Синтазы оксида азота: ферменты и роль в биологических процессах.

Введение

Фермент, катализирующий образование газового трансмиттера NO (оксида азота).

Синтазы оксида азота (NOS) – это семейство ферментов, катализирующих образование оксида азота (NO) из L-аргинина. NO является важной молекулой клеточной сигнализации. Он участвует в модуляции тонуса сосудов, секреции инсулина, тонуса дыхательных путей и перистальтики, а также в ангиогенезе и развитии нервной системы. NO может функционировать как ретроградный нейротрансмиттер. У млекопитающих образование оксида азота опосредовано изоферментами eNOS (эндотелиальная NOS) и nNOS (нейрональная NOS), контролируемыми кальцием и кальмодулином. Индуцируемая изоформа iNOS, участвующая в иммунном ответе, связывает кальмодулин при физиологически значимых концентрациях и производит NO как механизм иммунной защиты, поскольку NO является свободным радикалом с неспаренным электроном. Он является непосредственной причиной септического шока и может играть роль при аутоиммунных заболеваниях. NOS катализирует следующую реакцию: NOS уникальны тем, что используют пять кофакторов и являются единственным известным ферментом, связывающим флавин-адениндинуклеотид (FAD), флавинмононуклеотид (FMN), гем, тетрагидробиоптерин (BH4) и кальмодулин.

Распределение видов

Синтез NO из аргинина был обнаружен у млекопитающих, рыб, птиц, беспозвоночных и бактерий. Наиболее изучен у млекопитающих, где три различных гена кодируют изоферменты NOS: нейрональный (nNOS или NOS 1), индуцируемый цитокинами (iNOS или NOS 2) и эндотелиальный (eNOS или NOS 3). iNOS и nNOS являются растворимыми и преимущественно находятся в цитозоле, тогда как eNOS связан с мембраной. Имеются данные о NO-сигнализации у растений, однако в геномах растений отсутствуют гомологи суперсемейства, которое генерирует NO в других царствах.

iNOS

В отличие от критической кальций-зависимой регуляции конститутивных ферментов NOS (nNOS и eNOS), iNOS описывается как нечувствительный к кальцию, вероятно, из-за его тесного нековалентного взаимодействия с кальмодулином (CaM) и Ca2+. Ген, кодирующий iNOS, локализован на 17-й хромосоме. Индукция iNOS с высокой продуктивностью обычно происходит в окислительной среде, что позволяет высоким уровням NO реагировать с супероксидом, приводя к образованию пероксинитрита и клеточной токсичности. Эти свойства могут определять роль iNOS в иммунитете организма-хозяина, обеспечивая его участие в антимикробной и противоопухолевой активности как часть окислительного всплеска макрофагов. Предполагается, что патологическое образование оксида азота вследствие повышенной продукции iNOS может снижать частоту колебаний ресничек маточных труб и сокращения гладкой мускулатуры, тем самым влияя на транспорт эмбрионов, что, в свою очередь, может привести к внематочной беременности.

eNOS

Эндотелиальная NOS (eNOS), также известная как синтаза оксида азота 3 (NOS3), вырабатывает NO в кровеносных сосудах и участвует в регуляции сосудистой функции. Ген, кодирующий eNOS, расположен на 7-й хромосоме. Локализация eNOS в эндотелиальных мембранах опосредована котрансляционной N-концевой миристоилированием и посттрансляционным пальмитоилированием.

bNOS

Бактериальные НОС (bNOS) доказано защищают бактерии от окислительного стресса, разнообразных антибиотиков и иммунного ответа организма-хозяина. bNOS играет ключевую роль в транскрипции супероксиддисмутазы (SodA). Бактерии, находящиеся на поздней стадии логарифмической фазы роста и не обладающие bNOS, не способны повышать уровень SodA, что лишает их защиты от вредного окислительного стресса. Изначально bNOS мог присутствовать для подготовки клетки к стрессовым условиям, но теперь, по-видимому, помогает защищать бактерии от традиционных антимикробных средств. В качестве клинического применения можно разработать ингибитор bNOS для снижения количества грамположительных бактерий.

Химическая реакция

Синтазы оксида азота производят NO, катализируя пятиэлектронное окисление гуанидинового азота L-аргинина (L-Arg). Окисление L-аргинина до L-цитруллина происходит посредством двух последовательных реакций моноокисления с образованием Nω-гидрокси-L-аргинина (NOHLA) в качестве промежуточного продукта. Для образования одного моля NO потребляется 2 моль O2 и 1,5 моль NADPH. Все три изоформы (каждая из которых, предположительно, функционирует как гомодимер при активации) имеют общий карбоксильный терминальный домен редуктазы, гомологичный цитохрому P450 редуктазе. Они также имеют общий аминотерминальный домен оксигеназы, содержащий гемовую протетическую группу, которая связана в середине белка с доменом связывания кальмодулина. Связывание кальмодулина, по-видимому, действует как "молекулярный переключатель", обеспечивая перенос электронов от флавинных протезных групп в домене редуктазы к гему. Это облегчает превращение O2 и L-аргинина в NO и L-цитруллин. Домен оксигеназы каждой изоформы NOS также содержит протетическую группу BH4, необходимую для эффективного образования NO. В отличие от других ферментов, где BH4 используется в качестве источника восстановительных эквивалентов и регенерируется дигидробиоптеринредуктазой, BH4 активирует связанный с гемом O2, отдавая один электрон, который затем возвращается для обеспечения высвобождения оксида азота. Первая идентифицированная синтаза оксида азота была обнаружена в нейронной ткани (NOS1 или nNOS); эндотелиальная NOS (eNOS или NOS3) была третьей по счету. Изначально они были классифицированы как "конститутивно экспрессируемые" и "чувствительные к Ca2+", но теперь известно, что они присутствуют во многих различных типах клеток, и их экспрессия регулируется в определенных физиологических условиях. В NOS1 и NOS3 физиологические концентрации Ca2+ в клетках регулируют связывание кальмодулина с "защелкивающими доменами", тем самым инициируя перенос электронов от флавинов к гемовым группам. В отличие от этого, кальмодулин остается прочно связанным с индуцируемой и нечувствительной к Ca2+ изоформой (iNOS или NOS2) даже при низкой внутриклеточной активности Ca2+, фактически выступая в качестве субъединицы этой изоформы. Окись азота сама может регулировать экспрессию и активность NOS. В частности, было показано, что NO играет важную роль в регуляции отрицательной обратной связи на NOS3 и, следовательно, на функцию сосудистых эндотелиальных клеток. Этот процесс, известный как S-нитрозирование (и многими в этой области называемый S-нитрозилированием), обратимо ингибирует активность NOS3 в сосудистых эндотелиальных клетках. Этот процесс может быть важен, поскольку он регулируется клеточными окислительно-восстановительными условиями и может, таким образом, обеспечить механизм связи между "окислительным стрессом" и эндотелиальной дисфункцией. Помимо NOS3, было обнаружено, что NOS1 и NOS2 также подвергаются S-нитрозированию, но доказательства динамической регуляции этих изоформ NOS этим процессом менее убедительны. Кроме того, было показано, что NOS1 и NOS2 образуют ферро-нитрозильные комплексы в своих гемопротетических группах, которые в определенных условиях могут частично самоинактивировать эти ферменты. Лимитирующим этапом производства оксида азота в некоторых типах клеток вполне может быть доступность L-аргинина. Это может быть особенно важно после индукции NOS2.

Nitric oxide synthases produce NO by catalysing a five electron oxidation of a guanidino nitrogen of L arginine (L Arg). Oxidation of L Arg to L citrulline occurs via two successive monooxygenation reactions producing Nω hydroxy L arginine (NOHLA) as an intermediate. 2 mol of O2 and 1.5 mol of NADPH are consumed per mole of NO formed. All three isoforms (each of which is presumed to function as a homodimer during activation) share a carboxyl terminal reductase domain homologous to the cytochrome P450 reductase. They also share an amino terminal oxygenase domain containing a heme prosthetic group, which is linked in the middle of the protein to a calmodulin binding domain. Binding of calmodulin appears to act as a "molecular switch" to enable electron flow from flavin prosthetic groups in the reductase domain to heme. This facilitates the conversion of O2 and L arginine to NO and L citrulline. The oxygenase domain of each NOS isoform also contains an BH4 prosthetic group, which is required for the efficient generation of NO. Unlike other enzymes where BH4 is used as a source of reducing equivalents and is recycled by dihydrobiopterin reductase , BH4 activates heme bound O2 by donating a single electron, which is then recaptured to enable nitric oxide release. The first nitric oxide synthase to be identified was found in neuronal tissue (NOS1 or nNOS); the endothelial NOS (eNOS or NOS3) was the third to be identified. They were originally classified as "constitutively expressed" and "Ca2+ sensitive" but it is now known that they are present in many different cell types and that expression is regulated under specific physiological conditions. In NOS1 and NOS3, physiological concentrations of Ca2+ in cells regulate the binding of calmodulin to the "latch domains", thereby initiating electron transfer from the flavins to the heme moieties. In contrast, calmodulin remains tightly bound to the inducible and Ca2+ insensitive isoform (iNOS or NOS2) even at a low intracellular Ca2+ activity, acting essentially as a subunit of this isoform. Nitric oxide may itself regulate NOS expression and activity. Specifically, NO has been shown to play an important negative feedback regulatory role on NOS3, and therefore vascular endothelial cell function. This process, known formally as S nitrosation (and referred to by many in the field as S nitrosylation), has been shown to reversibly inhibit NOS3 activity in vascular endothelial cells. This process may be important because it is regulated by cellular redox conditions and may thereby provide a mechanism for the association between "oxidative stress" and endothelial dysfunction. In addition to NOS3, both NOS1 and NOS2 have been found to be S nitrosated, but the evidence for dynamic regulation of those NOS isoforms by this process is less complete. In addition, both NOS1 and NOS2 have been shown to form ferrous nitrosyl complexes in their heme prosthetic groups that may act partially to self inactivate these enzymes under certain conditions. The rate limiting step for the production of nitric oxide may well be the availability of L arginine in some cell types. This may be particularly important after the induction of NOS2.

Ингибиторы

Роноптерин (VAS 203), также известный как 4-аминотетрагидробиоптерин (4 ABH4), аналог BH4 (кофактора NOS), является ингибитором NOS, разрабатываемым в качестве нейропротекторного средства для лечения травматического повреждения головного мозга. Среди других ингибиторов NOS, которые изучались или изучаются для возможного клинического применения, можно выделить цидунистат, A 84643, ONO 1714, L NOARG, NCX 456, VAS 2381, GW 273629, NXN 462, CKD 712, KD 7040 и гуанидиноэтилдисульфид, и другие.