Введение
Транспозаза – это любой из классов ферментов, способных связываться с концом транспозона и катализировать его перемещение в другую часть генома, как правило, посредством механизма вырезания и вставки или репликативного механизма, в процессе, известном как транспозиция. Термин "транспозаза" впервые был введен исследователями, клонировавшими фермент, необходимый для транспозиции транспозона Tn3. Существование транспозонов было постулировано в конце 1940-х годов Барбарой Макклинток, изучавшей наследственность кукурузы, однако фактический молекулярный механизм транспозиции был описан позднее другими группами исследователей. Макклинток обнаружила, что некоторые сегменты хромосом меняют свое положение, перемещаясь между различными локусами или с одной хромосомы на другую. Перемещение этих транспозонов (кодирующих цвет) позволяло экспрессировать другие гены, отвечающие за пигментацию. Транспозиция в кукурузе вызывает изменения цвета, однако в других организмах, таких как бактерии, она может приводить к устойчивости к антибиотикам. Транспозазы классифицируются под номером EC 2.7.7. Гены, кодирующие транспозазы, широко распространены в геномах большинства организмов и являются наиболее распространенными известными генами. В ходе эволюции человека до 40% человеческого генома могло перемещаться посредством транспозиции транспозонов. Транспозон кодирует устойчивость к канамицину и другим аминогликозидным антибиотикам. Tn5 и другие транспозазы характеризуются низкой активностью. Поскольку события транспозиции ДНК по своей природе мутагенны, низкая активность транспозаз необходима для снижения риска возникновения летальной мутации в клетке-хозяине и, следовательно, элиминации транспозирующего элемента. Одна из причин низкой реакционной способности Tn5 заключается в том, что N- и C-концы расположены относительно близко друг к другу и склонны ингибировать друг друга. Это было выяснено путем характеристики нескольких мутаций, приводящих к гиперактивным формам транспозаз. Одна из таких мутаций, L372P, представляет собой замену аминокислоты 372 в транспозазе Tn5. Эта аминокислота обычно является остатком лейцина, расположенным в середине альфа-спирали. Замена лейцина на пролин приводит к разрушению альфа-спирали, вызывая конформационное изменение в C-концевом домене и отделяя его от N-концевого домена в достаточной степени для повышения активности белка. Мотив DDE, как считается, координирует двухвалентные ионы металлов, чаще всего магний и марганец, которые играют важную роль в каталитической реакции. Стратегия на основе Tn5 может значительно упростить протокол подготовки библиотеки и даже быть включена в ПЦР непосредственно из колоний для большого числа бактериальных изолятов без заметных искажений покрытия. SB-транспозаза принадлежит к семейству транспозаз DD[E/D], которые, в свою очередь, входят в большое суперсемейство полинуклеотидилтрансфераз, включающее RNase H, RuvC Holliday resolvase, белки RAG и ретровирусные интегразы. Система SB используется преимущественно у позвоночных животных для передачи генов, включая генную терапию и поиск генов. Инженерный SB100X – это фермент, направляющий высокий уровень интеграции транспозонов.
A transposase is any of a class of enzymes capable of binding to the end of a transposon and catalysing its movement to another part of a genome, typically by a cut and paste mechanism or a replicative mechanism, in a process known as transposition. The word "transposase" was first coined by the individuals who cloned the enzyme required for transposition of the Tn3 transposon. The existence of transposons was postulated in the late 1940s by Barbara McClintock, who was studying the inheritance of maize, but the actual molecular basis for transposition was described by later groups. McClintock discovered that some segments of chromosomes changed their position, jumping between different loci or from one chromosome to another. The repositioning of these transposons (which coded for color) allowed other genes for pigment to be expressed. Transposition in maize causes changes in color; however, in other organisms, such as bacteria, it can cause antibiotic resistance. Transposases are classified under EC number EC 2.7.7. Genes encoding transposases are widespread in the genomes of most organisms and are the most abundant genes known. During the course of human evolution, as much as 40% of the human genome has moved around via methods such as transposition of transposons. The transposon codes for antibiotic resistance to kanamycin and other aminoglycoside antibiotics. Tn5 and other transposases are notably inactive. Because DNA transposition events are inherently mutagenic, the low activity of transposases is necessary to reduce the risk of causing a fatal mutation in the host, and thus eliminating the transposable element. One of the reasons Tn5 is so unreactive is because the N and C termini are located in relatively close proximity to one another and tend to inhibit each other. This was elucidated by the characterization of several mutations which resulted in hyperactive forms of transposases. One such mutation, L372P, is a mutation of amino acid 372 in the Tn5 transposase. This amino acid is generally a leucine residue in the middle of an alpha helix. When this leucine is replaced with a proline residue the alpha helix is broken, introducing a conformational change to the C terminal domain, separating it from the N terminal domain enough to promote higher activity of the protein. The DDE motif is said to coordinate divalent metal ions, most often magnesium and manganese, which are important in the catalytic reaction. reducing the time and input requirements over traditional next generation sequencing library preparation. The Tn5 based strategy can simplify the library preparation protocol significantly and can even can be incorporated into the direct colony PCR for large numbers of bacterial isolates with no obvious coverage bias. SB transposase belongs to the DD[E/D] family of transposases, which in turn belong to a large superfamily of polynucleotidyl transferases that includes RNase H, RuvC Holliday resolvase, RAG proteins, and retroviral integrases. The SB system is used primarily in vertebrate animals for gene transfer, including gene therapy, and gene discovery. The engineered SB100X is an enzyme that directs the high levels of transposon integration.
Транспозон Tn7
Транспозон Tn7 – это мобильный генетический элемент, обнаруженный у многих прокариот, таких как Escherichia coli (E. coli), и впервые выявленный как последовательность ДНК в бактериальных хромосомах и природных плазмидах, кодирующих устойчивость к антибиотикам триметоприму и стрептомицину. Классифицируемый как транспозируемый элемент (транспозон), он способен дуплицироваться и перемещаться внутри генома, используя самокодируемый рекомбиназный фермент – транспозазу, что приводит к таким последствиям, как создание или обращение мутаций и изменение размера генома. Транспозон Tn7 разработал два механизма для облегчения своего распространения среди прокариот. Эта специфическая последовательность представляет собой важный и высококонсервативный ген, встречающийся во многих штаммах бактерий. Однако рекомбинация не наносит вреда бактериальной клетке-хозяину, поскольку Tn7 транспонируется ниже по течению от гена после его распознавания, обеспечивая безопасный способ распространения транспозона без гибели хозяина. Этот высокоэволюционировавший и сложный механизм выбора целевого сайта предполагает, что он развился для содействия сосуществованию транспозона и его хозяина, а также успешной передаче Tn7 будущим поколениям бактерий. Транспозон Tn7 имеет длину 14 кб и кодирует пять ферментов. Концы последовательности ДНК состоят из двух сегментов, с которыми транспозаза Tn7 взаимодействует во время рекомбинации. Левый сегмент (Tn7 L) имеет длину 150 п.н., а правый сегмент (Tn7 R) – 90 п.н. Оба конца транспозона содержат серию 22-нуклеотидных участков связывания, которые транспозаза Tn7 распознает и к которым связывается. Внутри транспозона расположены пять отдельных генов, кодирующих белки, составляющие механизм транспозиции. Кроме того, транспозон содержит интегран – сегмент ДНК, содержащий несколько кассет генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам. Транспозон Tn7 кодирует пять белков: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD и TnsE. TnsA и TnsB взаимодействуют друг с другом, образуя транспозазный фермент TnsAB. Этот фермент специфически распознает и связывается с концами последовательности ДНК транспозона и иссекает его, внося двухцепочечные разрывы ДНК на каждом конце. Затем вырезанная последовательность вставляется в другой участок ДНК-мишени. Подобно другим изученным транспозонам, механизм транспозиции Tn7 включает расщепление 3'-концов донорной ДНК белком TnsA транспозазы TnsAB. Однако Tn7 также уникальным образом расщепляется вблизи 5'-концов, примерно в 5 п.н. от 5'-конца в направлении транспозона Tn7, белком TnsB транспозазы TnsAB. После вставки транспозона в целевой участок ДНК 3'-концы ковалентно связываются с целевой ДНК, но в 5'-концах остаются 5-нуклеотидные пробелы. В результате, восстановление этих пробелов приводит к дальнейшему 5-нуклеотидному дублированию в целевом участке. Белок TnsC взаимодействует с ферментом транспозазой и целевой ДНК, способствуя процессам иссечения и вставки. Способность TnsC активировать транспозазу зависит от его взаимодействия с целевой ДНК вместе с соответствующим целевым белком TnsD или TnsE. Белки TnsD и TnsE являются альтернативными селекторами мишени, которые также являются активаторами связывания ДНК, способствующими иссечению и вставке Tn7. Их способность взаимодействовать с определенной целевой ДНК является ключевой для выбора целевого сайта Tn7. Таким образом, белки TnsA, TnsB и TnsC образуют основной механизм Tn7: TnsA и TnsB взаимодействуют друг с другом, образуя транспозазу, в то время как TnsC функционирует как регулятор активности транспозазы, обеспечивая связь между транспозазой и TnsD и TnsE. Когда белок TnsE взаимодействует с основным механизмом TnsABC, Tn7 преимущественно направляет вставки в конъюгируемые плазмиды. Когда белок TnsD взаимодействует с TnsABC, Tn7 преимущественно направляет вставки ниже по течению в один важный и высококонсервативный участок в бактериальной хромосоме. Этот участок, attTn7, специфически распознается TnsD.