Кіріспе
Транспозаза – транспозиция соңына байланысып, оның геномның басқа бөлігіне қозғалысын катализдей алатын ферменттер класының кез келген түрі, әдетте кесу-қою механизмі немесе репликациялық механизм арқылы, транспозиция деп аталатын процесте. "Транспозаза" сөзін алғаш рет Tn3 транспозонының транспозициясы үшін қажетті ферментті клондаған ғалымдар қолданған. Транспозонның бар екендігін 1940 жылдардың соңында жүгерінің тұқым қуалауын зерттеген Барбара Макклинток болжаған, бірақ транспозицияның нақты молекулалық негізін кейінгі топтар сипаттаған. Макклинток хромосомалардың кейбір бөліктерінің орналасуы өзгеретінін, әртүрлі локустар арасында немесе бір хромосомадан екіншісіне секіріп отыратынын анықтады. Бұл транспозондардың (түсті кодтайтын) қайта орналасуы пигмент үшін басқа гендердің экспрессиясына мүмкіндік берді. Жүгерідегі транспозиция түстің өзгеруіне себеп болады, бірақ бактериялар сияқты басқа организмдерде антибиотикке төзімділік тудыруы мүмкін. Транспозазалар EC 2.7.7 нөмірімен жіктеледі. Транспозазаларды кодтайтын гендер көптеген организмдердің геномдарында кеңінен таралған және ең көп кездесетін гендер болып табылады. Адам эволюциясы барысында, адам геномның 40%-ға дейін транспозондарды жылжыту сияқты әдістер арқылы қозғалған. Транспозондар канамицинге және басқа аминогликозидтік антибиотиктерге төзімділікті кодтайды. Tn5 және басқа транспозазалар айтарлықтай белсенді емес. ДНК транспозициясы оқиғалары мутагенді болып келетін болғандықтан, транспозазалардың төмен белсенділігі иесінде өлімге әкелетін мутация тудыру қаупін азайту үшін қажет, соның салдарынан транспозицияланатын элементтің жойылуына себеп болады. Tn5 реакциясының өте төмен болуының себебі – N және C терминалдары бір-біріне жақын орналасқан және бір-бірін тежеуге бейім. Бұл транспозазалардың жоғары белсенді формаларына әкелетін бірнеше мутацияларды сипаттау арқылы анықталды. Мұндай мутациялардың бірі – L372P – Tn5 транспозазасындағы 372-ші аминқышқылының мутациясы. Бұл аминқышқылы әдетте альфа спиральдің ортасындағы лейцин болып табылады. Бұл лейцин пролинмен ауыстырылғанда альфа спираль бұзылады, С терминалды доменнің конформациялық өзгеруіне алып келеді, оны N терминалды доменнен бөліп, белоктың белсенділігін арттырады. DDE мотивінің каталитикалық реакцияда маңызды болып табылатын еківалентті металл иондарын, көбінесе магний мен марганецті байланыстыратындығы айтылады. Бұл дәстүрлі келесі буын секвенирлеу кітапханасын дайындаумен салыстырғанда уақыт және ресурстарды үнемдеуге мүмкіндік береді. Tn5-ке негізделген стратегия кітапхананы дайындау протоколын айтарлықтай жеңілдетеді және тіпті бактериялық изоляттардың көп саны үшін тікелей колониялық ПТР-ге енгізілуі мүмкін, ешқандай айқын жабылу қатесіз. SB транспозазасы DD[E/D] транспозазалар отбасының құрамына жатады, ал олар өз кезегінде RNase H, RuvC Holliday резольвазасы, RAG ақуыздары және ретровирустық интегразаларды қамтитын үлкен полинуклеотидил трансферазалар суперотбасына жатады. SB жүйесі негізінен омыртқалы жануарларда гендерді жеткізу, гендік терапия және гендерді зерттеу үшін қолданылады. SB100X ферменті транспозонның жоғары деңгейде интеграциялануын қамтамасыз етеді.
A transposase is any of a class of enzymes capable of binding to the end of a transposon and catalysing its movement to another part of a genome, typically by a cut and paste mechanism or a replicative mechanism, in a process known as transposition. The word "transposase" was first coined by the individuals who cloned the enzyme required for transposition of the Tn3 transposon. The existence of transposons was postulated in the late 1940s by Barbara McClintock, who was studying the inheritance of maize, but the actual molecular basis for transposition was described by later groups. McClintock discovered that some segments of chromosomes changed their position, jumping between different loci or from one chromosome to another. The repositioning of these transposons (which coded for color) allowed other genes for pigment to be expressed. Transposition in maize causes changes in color; however, in other organisms, such as bacteria, it can cause antibiotic resistance. Transposases are classified under EC number EC 2.7.7. Genes encoding transposases are widespread in the genomes of most organisms and are the most abundant genes known. During the course of human evolution, as much as 40% of the human genome has moved around via methods such as transposition of transposons. The transposon codes for antibiotic resistance to kanamycin and other aminoglycoside antibiotics. Tn5 and other transposases are notably inactive. Because DNA transposition events are inherently mutagenic, the low activity of transposases is necessary to reduce the risk of causing a fatal mutation in the host, and thus eliminating the transposable element. One of the reasons Tn5 is so unreactive is because the N and C termini are located in relatively close proximity to one another and tend to inhibit each other. This was elucidated by the characterization of several mutations which resulted in hyperactive forms of transposases. One such mutation, L372P, is a mutation of amino acid 372 in the Tn5 transposase. This amino acid is generally a leucine residue in the middle of an alpha helix. When this leucine is replaced with a proline residue the alpha helix is broken, introducing a conformational change to the C terminal domain, separating it from the N terminal domain enough to promote higher activity of the protein. The DDE motif is said to coordinate divalent metal ions, most often magnesium and manganese, which are important in the catalytic reaction. reducing the time and input requirements over traditional next generation sequencing library preparation. The Tn5 based strategy can simplify the library preparation protocol significantly and can even can be incorporated into the direct colony PCR for large numbers of bacterial isolates with no obvious coverage bias. SB transposase belongs to the DD[E/D] family of transposases, which in turn belong to a large superfamily of polynucleotidyl transferases that includes RNase H, RuvC Holliday resolvase, RAG proteins, and retroviral integrases. The SB system is used primarily in vertebrate animals for gene transfer, including gene therapy, and gene discovery. The engineered SB100X is an enzyme that directs the high levels of transposon integration.
Tn7 транспозон
Tn7 транспозоны – көптеген прокариоттарда, мысалы, Escherichia coli (E. coli) табылған жылдамды генетикалық элемент, және алғаш рет бактериялық хромосомаларда және табиғи плазмидтерде антибиотиктерге – триметоприм мен стрептомицинге – қарсы тұруды кодтайтын ДНК тізбегі ретінде анықталды. Транспозаза деп аталатын өзіндік кодталған рекомбиназа ферментін пайдалана отырып, бұл тізбек геном ішінде көшіп, жылжып, мутацияларды тудыру немесе оларды жою, сондай-ақ геномның мөлшерін өзгерту сияқты әсерлерге әкеледі. Tn7 транспозоны прокариоттар арасында таралуын қамтамасыз ететін екі механизмді дамытқан. Бұл нақты тізбек – бактериялардың көптеген штамдарында кездесетін маңызды және жоғары сақталған ген. Дегенмен, рекомбинация жаңақтанған бактерияға зиян келтірмейді, себебі Tn7 оны танығаннан кейін геннің төменгі жағына транспозицияланады, бұл жаңақтанған бактерияны өлтірмей транспозонды қауіпсіз таратуға мүмкіндік береді. Бұл жоғары дамыған және күрделі мақсатты таңдау механизмі транспозон мен оның жаңақтанған бактериясы арасындағы өмір сүруге бейімделуді, сондай-ақ Tn7-нің бактерияның келешек ұрпақтарына сәтті берілуін қамтамасыз ету үшін дамыған болуы мүмкін. Tn7 транспозоны 14 кб ұзындықта және бес ферментті кодтайды. ДНК тізбегінің екі ұшы рекомбинация кезінде Tn7 транспозазасымен өзара әрекеттесетін екі сегменттен тұрады. Сол жақ сегмент (Tn7 L) 150 бп, ал оң жақ тізбек (Tn7 R) 90 бп ұзындықта. Транспозонның екі ұшында да Tn7 транспозазасы танитын және байланысатын 22 бп байланыс орындары бар. Транспозонның ішінде транспозиция механизмін құрайтын белоктарды кодтайтын бес дискретті ген орналасқан. Сонымен қатар, транспозон антибиотиктерге қарсы тұруды кодтайтын бірнеше гендерді қамтитын ДНК сегменті – интегралды қамтиды. Tn7 транспозоны бес ақуызды кодтайды: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD және TnsE. TnsA және TnsB бірлесіп Tn7 транспозаза ферменті TnsAB-ді құрайды. Бұл фермент транспозонның ДНК тізбегінің ұштарын таниды және байланыстырады, содан кейін әр ұшындағы екі тізбекті ДНК үзілісін тудырып, оны алып тастайды. Алынған тізбек содан кейін басқа мақсатты ДНК орнына енгізіледі. Басқа сипатталған транспозондар сияқты, Tn7 транспозициясының механизмі TnsAB транспозазасының TnsA ақуызы арқылы донорлық ДНК-дан 3' ұштарының кесілуін қамтиды. Алайда, Tn7 5' ұшынан шамамен 5 бп қашықтықта, Tn7 транспозонына қарай TnsAB транспозазасының TnsB ақуызымен де кесіледі. Транспозонды мақсатты ДНК орнына енгізгеннен кейін 3' ұштары мақсатты ДНК-ға ковалентті байланысады, бірақ 5' ұштарында 5 бп саңылаулар қалады. Нәтижесінде, осы саңылауларды жөндеу мақсатты орнында қосымша 5 бп қайталануына әкеледі. TnsC ақуызы транспозаза ферментімен және мақсатты ДНК-мен өзара әрекеттесіп, экзиция және инсерция процестерін жеделдетеді. TnsC транспозазаны белсендіру қабілеті оның тиісті мақсатты белок – TnsD немесе TnsE – бар мақсатты ДНК-мен өзара әрекеттесуіне байланысты. TnsD және TnsE ақуыздары – бұл балама мақсатты таңдағыштар, сонымен қатар Tn7 экзициясы мен инсерциясын жеделдететін ДНК байланыс активаторлары. Олардың нақты мақсатты ДНК-мен өзара әрекеттесу қабілеті Tn7 мақсатты орнын таңдауда маңызды рөл атқарады. Осылайша, TnsA, TnsB және TnsC ақуыздары Tn7-нің негізгі механизмін құрайды: TnsA және TnsB транспозазаны құру үшін өзара әрекеттеседі, ал TnsC транспозазаның белсенділігін реттейді, транспозаза мен TnsD және TnsE арасында сигналдар жібереді. TnsE ақуызы TnsABC негізгі механизмімен өзара әрекеттескенде, Tn7 конъюгацияланатын плазмидтерге енуді жеделдетеді. TnsD ақуызы TnsABC-мен өзара әрекеттескенде, Tn7 инсерцияларды бактериялық хромосомадағы бір маңызды және жоғары сақталған орнына – attTn7 – бағыттайды. Бұл сайт TnsD арқылы арнайы танылады.