Анализ крови на выявление инфекций кровотока

Введение

Анализ для выявления инфекций кровотока

Посев крови – это медицинский лабораторный тест, используемый для обнаружения бактерий или грибков в крови человека. В норме кровь не содержит микроорганизмов: их присутствие может указывать на инфекцию кровотока, такую как бактериемия или фунгемия, которая в тяжелых случаях может привести к сепсису. Культивирование крови позволяет идентифицировать микробы и проверить их устойчивость к антимикробным препаратам, что дает возможность врачам назначить эффективное лечение. Для проведения анализа кровь помещают в пробирки, содержащие жидкую среду, способствующую росту микроорганизмов, называемую питательной средой. Обычно при одном заборе крови собирают два контейнера: один предназначен для аэробных организмов, нуждающихся в кислороде, а другой – для анаэробных организмов, которым кислород не требуется. Эти два контейнера называют набором посевов крови. Иногда для исследования берут два набора посевов крови из двух разных мест забора. Если микроорганизм обнаруживается только в одном из двух наборов, это с большей вероятностью указывает на контаминацию кожной флорой, а не на истинную инфекцию кровотока. Ложноотрицательные результаты могут возникать, если образец взят после приема пациентом антимикробных препаратов или если пробирки не заполнены рекомендованным объемом крови. Некоторые микроорганизмы плохо растут в посевах крови и требуют специальных методов обнаружения. Пробирки помещают в инкубатор на несколько дней для размножения микроорганизмов. При обнаружении роста микробов из пробирки для посева проводят окраску по Граму для подтверждения наличия микроорганизмов и получения предварительной информации об их идентификации. Затем кровь пересевают, то есть наносят на агарную пластинку для выделения микробных колоний для полной идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам. Поскольку важно быстро диагностировать и лечить инфекции кровотока, были разработаны экспресс-методы, основанные на технологиях, таких как полимеразная цепная реакция и MALDI TOF MS. Методы культивирования крови были впервые опубликованы еще в середине XIX века, но эти методы были трудоемкими и существенно отличались от современных. Обнаружение роста микроорганизмов заключалось в визуальном осмотре пробирок с культурой, пока в 1970-х годах не были внедрены автоматизированные системы посева крови, которые контролируют газы, выделяемые в процессе метаболизма микроорганизмов. В развитых странах ручные методы посева крови в значительной степени уступили место автоматизированным системам.

A blood culture is a medical laboratory test used to detect bacteria or fungi in a person's blood. Under normal conditions, the blood does not contain microorganisms: their presence can indicate a bloodstream infection such as bacteremia or fungemia, which in severe cases may result in sepsis. By culturing the blood, microbes can be identified and tested for resistance to antimicrobial drugs, which allows clinicians to provide an effective treatment. To perform the test, blood is drawn into bottles containing a liquid formula that enhances microbial growth, called a culture medium. Usually, two containers are collected during one draw, one of which is designed for aerobic organisms that require oxygen, and one of which is for anaerobic organisms, that do not. These two containers are referred to as a set of blood cultures. Two sets of blood cultures are sometimes collected from two different blood draw sites. If an organism only appears in one of the two sets, it is more likely to represent contamination with skin flora than a true bloodstream infection. False negative results can occur if the sample is collected after the person has received antimicrobial drugs or if the bottles are not filled with the recommended amount of blood. Some organisms do not grow well in blood cultures and require special techniques for detection. The containers are placed in an incubator for several days to allow the organisms to multiply. If microbial growth is detected, a Gram stain is conducted from the culture bottle to confirm that organisms are present and provide preliminary information about their identity. The blood is then subcultured, meaning it is streaked onto an agar plate to isolate microbial colonies for full identification and antimicrobial susceptibility testing. Because it is essential that bloodstream infections are diagnosed and treated quickly, rapid testing methods have been developed using technologies like polymerase chain reaction and MALDI TOF MS. Procedures for culturing the blood were published as early as the mid 19th century, but these techniques were labour intensive and bore little resemblance to contemporary methods. Detection of microbial growth involved visual examination of the culture bottles until automated blood culture systems, which monitor gases produced by microbial metabolism, were introduced in the 1970s. In developed countries, manual blood culture methods have largely been made obsolete by automated systems.

Медицинское применение

Кровь обычно стерильна. Наличие бактерий в крови называется бактериемией, а наличие грибков – фунгемией. Незначительные повреждения кожи могут привести к попаданию бактерий в кровоток, однако эта бактериемия обычно носит временный характер и редко обнаруживается при посеве, поскольку иммунная система и ретикулоэндотелиальная система быстро изолируют и уничтожают микроорганизмы. Бактерии могут проникать в кровь при инфекциях, таких как целлюлит, инфекции мочевыводящих путей и пневмония, а также при инфекциях внутри сосудистой системы, например, при бактериальном эндокардите или инфекциях, связанных с внутривенными катетерами, что может привести к стойкой бактериемии. При подозрении на сепсис необходимо проводить посев крови для выявления возбудителя и назначения адекватной антимикробной терапии. Посев крови используется для выявления инфекций кровотока при фебрильной нейтропении – частом осложнении химиотерапии, характеризующемся лихорадкой на фоне резко сниженного количества нейтрофилов (белых кровяных клеток, защищающих от бактериальных и грибковых патогенов). Бактериемия часто встречается при некоторых типах инфекций, таких как менингит, септический артрит и эпидуральные абсцессы, поэтому в этих случаях посев крови показан. При инфекциях, менее тесно связанных с бактериемией, посев крови может быть целесообразен, если у пациента высокий риск развития внутрисосудистой инфекции или если невозможно быстро получить посев с основного очага инфекции (например, посев мочи при пиелонефрите или посев мокроты при тяжелой внебольничной пневмонии) и при лихорадке неясного генеза. Наиболее часто в посевах крови выявляются Staphylococcus aureus, Escherichia coli и другие представители семейства Enterobacteriaceae, виды Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans. Коагулазо-негативные стафилококки (CNS) также часто встречаются, однако нередко бывает сложно определить, являются ли эти микроорганизмы, составляющие часть нормальной флоры кожи, истинными патогенами или просто контаминантами. Эпидемиология инфекций кровотока меняется со временем и в зависимости от географического региона; например, в США в 1980-х и 1990-х годах грамположительные микроорганизмы вытеснили грамотрицательные в качестве основной причины бактериемии, а частота фунгемии значительно возросла в связи с увеличением числа пациентов, получающих иммуносупрессивную терапию, такую как химиотерапия. Грам-отрицательный сепсис чаще встречается в Центральной и Южной Америке, Восточной Европе и Азии, чем в Северной Америке и Западной Европе, а в Африке Salmonella enterica является одной из основных причин бактериемии.

Blood is normally sterile. The presence of bacteria in the blood is termed bacteremia, and the presence of fungi is called fungemia. Minor damage to the skin can introduce bacteria into the bloodstream, but this bacteremia is normally transient and is rarely detected in cultures because the immune system and reticuloendothelial system quickly sequester and destroy the organisms. Bacteria can enter the blood from infections such as cellulitis, UTIs and pneumonia; and infections within the vascular system, such as bacterial endocarditis or infections associated with intravenous lines, may result in a constant bacteremia. When sepsis is suspected, it is necessary to draw blood cultures to identify the causative agent and provide targeted antimicrobial therapy. Blood cultures are used to detect bloodstream infections in febrile neutropenia, a common complication of chemotherapy in which fever occurs alongside a severely low count of neutrophils (white blood cells that defend against bacterial and fungal pathogens). Bacteremia is common in some types of infections, such as meningitis, septic arthritis and epidural abscesses, so blood cultures are indicated in these conditions. In infections less strongly associated with bacteremia, blood culture may still be indicated if the individual is at high risk of acquiring an intravascular infection or if cultures cannot be promptly obtained from the main site of infection (for example, a urine culture in pyelonephritis or a sputum culture in severe community acquired pneumonia). and fever of unknown origin. The pathogens most frequently identified in blood cultures include Staphylococcus aureus, Escherichia coli and other members of the family Enterobacteriaceae, Enterococcus species, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. Coagulase negative staphylococci (CNS) are also commonly encountered, although it is often unclear whether these organisms, which constitute part of the normal skin flora, are true pathogens or merely contaminants. The epidemiology of bloodstream infections varies with time and place; for instance, Gram positive organisms overtook Gram negative organisms as the predominant cause of bacteremia in the United States during the 1980s and 1990s, and rates of fungemia have greatly increased in association with a growing population of people receiving immunosuppressive treatments such as chemotherapy. Gram negative sepsis is more common in Central and South America, Eastern Europe, and Asia than in North America and Western Europe; and in Africa, Salmonella enterica is a leading cause of bacteremia.

Коллекция

Кровь обычно берут через венопунктуру. Сбор образца из внутривенного катетера не рекомендуется, поскольку это связано с более высоким риском контаминации, хотя культуры могут быть взяты как из венопунктуры, так и из внутривенного катетера для диагностики инфекций, связанных с катетером. Перед взятием крови верхнюю часть каждого флакона для сбора дезинфицируют спиртовым тампоном для предотвращения контаминации. Если кровь необходимо взять для других исследований одновременно с забором крови для культуры, флаконы для культуры заполняют первыми, чтобы минимизировать риск контаминации. Поскольку антимикробная терапия может привести к ложноотрицательным результатам, подавляя рост микроорганизмов, рекомендуется брать кровь для культуры до начала антимикробной терапии, хотя это может быть непрактично у тяжелобольных пациентов.

Типичный забор крови для культуры включает заполнение двух флаконов, которые вместе составляют одну «культуру» или «набор». Один флакон предназначен для стимуляции роста аэробных организмов, а другой – для роста анаэробных организмов. У детей инфекции, вызванные анаэробными бактериями, встречаются редко, поэтому для минимизации необходимого объема крови может быть взят только один аэробный флакон. Рекомендуется брать как минимум два набора из двух разных мест венопунктуры. Это помогает отличить инфекцию от контаминации, поскольку контаминанты реже обнаруживаются более чем в одном наборе, чем истинные патогены. Кроме того, забор большего объема крови повышает вероятность обнаружения микроорганизмов, если они присутствуют. Флаконы для культуры крови содержат питательную среду, которая стимулирует размножение микроорганизмов, и антикоагулянт, предотвращающий свертывание крови, поскольку он не препятствует росту большинства организмов. Анаэробные флаконы обычно содержат восстановитель, такой как тиогликолат. Пустое пространство в анаэробном флаконе заполняется газовой смесью, не содержащей кислорода. Многие коммерчески производимые флаконы содержат смолу, которая абсорбирует антибиотики, чтобы уменьшить их воздействие на микроорганизмы в образце. Для обнаружения грибков и микобактерий могут использоваться другие специализированные флаконы, и в некоторых регионах может быть невозможно вообще выполнить посев крови. Важно, чтобы флаконы не были недо- или переполнены: недополнение может привести к ложноотрицательным результатам из-за меньшего количества организмов в образце, а переполнение может подавлять рост микроорганизмов из-за более низкого соотношения питательной среды к крови. Для оптимизации роста микроорганизмов рекомендуется соотношение крови к среде культивирования от 1:10 до 1:5. Для рутинных посевов крови у взрослых Клинический и лабораторный институт стандартов (CLSI) рекомендует брать два набора флаконов из двух разных заборов, с объемом 20–30 мл крови в каждом наборе. При подозрении на эндокардит может быть взято в общей сложности шесть флаконов.

A typical blood culture collection involves drawing blood into two bottles, which together form one "culture" or "set". One bottle is designed to enhance the growth of aerobic organisms, and the other is designed to grow anaerobic organisms. In children, infection with anaerobic bacteria is uncommon, so a single aerobic bottle may be collected to minimize the amount of blood required. It is recommended that at least two sets are collected from two separate venipuncture locations. This helps to distinguish infection from contamination, as contaminants are less likely to appear in more than one set than true pathogens. Additionally, the collection of larger volumes of blood increases the likelihood that microorganisms will be detected if present. Blood culture bottles contain a growth medium, which encourages microorganisms to multiply, and an anticoagulant that prevents blood from clotting. because it does not interfere with the growth of most organisms. and anaerobic bottles typically contain a reducing agent such as thioglycollate. The empty space in an anaerobic bottle is filled with a gas mixture that does not contain oxygen. Many commercially manufactured bottles contain a resin that absorbs antibiotics to reduce their action on the microorganisms in the sample. Other specialized bottles may be used to detect fungi and mycobacteria. and in some regions, it may not be possible to perform blood cultures at all. It is important that the bottles are neither underfilled nor overfilled: underfilling can lead to false negative results as fewer organisms are present in the sample, while overfilling can inhibit microbial growth because the ratio of growth medium to blood is comparatively lower. A 1:10 to 1:5 ratio of blood to culture medium is suggested to optimize microbial growth. For routine blood cultures in adults, the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recommends the collection of two sets of bottles from two different draws, with 20–30 mL of blood drawn in each set. If endocarditis is suspected, a total of six bottles may be collected.

Культивирование

[[Файл:Знаки роста в системах ручной культивировки крови.jpg|thumb|left|alt=См. подпись.|Признаки роста в системах ручной культивировки крови: а) пленка роста (пелликула) на поверхности; б) пузырьки газа; в) помутнение от роста микроорганизмов (в правой бутылке); г) видимые микробные колонии. Время инкубации может быть увеличено, если используются методы ручной культивировки крови или если есть подозрение на медленно растущие организмы, такие как некоторые бактерии, вызывающие эндокардит. В ручных системах бутылки визуально осматриваются на наличие признаков микробного роста, которые могут включать помутнение, выделение газа, наличие видимых микробных колоний или изменение цвета из-за расщепления крови, что называется гемолизом. Некоторые системы ручной культивировки крови указывают на рост с помощью отсека, заполняющегося жидкостью при образовании газов, или миниатюрной агар-пластинки, которая периодически инокулируется путем наклона бутылки. Чтобы не пропустить положительные результаты культивирования крови, образец из бутылки часто пересевают на агар-пластинку (подкультивируют) в конце инкубационного периода, независимо от того, наблюдаются ли признаки роста. Эти системы, такие как BACTEC, BacT/ALERT и VersaTrek, состоят из инкубатора, в котором бутылки с культурой постоянно перемешиваются. Рост обнаруживается датчиками, измеряющими уровень газов внутри бутылки, чаще всего углекислого газа, который служит индикатором микробного метаболизма. Если в конце инкубационного периода результат остается отрицательным, бутылку обычно утилизируют без подкультивирования. Для улучшения выделения медленно растущих или требовательных организмов, таких как грибы, микобактерии и легионеллы, можно использовать метод лизисной центрифуги. Вместо инкубации крови в бутылке с питательной средой этот метод предполагает сбор крови в пробирку, содержащую реагент, разрушающий (лизирующий) эритроциты и лейкоциты, с последующим центрифугированием образца. В результате этого твердые компоненты образца, включая микроорганизмы (при их наличии), концентрируются в осадок, который используется для инокуляции среды для подкультивирования. Хотя лизисная центрифуга обеспечивает более высокую чувствительность, чем традиционные методы культивирования крови, она подвержена контаминации из-за обширных манипуляций с образцом.

[[File:Signs of growth in manual blood culture systems. jpg|thumb|left|alt=See caption.|Signs of growth in manual blood culture systems: a) a film of growth (pellicle) on the surface; b) bubbles from gas production; c) turbidity from microbial growth (in right bottle); d) visible microbial colonies The incubation time may be extended further if manual blood culture methods are used or if slower growing organisms, such as certain bacteria that cause endocarditis, are suspected. In manual systems, the bottles are visually examined for indicators of microbial growth, which might include cloudiness, the production of gas, the presence of visible microbial colonies, or a change in colour from the digestion of blood, which is called hemolysis. Some manual blood culture systems indicate growth using a compartment that fills with fluid when gases are produced, or a miniature agar plate which is periodically inoculated by tipping the bottle. To ensure that positive blood cultures are not missed, a sample from the bottle is often inoculated onto an agar plate (subcultured) at the end of the incubation period regardless of whether or not indicators of growth are observed. These systems, such as the BACTEC, BacT/ALERT and VersaTrek, consist of an incubator in which the culture bottles are continuously mixed. Growth is detected by sensors that measure the levels of gases inside the bottle—most commonly carbon dioxide—which serve as an indicator of microbial metabolism. If the bottle remains negative at the end of the incubation period, it is generally discarded without being subcultured. A technique called the lysis centrifugation method can be used for improved isolation of slow growing or fastidious organisms, such as fungi, mycobacteria, and Legionella. Rather than incubating the blood in a bottle filled with growth medium, this method involves collecting blood into a tube containing an agent that destroys (lyses) red and white blood cells, then spinning the sample in a centrifuge. This process concentrates the solid contents of the sample, including microorganisms if present, into a pellet, which is used to inoculate the subculture media. While lysis centrifugation offers greater sensitivity than conventional blood culture methods, it is prone to contamination because it requires extensive manipulation of the sample.

Испытания на чувствительность к антибиотикам

Антимикробное лечение инфекций кровотока первоначально является эмпирическим, то есть основывается на предположении врача о вероятном возбудителе заболевания и локальных закономерностях антимикробной устойчивости. Проведение тестирования на чувствительность к антибиотикам (AST) выделенных из культуры крови патогенов позволяет врачам назначать более целенаправленную терапию и прекращать применение антибиотиков широкого спектра действия, которые могут вызывать нежелательные побочные эффекты. Существуют автоматизированные системы, использующие готовые панели антибиотиков, автоматически измеряющие рост микроорганизмов и определяющие результаты чувствительности с помощью алгоритмов; некоторые из них способны выдавать результаты уже через пять часов, в то время как другие требуют ночной инкубации. Быстрое введение эффективных антимикробных препаратов критически важно при лечении сепсиса. Поскольку методы прямого тестирования не позволяют изолировать микроорганизмы, они не обеспечивают точных результатов при наличии более одного вида, хотя это относительно редкое явление в культурах крови. Еще одним источником ошибок является сложность стандартизации количества бактерий в образце (инокулуме), что существенно влияет на результаты анализа. Методы, такие как ПЦР и микрочипы, которые могут быть выполнены непосредственно на положительных образцах крови, выявляют последовательности ДНК, связанные с генами, определяющими устойчивость, например, ген mecA, обнаруженный у метициллин-резистентного Staphylococcus aureus, или гены vanA и vanB ванкомицин-резистентных энтерококков. Некоторые из этих методов могут быть применены к осадку из положительных флаконов с культурой крови. Однако отсутствие стандартизированных методик AST с использованием MALDI TOF ограничивает его применение в клинической практике, и прямой AST с помощью MALDI TOF, в отличие от генетических методов, не был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) по состоянию на 2018 год. Исследования показали частоту встречаемости от 0,8 до 12,5 процентов. Однако, если объем собранной крови значительно превышает рекомендуемый, рост бактерий может быть подавлен естественными ингибиторами, присутствующими в крови, и недостаточным количеством питательной среды во флаконе. Переполнение флаконов с культурой крови также может способствовать развитию ятрогенной анемии.

Antimicrobial treatment of bloodstream infections is initially empiric, meaning it is based on the clinician's suspicion about the causative agent of the disease and local patterns of antimicrobial resistance. Carrying out antibiotic susceptibility testing (AST) on pathogens isolated from a blood culture allows clinicians to provide a more targeted treatment and to discontinue broad spectrum antibiotics, which can have undesirable side effects. There are automated systems which use pre formulated antibiotic panels, measure microbial growth automatically, and determine the sensitivity results using algorithms; some of these can provide results in as little as five hours, but others require overnight incubation as well. Rapid administration of effective antimicrobial drugs is crucial in the treatment of sepsis, Because direct testing methods do not isolate the organisms, they do not provide accurate results if more than one microorganism is present, although this is an infrequent occurrence in blood cultures. Another source of error is the difficulty in standardizing the amount of bacteria in the sample (the inoculum), which has a profound effect on the test results. Methods such as PCR and microarrays, which can be performed directly on positive blood culture samples, detect DNA sequences associated with genes that confer resistance, such as the mecA gene found in methicillin resistant Staphylococcus aureus or the vanA and vanB genes of vancomycin resistant enterococci. Some of these methods can be performed on pellets from positive blood culture bottles. However, the lack of established methodologies for AST by MALDI TOF limits its use in clinical practice, and direct AST by MALDI TOF, unlike genetic testing methods, had not been approved by the Food and Drug Administration as of 2018. studies have found rates ranging from 0.8 to 12.5 percent. However, if the amount of blood collected far exceeds the recommended volume, bacterial growth may be inhibited by natural inhibitors present in the blood and an inadequate amount of growth medium in the bottle. Over filling of blood culture bottles may also contribute to iatrogenic anemia.

История

Ранние методы культуры крови были трудоемкими. Учебник по микробиологии 1911 года отмечал, что дезинфекция места забора крови и оборудования могла занимать более часа, и из-за отсутствия эффективных методов сохранения крови, культуру иногда приходилось готовить непосредственно у постели пациента. Помимо пересева бульона, некоторые протоколы предусматривали смешивание крови с расплавленным агаром и выливание смеси в чашку Петри, указывая, в частности, оптимальное соотношение крови к бульону 1:5, которое до сих пор считается правильным. С 1940-х по 1980-е годы проводились обширные исследования составов бульонов и добавок с целью создания питательной среды, способной поддерживать рост всех распространенных патогенов, попадающих в кровь. Автоматизированные системы гемокультуры впервые появились в 1970-х годах. Первые из них – системы BACTEC, разработанные Johnston Laboratories (ныне Becton Dickinson) – использовали бульоны, содержащие питательные вещества, меченные радиоактивными изотопами. Микроорганизмы, потребляющие эти субстраты, выделяли радиоактивный углекислый газ, и рост можно было обнаружить, отслеживая его концентрацию. До применения этой методики к гемокультуре, NASA предложила ее для обнаружения жизни на Марсе. В 1992 году этот неинвазивный метод измерения был внедрен в серию BACTEC 9000, которая использовала флуоресцентные индикаторы для определения изменений pH. Difco ESP являлся прямым предшественником современной системы VersaTREK.