Введение
Энзим ДНК-гираза, или просто гираза, является ферментом класса топоизомераз и относится к подклассу топоизомераз II типа, который снижает топологическое напряжение, используя энергию АТФ, в процессе раскручивания двухцепочечной ДНК, осуществляемого удлиняющейся РНК-полимеразой или геликазой перед движущейся репликационной вилкой. Это единственный известный фермент, активно способствующий образованию отрицательного суперзакручивания ДНК, а также способный расслаблять положительные суперзакрутки. Он осуществляет это, образуя петлю из матрицы для создания перекреста, затем разрезая одну из двойных спиралей и пропуская другую через разрез, после чего соединяет концы, изменяя число сцеплений на два в каждом ферментативном цикле. Этот процесс происходит в бактериях, где единственная кольцевая ДНК разрезается ДНК-гиразой, а затем два конца скручиваются друг вокруг друга, формируя суперзакрутки. Гираза также обнаружена в пластидах эукариотических клеток: она найдена в апикопласте малярийного паразита Plasmodium falciparum и в хлоропластах различных растений. Бактериальная ДНК-гираза является мишенью для многих антибиотиков, включая налидиксическую кислоту, новобиоцин, альбицидин и ципрофлоксацин. Уникальная способность гиразы вводить отрицательные суперзакрутки в ДНК за счет гидролиза АТФ. Структурно комплекс состоит из трех пар "ворот", последовательное открытие и закрытие которых обеспечивает прямой перенос сегмента ДНК и введение двух отрицательных суперзакруток. N-ворота формируются АТФазными доменами субъединиц GyrB. Связывание двух молекул АТФ приводит к димеризации и, следовательно, к закрытию ворот. Гидролиз, напротив, открывает их. Разрыв и воссоединение ДНК осуществляются каталитическим центром, расположенным в ДНК-воротах, образованных всеми субъединицами гиразы. С-ворота формируются субъединицами GyrA.
DNA gyrase, or simply gyrase, is an enzyme within the class of topoisomerase and is a subclass of Type II topoisomerases that reduces topological strain in an ATP dependent manner while double stranded DNA is being unwound by elongating RNA polymerase or by helicase in front of the progressing replication fork. It is the only known enzyme to actively contribute negative supercoiling to DNA, while it also is capable of relaxing positive supercoils. It does so by looping the template to form a crossing, then cutting one of the double helices and passing the other through it before releasing the break, changing the linking number by two in each enzymatic step. This process occurs in bacteria, whose single circular DNA is cut by DNA gyrase and the two ends are then twisted around each other to form supercoils. Gyrase is also found in eukaryotic plastids: it has been found in the apicoplast of the malarial parasite Plasmodium falciparum and in chloroplasts of several plants. Bacterial DNA gyrase is the target of many antibiotics, including nalidixic acid, novobiocin, albicidin, and ciprofloxacin. The unique ability of gyrase to introduce negative supercoils into DNA at the expense of ATP hydrolysis Structurally the complex is formed by 3 pairs of "gates", sequential opening and closing of which results into the direct transfer of DNA segment and introduction of 2 negative supercoils. N gates are formed by ATPase domains of GyrB subunits. Binding of 2 ATP molecules leads to dimerization and, therefore, closing of the gates. Hydrolysis, on the contrary, opens them. DNA cleavage and reunion is performed by a catalytic center located in DNA gates build by all gyrase subunits. C gates are formed by GyrA subunits.
Механохимическая модель активности гиразы
Одномолекулярное исследование охарактеризовало активность гиразы в зависимости от напряжения ДНК (приложенной силы) и АТФ, и предложило механико-химическую модель. При связывании с ДНК (состояние "ДНК, связанная с гиразой") возникает конкуренция между обертыванием ДНК и диссоциацией, при этом увеличение напряжения ДНК повышает вероятность диссоциации. Согласно предложенному каталитическому циклу, связывание двух молекул АТФ вызывает димеризацию АТФазных доменов субъединиц GyrB и захват T-сегмента ДНК (T от transferring – перенос) в полость между субъединицами GyrB. На следующем этапе фермент разрезает G-сегмент ДНК (G от gate – ворота), создавая разрыв обеих цепей. Затем T-сегмент переносится через разрыв, что сопровождается гидролизом первой молекулы АТФ. ДНК-гираза лигирует разрыв в G-сегменте, после чего T-сегмент окончательно покидает ферментный комплекс. Гидролиз второй молекулы АТФ возвращает систему к начальной стадии цикла. В результате каталитического цикла гидролизуются две молекулы АТФ и в шаблон ДНК вводится две отрицательные суперспирали. Количество суперспиральных витков, вводимых в первоначально релаксированную кольцевую ДНК, было рассчитано и оказалось приблизительно равным числу молекул АТФ, гидролизованных гиразой. Следовательно, можно предположить, что гираза гидролизует две молекулы АТФ за цикл реакции, что приводит к возникновению разницы в числе перекрестков в 2.
Специфика гиразы
Гираза обладает выраженной специфичностью к ДНК-субстратам. Сильные участки связывания гиразы (SGS) были обнаружены в некоторых фагах (группа бактериофагов Mu) и плазмидах (pSC101, pBR322). Недавно было проведено высокопроизводительное картирование участков связывания ДНК-гиразы в геноме Escherichia coli с использованием подхода Topo Seq.
Хинолоны (включая налидиксическую кислоту и ципрофлоксацин) известны как яды топоизомеразы. Связываясь с ферментом, они фиксируют его на переходной стадии каталитического цикла, предотвращая воссоединение G-сегмента. Это приводит к накоплению разрывов двойной спирали, остановке репликационных вилок и гибели клеток. Бактерии, устойчивые к хинолонам, часто содержат мутировавшие топоизомеразы, нечувствительные к связыванию с хинолонами. Субъединица А избирательно инактивируется антибиотиками, такими как оксолиновая и налидиксическая кислоты. Субъединица B избирательно инактивируется антибиотиками, такими как кумермицин А1 и новобиоцин. Ингибирование любой из этих субъединиц блокирует суперспирализацию.
The quinolones (including nalidixic acid and ciprofloxacin) are known as topoisomerase poisons. By binding to the enzyme they trap it in a transient step of the catalytic cycle, preventing the reunion of a G segment. This results in an accumulation of double strand breaks, stalling of replication forks and cell death. Quinolone resistant bacteria frequently harbor mutated topoisomerases that resist quinolone binding. The subunit A is selectively inactivated by antibiotics such as oxolinic and nalidixic acids. The subunit B is selectively inactivated by antibiotics such as coumermycin A1 and novobiocin. Inhibition of either subunit blocks supertwisting activity.
Фаг Т4
Фаговые гены T4 39, 52 и 60 кодируют белки, формирующие ДНК-гиразу, которая используется в репликации ДНК фага во время инфекции бактериального хозяина E. coli. Белок, кодируемый геном 52 фага, обладает гомологией с субъединицей gyrA бактериальной гиразы, а белок, кодируемый геном 39 фага, обладает гомологией с субъединицей gyrB. Поскольку ДНК-гираза хозяина E. coli может частично компенсировать отсутствие продуктов фаговых генов, мутанты с дефектами в генах 39, 52 или 60 не полностью блокируют репликацию ДНК фага, а лишь замедляют ее начало. Мутант с дефектом в гене 39 также проявляет повышенную чувствительность к инактивации ультрафиолетовым излучением на стадии инфекции фага после начала репликации ДНК, когда присутствует множество копий фаговой хромосомы.