Фибронектин: структура, функции и роль в регенерации тканей.

Введение

Белки, участвующие в клеточной адгезии, росте клеток, миграции клеток и дифференцировке.

Фибронектин – высокомолекулярный (~500–600 кДа) гликопротеин внеклеточного матрикса, который связывается с трансмембранными рецепторными белками, называемыми интеграми. Фибронектин также связывается с другими белками внеклеточного матрикса, такими как коллаген, фибрин и гепарансульфатные протеогликаны (например, синдеканы). Фибронектин существует в виде белкового димера, состоящего из двух почти идентичных мономеров, соединенных парой дисульфидных связей.

Структура

Фибронектин существует в виде белкового димера, состоящего из двух почти идентичных полипептидных цепей, связанных парой C-концевых дисульфидных связей. Каждая субъединица фибронектина имеет молекулярную массу ~230–~275 кДа и содержит три типа модулей: тип I, II и III. Все три модуля состоят из двух антипараллельных β-листов, формируя бета-сэндвич; однако модули типа I и II стабилизированы внутрицепочечными дисульфидными связями, в то время как модули типа III не содержат дисульфидных связей. Отсутствие дисульфидных связей в модулях типа III позволяет им частично разворачиваться под воздействием силы. Вдоль протяженности протомера фибронектина происходит три области переменного сплайсинга. Один или оба "дополнительных" модуля типа III (EIIIA и EIIIB) могут присутствовать в клеточном фибронектине, но отсутствуют в плазменном фибронектине. "Переменная" V-область существует между III14 и III15 (14-м и 15-м модулями типа III). Структура V-области отличается от структуры модулей типа I, II и III, и ее присутствие и длина могут варьироваться. V-область содержит сайт связывания для α4β1-интегринов. Она присутствует в большинстве клеточных фибронектинов, но только одна из двух субъединиц в димере плазменного фибронектина содержит последовательность V-области. Модули организованы в несколько функциональных и белково-связывающих доменов вдоль мономера фибронектина. Существует четыре домена связывания фибронектина, позволяющие ему ассоциировать с другими молекулами фибронектина. Фибронектин также содержит домены для связывания с фибрином (I1–5, I10–12), коллагеном (I6–9), фибулином 1 (III13–14), гепарином и синдеканом (III12–14). Вместе с фибрином, плазменный фибронектин откладывается на месте повреждения, формируя кровяной сгусток, который останавливает кровотечение и защищает нижележащие ткани. По мере восстановления поврежденной ткани фибробласты и макрофаги начинают ремоделировать область, разрушая белки, формирующие временную матрицу сгустка крови, и заменяя их матрицей, более похожей на нормальную окружающую ткань. Фибробласты секретируют протеазы, включая матричные металлопротеиназы, которые расщепляют плазменный фибронектин, после чего фибробласты секретируют клеточный фибронектин и собирают его в нерастворимую матрицу. Фрагментация фибронектина протеазами, как предполагается, способствует сокращению раны – критическому этапу заживления. Фрагментированный фибронектин дополнительно обнажает свою V-область, содержащую сайт связывания α4β1-интегрина. Считается, что эти фрагменты фибронектина усиливают связывание клеток, экспрессирующих α4β1-интегрин, позволяя им прикрепляться и с силой сокращать окружающую матрицу. Фибронектин необходим для эмбриогенеза, и инактивация гена фибронектина приводит к ранней эмбриональной летальности. Фибронектин играет важную роль в направлении прикрепления и миграции клеток во время эмбрионального развития. В развитии млекопитающих отсутствие фибронектина приводит к дефектам развития мезодермы, нервной трубки и сосудов. Аналогично, отсутствие нормальной фибронектиновой матрицы у развивающихся земноводных вызывает дефекты в формировании мезодермы и ингибирует гаструляцию. Фибронектин также содержится в нормальной слюне человека, что помогает предотвратить колонизацию полости рта и глотки патогенными бактериями.

Fibronectin exists as a protein dimer, consisting of two nearly identical polypeptide chains linked by a pair of C terminal disulfide bonds. Each fibronectin subunit has a molecular weight of ~230–~275 kDa and contains three types of modules: type I, II, and III. All three modules are composed of two anti parallel β sheets resulting in a Beta sandwich; however, type I and type II are stabilized by intra chain disulfide bonds, while type III modules do not contain any disulfide bonds. The absence of disulfide bonds in type III modules allows them to partially unfold under applied force. Three regions of variable splicing occur along the length of the fibronectin protomer. One or both of the "extra" type III modules (EIIIA and EIIIB) may be present in cellular fibronectin, but they are never present in plasma fibronectin. A "variable" V region exists between III14–15 (the 14th and 15th type III module). The V region structure is different from the type I, II, and III modules, and its presence and length may vary. The V region contains the binding site for α4β1 integrins. It is present in most cellular fibronectin, but only one of the two subunits in a plasma fibronectin dimer contains a V region sequence. The modules are arranged into several functional and protein binding domains along the length of a fibronectin monomer. There are four fibronectin binding domains, allowing fibronectin to associate with other fibronectin molecules. Fibronectin also contains domains for fibrin binding (I1–5, I10–12), collagen binding (I6–9), fibulin 1 binding (III13–14), heparin binding and syndecan binding (III12–14). Along with fibrin, plasma fibronectin is deposited at the site of injury, forming a blood clot that stops bleeding and protects the underlying tissue. As repair of the injured tissue continues, fibroblasts and macrophages begin to remodel the area, degrading the proteins that form the provisional blood clot matrix and replacing them with a matrix that more resembles the normal, surrounding tissue. Fibroblasts secrete proteases, including matrix metalloproteinases, that digest the plasma fibronectin, and then the fibroblasts secrete cellular fibronectin and assemble it into an insoluble matrix. Fragmentation of fibronectin by proteases has been suggested to promote wound contraction, a critical step in wound healing. Fragmenting fibronectin further exposes its V region, which contains the site for α4β1 integrin binding. These fragments of fibronectin are believed to enhance the binding of α4β1 integrin expressing cells, allowing them to adhere to and forcefully contract the surrounding matrix. Fibronectin is necessary for embryogenesis, and inactivating the gene for fibronectin results in early embryonic lethality. Fibronectin is important for guiding cell attachment and migration during embryonic development. In mammalian development, the absence of fibronectin leads to defects in mesodermal, neural tube, and vascular development. Similarly, the absence of a normal fibronectin matrix in developing amphibians causes defects in mesodermal patterning and inhibits gastrulation. Fibronectin is also found in normal human saliva, which helps prevent colonization of the oral cavity and pharynx by pathogenic bacteria.

Сборка матрицы

Клеточный фибронектин собирается в нерастворимую фибриллярную матрицу в сложном, опосредованном клетками процессе. Сборка матрицы фибронектина начинается с секреции растворимыми, компактными димерами фибронектина из клеток, часто фибробластов. Эти растворимые димеры связываются с α5β1-интегриновыми рецепторами на поверхности клеток и способствуют их кластеризации. Локальная концентрация фибронектина, связанного с интегралином, возрастает, что облегчает взаимодействие между молекулами фибронектина. Затем между соседними клетками начинают формироваться короткие фибронектиновые фибриллы. По мере продвижения сборки матрицы растворимые фибриллы превращаются в более крупные нерастворимые фибриллы, составляющие внеклеточный матрикс. Переход фибронектина от растворимого состояния к нерастворимым фибриллам происходит при экспонировании скрытых участков связывания фибронектина вдоль молекулы фибронектина, связанной с рецептором. Считается, что клетки растягивают фибронектин, оказывая натяжение на связанные с ним интегральные рецепторы. Эта сила частично разворачивает лиганд фибронектина, обнажая скрытые участки связывания и позволяя соседним молекулам фибронектина ассоциироваться. Это взаимодействие фибронектин-фибронектин позволяет растворимым, связанным с клетками фибриллам ветвиться и стабилизироваться, формируя нерастворимую фибронектиновую матрицу. Показано, что трансмембранный белок CD93 необходим для сборки фибронектиновой матрицы (фибриллогенеза) в эндотелиальных клетках кожи человека. Соответственно, подавление экспрессии CD93 в этих клетках приводило к нарушению фибронектинового фибриллогенеза. Кроме того, у мышей с нокаутом гена CD93 в сетчатке наблюдались нарушения фибронектиновой матрицы на фронте прорастания сосудов сетчатки. Фибронектин вовлечен в развитие карциномы. При карциноме легких экспрессия фибронектина повышена, особенно при немелкоклеточном раке легких. Адгезия клеток карциномы легких к фибронектину усиливает опухолеобразование и придает устойчивость к химиотерапевтическим препаратам, индуцирующим апоптоз. Показано, что фибронектин стимулирует выработку гонадальных стероидов, взаимодействующих с рецепторами андрогенов у позвоночных, которые способны контролировать экспрессию циклинов D и связанных с ними генов, участвующих в контроле клеточного цикла. Эти наблюдения позволяют предположить, что фибронектин может способствовать росту и выживаемости опухолей легких, а также устойчивости к терапии, и может представлять собой новую мишень для разработки противораковых препаратов. Фибронектин 1 может служить потенциальным биомаркером радиорезистентности и для прогноза при различных видах рака. Слияние FN1 и FGFR1 часто встречается при фосфатурных мезенхимальных опухолях.

Cellular fibronectin is assembled into an insoluble fibrillar matrix in a complex cell mediated process. Fibronectin matrix assembly begins when soluble, compact fibronectin dimers are secreted from cells, often fibroblasts. These soluble dimers bind to α5β1 integrin receptors on the cell surface and aid in clustering the integrins. The local concentration of integrin bound fibronectin increases, allowing bound fibronectin molecules to more readily interact with one another. Short fibronectin fibrils then begin to form between adjacent cells. As matrix assembly proceeds, the soluble fibrils are converted into larger insoluble fibrils that comprise the extracellular matrix. Fibronectin's shift from soluble to insoluble fibrils proceeds when cryptic fibronectin binding sites are exposed along the length of a bound fibronectin molecule. Cells are believed to stretch fibronectin by pulling on their fibronectin bound integrin receptors. This force partially unfolds the fibronectin ligand, unmasking cryptic fibronectin binding sites and allowing nearby fibronectin molecules to associate. This fibronectin fibronectin interaction enables the soluble, cell associated fibrils to branch and stabilize into an insoluble fibronectin matrix. A transmembrane protein, CD93, has been shown to be essential for fibronectin matrix assembly (fibrillogenesis) in human dermal blood endothelial cells. As a consequence, knockdown of CD93 in these cells resulted in the disruption of the fibronectin fibrillogenesis. Moreover, the CD93 knockout mice retinas displayed disrupted fibronectin matrix at the retinal sprouting front. Fibronectin has been implicated in carcinoma development. In lung carcinoma, fibronectin expression is increased especially in non small cell lung carcinoma. The adhesion of lung carcinoma cells to fibronectin enhances tumorigenicity and confers resistance to apoptosis inducing chemotherapeutic agents. Fibronectin has been shown to stimulate the gonadal steroids that interact with vertebrate androgen receptors, which are capable of controlling the expression of cyclin D and related genes involved in cell cycle control. These observations suggest that fibronectin may promote lung tumor growth/survival and resistance to therapy, and it could represent a novel target for the development of new anticancer drugs. Fibronectin 1 acts as a potential biomarker for radioresistance and for pan cancer prognosis. FN1 FGFR1 fusion is frequent in phosphaturic mesenchymal tumours.

Роль в заживлении ран

Фибронектин оказывает глубокое воздействие на заживление ран, включая формирование подходящего субстрата для миграции и роста клеток в процессе развития и организации грануляционной ткани, а также ремоделирование и ресинтез матрицы соединительной ткани. Биологическая значимость фибронектина in vivo изучалась в механизме заживления ран. Фибронектин локализуется во внеклеточном матриксе эмбриональных и взрослых тканей (но не в базальных мембранах взрослых тканей), однако может быть более широко представлен в воспалительных очагах. В процессе свертывания крови фибронектин остается связанным с кровяным сгустком, ковалентно сшитым с фибрином при помощи фактора XIII (фактора стабилизации фибрина). Фибробласты играют ключевую роль в заживлении ран, адгезируясь к фибрину. Адгезия фибробластов к фибрину требует участия фибронектина и наиболее выражена, когда фибронектин сшит с фибрином. У пациентов с дефицитом фактора XIII наблюдается замедление заживления ран, поскольку фибробласты плохо растут в фибрине, не содержащем фактор XIII. Фибронектин стимулирует фагоцитоз частиц как макрофагами, так и фибробластами. Отложение коллагена в области раны фибробластами происходит при участии фибронектина. Фибронектин также тесно ассоциирован с вновь образованными коллагеновыми фибриллами. Судя по размеру и гистологическим характеристикам окрашивания фибрилл, вероятно, что по крайней мере частично они состоят из коллагена III типа (ретикулина). Исследование in vitro с использованием нативного коллагена показало, что фибронектин связывается с коллагеном III типа, а не с другими его типами.

In vivo и in vitro

Плазменный фибронектин, синтезируемый гепатоцитами, и фибронектин, синтезируемый культивируемыми фибробластами, схожи, но не идентичны; сообщалось об иммунологических, структурных и функциональных различиях.

Генетическая вариация фибронектина как защитный фактор от болезни Альцгеймера

В многоцентровом, многоэтническом генетико-эпидемиологическом исследовании с применением функциональной геномики было показано, что специфическая генетическая вариация гена Fibronectin снижает риск развития болезни Альцгеймера. Предполагается, что этот эффект связан с усилением способности мозга удалять токсичные отходы и накопление белков через гематоэнцефалический барьер.