Введение

Биохимический тест для определения белка или другой молекулы с использованием антитела.

Иммуноанализ (ИА) – это биохимический тест, который измеряет присутствие или концентрацию макромолекулы или небольшой молекулы в растворе посредством использования антитела (обычно) или антигена (иногда). Молекула, определяемая в иммуноанализе, часто называется "аналитом" и в большинстве случаев является белком, хотя это могут быть и другие типы молекул, различных размеров и типов, при условии разработки соответствующих антител, обладающих необходимыми свойствами для проведения анализа. Аналиты в биологических жидкостях, таких как сыворотка или моча, часто измеряются с использованием иммуноанализов в медицинских и исследовательских целях. Иммуноанализы представлены в различных форматах и вариантах. Иммуноанализы могут выполняться в несколько этапов, с добавлением и последующим удалением или разделением реагентов на разных стадиях анализа. Многоступенчатые анализы часто называют иммуноанализами разделения или гетерогенными иммуноанализами. Некоторые иммуноанализы можно проводить, просто смешивая реагенты и образцы и выполняя физическое измерение. Такие анализы называются гомогенными иммуноанализами или, реже, неразделяющими иммуноанализами. В иммуноанализах часто используется калибратор. Калибраторы – это растворы, известные содержание аналита, и концентрация этого аналита, как правило, определена. Сравнение ответа анализа на реальный образец с ответом анализа, полученным для калибраторов, позволяет интерпретировать силу сигнала с точки зрения присутствия или концентрации аналита в образце.

Принцип

Иммуноанализы основаны на способности антитела распознавать и связывать определенную макромолекулу в сложной смеси макромолекул. В иммунологии конкретная макромолекула, с которой связывается антитело, называется антигеном, а участок на антигене, к которому антитело присоединяется, – эпитопом. В некоторых случаях иммуноанализ может использовать антиген для выявления антител, распознающих этот антиген, в растворе. Иными словами, в некоторых иммуноанализах аналитом может выступать антитело, а не антиген. Помимо связывания антитела с антигеном, ключевой особенностью всех иммуноанализов является возможность генерации измеримого сигнала в ответ на это связывание. В большинстве, хотя и не во всех, иммуноанализов антитела или антигены химически связывают с каким-либо детектируемым маркером. В современных иммуноанализах существует множество маркеров, позволяющих проводить обнаружение различными способами. Многие маркеры обнаруживаются благодаря тому, что они излучают радиацию, изменяют цвет раствора, флуоресцируют под воздействием света или могут быть индуцированы к люминесценции.

Этикетки

В иммуноанализах используются различные метки для обнаружения антител и антигенов. Метки обычно химически связывают или конъюгируют с нужным антителом или антигеном.

Ферменты

Возможно, одним из самых популярных индикаторов, используемых в иммуноанализах, являются ферменты. Иммуноанализы, в которых применяются ферменты, называются ферментными иммуноанализами (EIA), среди которых наиболее распространены ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) и метод иммуноанализа с усилением ферментом (EMIT). Ферменты, используемые в ELISA, включают пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP) или глюкозооксидазу. Эти ферменты обеспечивают возможность обнаружения, часто благодаря тому, что они вызывают наблюдаемое изменение цвета в присутствии определенных реагентов. В некоторых случаях эти ферменты подвергаются воздействию реагентов, которые заставляют их излучать свет или проявлять хемолюминесценцию. Существуют несколько типов ELISA: прямой, непрямой, сэндвич-анализ и конкурентный анализ.

Радиоактивные изотопы

Радиоактивные изотопы могут быть включены в реагенты иммуноанализа для проведения радиоиммуноанализа (РИА). Радиоактивность, испускаемая комплексами антиген-антитело, может быть легко обнаружена с помощью стандартных методов. РИА были одними из первых разработанных иммуноанализов, но их использование значительно сократилось в основном из-за сложностей и потенциальных опасностей, связанных с работой с радиоактивными веществами.

Репортеры ДНК

Новый подход к иммуноанализу заключается в сочетании количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT qPCR) и традиционных методов иммуноанализа. Этот метод, называемый иммуноколичественной ПЦР в реальном времени (iqPCR), использует в качестве метки ДНК-зонд.

Фтористые репортеры

Флуорогенные репортеры, такие как фикоэритрин, используются во многих современных иммуноанализах. Протеиновые микромассивы – это тип иммуноанализа, который часто использует флуорогенные репортеры.

Электрохимиолюминесцентные метки

Некоторые метки работают по принципу электрохемилюминесценции (ECL), при котором метка излучает обнаружимый свет в ответ на электрический ток.

Иммуноанализы без маркировки

Хотя в иммуноанализах обычно используется какая-либо метка, существуют определенные виды анализов, которые не требуют использования меток, а вместо этого применяют методы обнаружения, не требующие модификации или маркировки компонентов анализа. Поверхностный плазмонный резонанс – пример метода, способного обнаруживать связывание между немеченым антителом и антигенами. Другой продемонстрированный беcмаркерный иммуноанализ заключается в измерении изменения сопротивления электрода при связывании с ним антигенов.

Классификации и форматы

Иммуноанализы могут выполняться в различных форматах. Обычно иммуноанализ относится к одной из нескольких категорий в зависимости от способа его проведения.

Конкурентные, однородные иммуноанализы

В конкурентном, однородном иммуноанализе немаркированный аналит в образце конкурирует с маркированным аналитом за связывание с антителом. Затем измеряется количество не связанного маркированного аналита. Теоретически, чем больше аналита в образце, тем больше маркированного аналита вытесняется и, следовательно, измеряется; таким образом, количество не связанного маркированного аналита пропорционально количеству аналита в образце. Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ (FPIA) измеряет сигнал флуоресцентной поляризации после инкубации, не разделяя связанные и свободные метки. В образец добавляются свободные молекулы маркированного аналога аналита, и их броуновское движение различается в зависимости от того, связаны они с большим антителом (Ab) или находятся в свободном состоянии в растворе. Аналит конкурирует за связывание с Ab, и если маркированный аналит связывается с Ab, генерируется сигнал. Интенсивность сигнала обратно пропорциональна концентрации аналита. В частности, это качественные тесты, определяющие наличие ХГЧ с использованием системы латерального потока. Быстрый антигенный тест на COVID-19 также является качественным тестом латерального потока. Другие клинические иммуноанализы являются количественными; они измеряют количество вещества. Иммуноанализы могут измерять уровни КФК-МВ для оценки заболеваний сердца, инсулина для оценки гипогликемии, простат-специфического антигена для выявления рака простаты, а некоторые также используются для обнаружения и/или количественного определения определенных фармацевтических соединений (см. технику иммуноанализа с ферментным умножением для получения более подробной информации). Тестирование на наркотики также начинается с быстрого качественного иммуноанализа.

Анализ спортивных допинговых

Иммуноанализы используются в спортивных антидопинговых лабораториях для тестирования образцов крови спортсменов на наличие запрещенного рекомбинантного гормона роста человека (rhGH, rGH, hGH, GH).

Фотоакустический иммуноанализ

Фотоакустический иммуноанализ измеряет низкочастотные акустические сигналы, генерируемые металлическими наночастицами-метками. При облучении модулированным светом на длине волны плазмонного резонанса, наночастицы генерируют сильный акустический сигнал, который можно измерить с помощью микрофона. Фотоакустический иммуноанализ может быть применен в экспресс-тестах (или тестах с боковым потоком), использующих коллоидные наночастицы.