши, что подчеркивает важность паркина в отделении дефектных митохондрий от их функционирующих аналогов и ограничении пространственного распространения митохондриальной дисфункции перед аутофагией. Во время митофагии паркин нацелен на VDAC1, анионный канал с управляемым напряжением, который претерпевает конформационное изменение при деполяризации митохондриальной мембраны, обнажая цитозольный домен для убиквитинирования, что подчеркивает критическую роль VDAC1 как селективного маркера митохондриального повреждения и инициатора митофагии. После конъюгации Ub паркин рекрутирует аутофагические рецепторы, такие как p62, TAX1BP1 и CALCOCO2, способствуя сборке аутофагосом, которые переваривают дефектные митохондрии. Повышенная трансляция OPA1 поддерживает структуру крист и снижает высвобождение цитохрома C из митохондрий, ингибируя каспаза-опосредованный апоптоз. Важно отметить, что паркин активирует HOIP с большей эффективностью, чем другие факторы, связанные с LUBAC, HOIL 1 и sharpin, что означает, что мобилизация паркина значительно повышает устойчивость к умеренным стрессорам. Паркин обладает аффинностью к связыванию ДНК и вызывает дозозависимое снижение транскрипции и активности проапоптотического фактора p53. Трансфекция промотора p53 усеченными версиями паркина в нейроны SH SY5Y показала, что паркин напрямую связывается с промотором p53 через свой RING1-домен. И наоборот, паркин может быть транскрипционной мишенью p53 в клетках легких H460, где он опосредует опухолеподавляющее действие p53. Паркин также повышает уровень цитозольного глутатиона и защищает от окислительного стресса, характеризуя его как критически важный супрессор опухолей с антигликолитическими и антиоксидантными свойствами. У пациентов с аутосомно-рецессивным семейным анамнезом паркинсонизма гораздо выше вероятность наличия мутаций паркина, если возраст начала заболевания менее 20 лет (80% против 28% при начале заболевания старше 40 лет). У пациентов с мутациями паркина (PARK2) отсутствуют тельца Леви. У таких пациентов развивается синдром, который тесно напоминает спорадическую форму PD; однако, они, как правило, начинают проявлять симптомы в гораздо более молодом возрасте. У людей мутации, нарушающие функцию паркина в гене PARK2, были связаны с 50% наследственных и 15% случаев спорадической ювенильной формы болезни Паркинсона (PD). Однако, его симптомы напоминают симптомы идиопатической PD, с такими проявлениями, как тремор покоя, постуральная неустойчивость и брадикинезия, в то время как делеции в митохондриальном геноме были обнаружены в SNpc. В соответствии с его критической ролью в контроле качества митохондрий, более 120 патогенных, индуцирующих PD мутаций были охарактеризованы в паркине. Наконец, мутации Cys431Phe и Gly430Asp нарушают активность лигазы в каталитическом центре и значительно снижают функцию паркина. Паркин может способствовать агрегации альфа-синуклеина и синфилина 1 в тельца Леви, которые конъюгируются с поли-Ub цепями, связанными с Lys63, и направляются к аутофагической деградации. Мутации паркина, следовательно, ингибируют этот механизм, приводя к токсичному накоплению растворимых белков, которые перегружают протеасому. Агрегация белков вызывает нейротоксичность, что объясняет отсутствие убиквитинированных телец Леви при PD с мутациями паркина. Аналогично, нативный паркин снижает гибель нейронов SH SY5Y путем убиквитинирования других компонентов телец Леви, таких как p38-субъединица комплекса аминоацил-тРНК-синтазы и белок, связывающийся с дальним восходящим элементом 1, посредством добавления поли-Ub цепей, связанных с Lys48, и направления их к протеасомальной деградации. Паркин также влияет на аксональный транспорт и слияние везикул посредством убиквитинирования тубулина и синаптотагмина XI (SYT11) соответственно, придавая ему модулирующую роль в функции синапсов. У пациентов с PD с мутациями паркина также наблюдается четырехкратное повышение иммунореактивности p53, а дефицит паркина еще больше сократил выживаемость без заболеваний у мышей, подвергшихся инфракрасному облучению, не увеличивая частоту возникновения опухолей, что позволяет предположить, что дефицит паркина повышает восприимчивость к событиям, способствующим развитию опухолей, а не инициирует образование опухолей. Недостаточная экспрессия PARK2, обусловленная снижением числа копий или гиперметилированием ДНК, была дополнительно обнаружена при спонтанном раке толстой кишки, где она ускоряла все стадии развития аденомы кишечника в моделях мышей. Следовательно, паркин является мощным модулятором опухоле...

The precise function of parkin is unknown; however, the protein is a component of a multiprotein E3 ubiquitin ligase complex which in turn is part of the ubiquitin proteasome system that mediates the targeting of proteins for degradation. Mutations in this gene are known to cause a familial form of Parkinson's disease known as autosomal recessive juvenile Parkinson's disease (AR JP). Moreover, parkin is described to be necessary for mitophagy (autophagy of mitochondria). However, how loss of function of the parkin protein leads to dopaminergic cell death in this disease is unclear. The prevailing hypothesis is that parkin helps degrade one or more proteins toxic to dopaminergic neurons. Putative substrates of parkin include synphilin 1, CDC rel1, cyclin E, p38 tRNA synthase, Pael R, synaptotagmin XI, sp22 and parkin itself (see also ubiquitin ligase). Additionally, parkin contains a C terminal motif that binds PDZ domains. Parkin has been shown to associate in a PDZ dependent manner with the PDZ domain containing proteins CASK and PICK1. Like other members of the RING between RING (RBR) family of E3 ligases, parkin possesses two RING finger domains and an in between RING (IBR) region. RING1 forms the binding site for E2 Ub conjugating enzyme while RING2 contains the catalytic cysteine residue (Cys431) that cleaves Ub off E2 and transiently binds it to E3 via a thioester bond. Together these form the catalytic triad, whose assembly is required for parkin activation. Parkin also contains an N terminal Ub like domain (Ubl) for specific substrate recognition, a unique RING0 domain and a repressor (REP) region that tonically suppresses ligase activity. Under resting conditions, the tightly coiled conformation of parkin renders it inactive, as access to the catalytic RING2 residue is sterically blocked by RING0, while the E2 binding domain on RING1 is occluded by Ubl and REP. Ser65Ala missense mutations were found to ablate Ub parkin binding whilst inhibiting parkin recruitment to damaged mitochondria. PINK1 also phosphorylates Ub at Ser65, accelerating its discharge from E2 and enhancing its affinity for parkin. Considering that RING0 is unique to parkin and that its hydrophobic interface with RING1 buries Cys431 in inactive parkin, Mitophagy is the elimination of damaged mitochondria in autophagosomes, and is dependent on a positive feedback cycle involving synergistic action of parkin and PINK1. Following severe cellular insult, rundown of mitochondrial membrane potential prevents import of PINK1 into the mitochondrial matrix and causes it to aggregate on the outer mitochondrial membrane (OMM). Parkin is recruited to mitochondria following depolarisation and phosphorylated by PINK1, which simultaneously phosphorylates Ub pre conjugated to mitochondrial membrane proteins. PINK1 and Ub phosphorylation facilitate parkin activation and further assembly of mono and poly Ub chains. However, upon mitochondrial damage, degradation of fusion proteins is necessary to separate them from the network via mitochondrial fission and prevent the corruption of healthy mitochondria. Parkin is therefore required before mitophagy as it ubiquinates Mfn1/2, labelling it for proteasomal degradation. Proteomic studies identified additional OMM proteins as parkin substrates, including fission protein FIS, its adaptor TBC1D15 and translocase TOMM20 and TOMM70 that facilitate movement of proteins such as PINK1 across OMM. Miro (or RHOT1/RHOT2) is an OMM protein critical for axonal transport, and may be ubiquitinated and targeted towards proteasomal degradation by parkin. Miro breakdown produced a marked decrease in migration of compromised mitochondria along axons of mouse hippocampal neurons, reinforcing the importance of parkin in segregating defective mitochondria from their functioning counterparts and limiting the spatial spread of mitochondrial dysfunction, prior to autophagy. During mitophagy, parkin targets VDAC1, a voltage gated anion channel that undergoes a conformational change upon mitochondrial membrane depolarisation, exposing a cytosolic domain for ubiquitination. highlighting the critical role of VDAC1 as a selective marker of mitochondrial damage and instigator of mitophagy. Following Ub conjugation, parkin recruits autophagy receptors such as p62, TAX1BP1 and CALCOCO2, facilitating assembly of autophagosomes that digest defective mitochondria. Increased OPA1 translation maintains cristae structure and reduces cytochrome C release from mitochondria, inhibiting caspase mediated apoptosis. Importantly, parkin activates HOIP with greater potency than other LUBAC associated factors HOIL 1 and sharpin, meaning that parkin mobilisation significantly enhances tolerance to moderate stressors. Parkin possesses DNA binding affinity and produces a dose dependent reduction in transcription and activity of pro apoptotic factor p53. Transfection of p53 promoter with truncated versions of parkin into SH SY5Y neurons revealed that parkin directly binds to the p53 promoter via its RING1 domain. Conversely, parkin may be a transcriptional target of p53 in H460 lung cells, where it mediates the tumour suppressor action of p53. Parkin further elevates cytosolic glutathione levels and protects against oxidative stress, characterising it as a critical tumour suppressor with anti glycolytic and antioxidant capabilities. Patients with an autosomal recessive family history of parkinsonism are much more likely to carry parkin mutations if age at onset is less than 20 (80% vs. 28% with onset over age 40). Patients with parkin mutations (PARK2) do not have Lewy bodies. Such patients develop a syndrome that closely resembles the sporadic form of PD; however, they tend to develop symptoms at a much younger age. In humans, loss of function mutations in parkin PARK2 gene have been implicated in 50% of inherited and 15% of juvenile onset sporadic forms of Parkinson's disease (PD). However, its symptoms resembles those of idiopathic PD, with patients presenting with resting tremors, postural instability and bradykinesia. while deletions in the mitochondrial genome were found in the SNpc. In accordance with its critical role in mitochondrial quality control, more than 120 pathogenic, PD inducing mutations have been characterised on parkin. Finally, Cys431Phe and Gly430Asp mutations impair ligase activity at the catalytic site and significantly reduce parkin function. Parkin might promote aggregation of alpha synuclein and synphilin 1 into Lewy bodies, which are conjugated to Lys63 linked poly Ub chains and directed towards autophagic degradation. Parkin mutations therefore inhibit this mechanism, leading to toxic accumulation of soluble proteins that overloads the proteasome. Protein aggregation triggers neuronal toxicity, whilst accounting for lack of ubiquitinated Lewy bodies in parkin mutant PD. Similarly, native parkin reduces death of SH SY5Y neurons by ubiquitinating other Lewy body constituents, such as the p38 subunit of aminoacyl tRNA synthetase complex and far upstream element binding protein 1 through addition of Lys48 linked poly Ub chains and directing them towards proteasomal degradation. Parkin also influences axonal transport and vesicle fusion through ubiquitination of tubulin and synaptotagmin XI (SYT11) respectively, giving it a modulatory role in synapse function. Parkin mutant PD patients also exhibit a four fold elevation in p53 immunoreactivity, Parkin deficiency further diminished disease free survival in infrared irradiated mice without increasing tumour incidence rate, suggesting that parkin deficiencies increase susceptibility to tumour promoting events, rather than initiating tumour formation. Haploinsufficient PARK2 expression, either due to reduced copy number or DNA hypermethylation, was further detected in spontaneous colorectal cancer where it accelerated all stages of intestinal adenoma development in mouse models. Parkin is therefore a potent modulator of tumour progression, without directly instigating tumourigenesis.