Нейрофиламенты: структура, состав и функции промежуточных филаментов типа IV в нейронах.

Введение

Нейрофиламенты (НФ) относятся к промежуточным нитям IV типа, обнаруженным в цитоплазме нейронов. Это белковые полимеры диаметром 10 нм и длиной в несколько микрометров. Вместе с микротубулами (~25 нм) и микрофиламентами (7 нм) они формируют нейронный цитоскелет. Считается, что их основная функция заключается в обеспечении структурной поддержки аксонов и регулировании диаметра аксонов, что влияет на скорость проведения нервного импульса. Белки, формирующие нейрофиламенты, принадлежат к семейству белков промежуточных нитей, которое подразделяется на шесть типов в зависимости от организации генов и структуры белка. Типы I и II – это кератины, экспрессируемые в эпителиальных тканях. Тип III содержит белки виментин, десмин, периферин и глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). Тип IV состоит из белков нейрофиламентов NF L, NF M, NF H и α-интернексина. Тип V состоит из ядерных ламинов, а тип VI – из белка нестина. Гены промежуточных нитей IV типа имеют два уникальных интрона, которых нет в других последовательностях генов промежуточных нитей, что указывает на общее эволюционное происхождение из одного примитивного гена IV типа. Любая белковая нить, протягивающаяся в цитоплазме нервной клетки, также называется нейрофибриллой. Этот термин используется при описании нейрофибриллярных клубков, наблюдаемых при некоторых нейродегенеративных заболеваниях.

Нейрофиламентные белки

Состав белков нейрофиламентов значительно варьируется у разных типов животных. Наибольшее количество информации известно о нейрофиламентах млекопитающих. Исторически считалось, что нейрофиламенты млекопитающих состоят всего из трех белков: нейрофиламентного белка NF L (низкий молекулярный вес; NF L), NF M (средний молекулярный вес; NF M) и NF H (высокий молекулярный вес; NF H). Эти белки были обнаружены в ходе исследований аксонального транспорта и часто называются «нейрофиламентной тройкой». Однако сейчас известно, что нейрофиламенты также содержат белок α-интернексин, а нейрофиламенты периферической нервной системы могут содержать белок периферин (это отличается от периферина 2, экспрессируемого в сетчатке). Таким образом, нейрофиламенты млекопитающих представляют собой гетерополимеры, состоящие до пяти различных белков: NF L, NF M, NF H, α-интернексин и периферин. Пять белков нейрофиламентов могут собираться в различные комбинации в разных типах нервных клеток и на разных стадиях развития. Точный состав нейрофиламентов в конкретной нервной клетке зависит от относительного уровня экспрессии белков нейрофиламентов в этой клетке в данный момент времени. Например, экспрессия NF H низкая в развивающихся нейронах и увеличивается после рождения в нейронах с миелинизированными аксонами. В нервной системе взрослого организма нейрофиламенты в небольших немиелинизированных аксонах содержат больше периферина и меньше NF H, в то время как нейрофиламенты в больших миелинизированных аксонах содержат больше NF H и меньше периферина. Субъединица промежуточного филамента типа III, виментин, экспрессируется в развивающихся нейронах и в нескольких очень редких нейронах у взрослых, в сочетании с белками типа IV, такими как горизонтальные нейроны сетчатки. +Белковые субъединицы нейрофиламентов человекаПротеинАминокислотыNCBI Ref SeqПредсказанная молекулярная массаПохожая молекулярная масса (SDS PAGE)Периферин470NP 006253.253,7 кДа~56 кДаα Интернексин499NP 116116.155,4 кДа~66 кДаНейрофиламентный белок L543NP 006149.261,5 кДа~70 кДаНейрофиламентный белок M916NP 005373.2102,5 кДа~160 кДаНейрофиламентный белок H1020NP 066554.2111,9 кДа~200 кДаБелки тройки названы в соответствии с их относительным размером (низкий, средний, высокий). Похожая молекулярная масса каждого белка, определяемая методом SDS PAGE, больше, чем масса, предсказанная на основе аминокислотной последовательности. Это связано с аномальной электрофоретической миграцией этих белков, особенно выраженной для нейрофиламентных белков NF M и NF H из-за их высокого содержания заряженных аминокислот и интенсивного фосфорилирования. Все три белка нейрофиламентной тройки содержат длинные участки полипептидной последовательности, богатые остатками глутаминовой кислоты и лизина, а NF M и особенно NF H также содержат несколько тандемно повторяющихся участков фосфорилирования серина. Эти участки почти все содержат пептид лизин-серин-пролин (KSP), а фосфорилирование обычно обнаруживается в аксональных, а не дендритных нейрофиламентах. У человека NF M содержит 13 таких участков KSP, в то время как человеческий NF H экспрессируется из двух аллелей, одна из которых продуцирует 44, а другая – 45 повторов KSP.

The protein composition of neurofilaments varies widely across different animal phyla. Most is known about mammalian neurofilaments. Historically, mammalian neurofilaments were originally thought to be composed of just three proteins called neurofilament protein NF L (low molecular weight; NF L), NF M (medium molecular weight; NF M) and NF H (high molecular weight; NF H). These proteins were discovered from studies of axonal transport and are often referred to as the "neurofilament triplet". However, it is now clear that neurofilaments also contain the protein α internexin and that neurofilaments in the peripheral nervous system can also contain the protein peripherin. (this is different from peripherin 2 that is expressed in the retina). Thus mammalian neurofilaments are heteropolymers of up to five different proteins: NF L, NF M, NF H, α internexin and peripherin. The five neurofilament proteins can co assemble in different combinations in different nerve cell types and at different stages of development. The precise composition of neurofilaments in any given nerve cell depends on the relative expression levels of the neurofilament proteins in the cell at that time. For example, NF H expression is low in developing neurons and increases postnatally in neurons with myelinated axons. In the adult nervous system neurofilaments in small unmyelinated axons contain more peripherin and less NF H whereas neurofilaments in large myelinated axons contain more NF H and less peripherin. The type III intermediate filament subunit, vimentin, is expressed in developing neurons and a few very unusual neurons in the adult in association with type IV proteins, such as the horizontal neurons of the retina. +Human neurofilament subunit proteinsProteinAmino acidsNCBI Ref SeqPredicted molecular massApparent molecular mass (SDS PAGE)Peripherin470NP 006253.253.7 kDa~56 kDaα Internexin499NP 116116.155.4 kDa~66 kDaNeurofilament protein L543NP 006149.261.5 kDa~70 kDaNeurofilament protein M916NP 005373.2102.5 kDa~160 kDaNeurofilament protein H1020NP 066554.2111.9 kDA~200 kDa
The triplet proteins are named based upon their relative size (low, medium, high). The apparent molecular mass of each protein determined by SDS PAGE is greater than the mass predicted from the amino sequence. This is due to the anomalous electrophoretic migration of these proteins and is particularly extreme for neurofilament proteins NF M and NF H due to their high content of charged amino acids and extensive phosphorylation. All three neurofilament triplet proteins contain long stretches of polypeptide sequence rich in glutamic acid and lysine residues, and NF M and especially NF H also contain multiple tandemly repeated serine phosphorylation sites. These sites almost all contain the peptide lysine serine proline (KSP), and phosphorylation is normally found on axonal and not dendritic neurofilaments. Human NF M has 13 of these KSP sites, while human NF H is expressed from two alleles one of which produces 44 and the other 45 KSP repeats.

Сборка и структура нейрофиламентов

Как и другие белки промежуточных филаментов, белки нейрофиламентов имеют общую центральную альфа-спиральную область, известную как домен стержня из-за своей стержневидной третичной структуры, окруженную аминотерминальными и карбокситерминальными доменами, которые преимущественно неструктурированы. Домены стержня двух белков нейрофиламентов димеризуются, образуя альфа-спиральную катушку. Два димера ассоциируют в ступенчатом антипараллельном порядке, формируя тетрамер. Считается, что этот тетрамер является основной подединицей (т.е. строительным блоком) нейрофиламента. Тетрамерные подединицы ассоциируют бок о бок, образуя филаменты единичной длины, которые затем аннелируют конец к концу, формируя зрелый полимер нейрофиламента, однако точная организация этих подединиц в полимере неизвестна, во многом из-за гетерогенного белкового состава и невозможности кристаллизовать нейрофиламенты или белки нейрофиламентов. Структурные модели обычно предполагают восемь тетрамеров (32 нейрофиламентных полипептида) в поперечном сечении филамента, но измерения линейной плотности массы указывают на то, что это число может варьироваться. Аминотерминальные домены белков нейрофиламентов содержат многочисленные сайты фосфорилирования и, по-видимому, важны для взаимодействия подединиц во время сборки филаментов. Карбокситерминальные домены, по-видимому, являются внутренне неупорядоченными доменами, лишенными альфа-спиралей или бета-листов. Различные размеры белков нейрофиламентов в значительной степени обусловлены различиями в длине карбокситерминальных доменов. Эти домены богаты кислыми и основными аминокислотными остатками. Карбокситерминальные домены NF M и NF H являются самыми длинными и подвергаются обширным посттрансляционным модификациям, таким как фосфорилирование и гликозилирование in vivo. Они радиально отходят от основной оси филамента, формируя плотную бахрому из сильно заряженных и неструктурированных областей, аналогичную щетинкам на бутылочной щетке. Эти энтропически размахивающиеся домены предположительно определяют зону исключения вокруг каждого филамента, эффективно разделяя филаменты друг от друга. Таким образом, карбокситерминальные проекции максимизируют пространственные свойства полимеров нейрофиламентов. При электронной микроскопии эти домены выглядят как проекции, называемые боковыми отростками, которые, по-видимому, контактируют с соседними филаментами.

Like other intermediate filament proteins, the neurofilament proteins all share a common central alpha helical region, known as the rod domain because of its rod like tertiary structure, flanked by amino terminal and carboxy terminal domains that are largely unstructured. The rod domains of two neurofilament proteins dimerize to form an alpha helical coiled coil. Two dimers associate in a staggered antiparallel manner to form a tetramer. This tetramer is believed to be the basic subunit (i. e. building block) of the neurofilament. Tetramer subunits associate side to side to form unit length filaments, which then anneal end to end to form the mature neurofilament polymer, but the precise organization of these subunits within the polymer is not known, largely because of the heterogeneous protein composition and the inability to crystallize neurofilaments or neurofilament proteins. Structural models generally assume eight tetramers (32 neurofilament polypeptides) in a filament cross section, but measurements of linear mass density suggest that this can vary. The amino terminal domains of the neurofilament proteins contain numerous phosphorylation sites and appear to be important for subunit interactions during filament assembly. The carboxy terminal domains appear to be intrinsically disordered domains that lack alpha helix or beta sheet. The different sizes of the neurofilament proteins are largely due to differences in the length of the carboxy terminal domains. These domains are rich in acidic and basic amino acid residues. The carboxy terminal domains of NF M and NF H are the longest and are modified extensively by post translational modifications such as phosphorylation and glycosylation in vivo. They project radially from the filament backbone to form a dense brush border of highly charged and unstructured domains analogous to the bristles on a bottle brush. These entropically flailing domains have been proposed to define a zone of exclusion around each filament, effectively spacing the filaments apart from their neighbors. In this way, the carboxy terminal projections maximize the space filling properties of the neurofilament polymers. By electron microscopy, these domains appear as projections called sidearms that appear to contact neighboring filaments.

Функция нейрофиламентов

Нейрофиламенты обнаруживаются в нейронах позвоночных, особенно в высоких концентрациях в аксонах, где они выстроены параллельно вдоль продольной оси аксона, формируя непрерывно перекрывающийся массив. Предполагается, что они выполняют функцию пространственного заполнения, увеличивая диаметр аксона. Их вклад в диаметр аксона определяется количеством нейрофиламентов в аксоне и плотностью их упаковки. Считается, что количество нейрофиламентов в аксоне определяется экспрессией генов нейрофиламентов и аксональным транспортом. Плотность упаковки филаментов определяется их боковыми отростками, которые определяют расстояние между соседними филаментами. Фосфорилирование боковых отростков, как полагают, увеличивает их растяжимость, увеличивая расстояние между соседними филаментами за счет связывания двухвалентных катионов между боковыми отростками соседних филаментов.

На ранних стадиях развития аксоны представляют собой узкие отростки, содержащие относительно немного нейрофиламентов. Аксоны, которые впоследствии миелинизируются, накапливают больше нейрофиламентов, что приводит к увеличению их калибра. После того, как аксон вырастет и установит связь с клеткой-мишенью, его диаметр может увеличиться в пять раз. Это происходит из-за увеличения количества нейрофиламентов, экспортируемых из тела нервной клетки, а также из-за замедления скорости их транспорта. В зрелых миелинизированных аксонах нейрофиламенты могут быть наиболее распространенной цитоплазматической структурой и занимать большую часть площади поперечного сечения аксона. Например, крупный миелинизированный аксон может содержать тысячи нейрофиламентов в одном поперечном сечении.

Транспорт нейрофиламентов

В дополнение к своей структурной роли в аксонах, нейрофиламенты также служат грузом для аксонового транспорта. Эти собранные полимеры нейрофиламентов транспортируются вдоль аксона по микротрубочкам, движимым микротрубочковыми моторными белками. Филаменты перемещаются в обоих направлениях, то есть как к концу аксона (антероградно), так и к телу клетки (ретроградно), однако преобладающее направление – антероградное. Скорость движения филаментов достигает 8 мкм/с на коротких промежутках времени (секунды или минуты), при этом средняя скорость составляет около 1 мкм/с. Однако, средняя скорость на больших временных масштабах (часы или дни) невелика, поскольку движения происходят редко и состоят из кратковременных рывков, прерываемых длительными паузами. Таким образом, на больших временных масштабах нейрофиламенты перемещаются в составе медленного компонента аксонального транспорта.

Клинические и исследовательские применения

Разработаны и доступны в продаже многочисленные специфические антитела к белкам нейрофиламентов. Эти антитела могут использоваться для обнаружения белков нейрофиламентов в клетках и тканях с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии или иммуногистохимии. Такие антитела широко применяются для идентификации нейронов и их отростков в гистологических срезах и в культурах тканей. Промежуточный филаментный белок типа VI, нестин, экспрессируется в развивающихся нейронах и глиальных клетках. Нестин рассматривается как маркер нейрональных стволовых клеток, и его присутствие широко используется для определения нейрогенеза. Этот белок утрачивается по мере развития. Антитела к нейрофиламентам также часто используются в диагностической нейропатологии. Окрашивание с их помощью позволяет отличить нейроны (положительные по белкам нейрофиламента) от глии (отрицательные по белкам нейрофиламента). Существует также значительный клинический интерес к использованию белков нейрофиламентов в качестве биомаркеров аксонального повреждения при заболеваниях, поражающих центральную нервную систему. При дегенерации нейронов или аксонов белки нейрофиламентов высвобождаются в кровь или спинномозговую жидкость. Иммуноанализы белков нейрофиламентов в спинномозговой жидкости и плазме могут, таким образом, служить индикаторами аксонального повреждения при неврологических расстройствах. Уровни NF L в крови и спинномозговой жидкости являются, следовательно, полезными маркерами для мониторинга течения амиотрофического бокового склероза, рассеянного склероза и, в последнее время, болезни Гентингтона. Также оценивалась возможность использования NF L в качестве прогностического маркера функционального исхода после острого ишемического инсульта. Мутантные мыши с аномалиями нейрофиламентов демонстрируют фенотипы, сходные с амиотрофическим латеральным склерозом. Недавние исследования, проведенные в сотрудничестве EnCor Biotechnology Inc. и Университета Флориды, показали, что антитела к NF L, используемые в наиболее распространенных анализах NF L, специфичны к расщепленным формам NF L, образующимся в результате протеолиза, индуцированного гибелью клеток.