Диэтилкарбонат (DEPC): применение для инактивации РНКаз и модификации белков.
Diethyl pyrocarbonate
DEPC (диэтилпирокарбонат): обработка воды для РНК-исследований. Инактивация РНКаз, модификация аминокислот, удаление DEPC автоклавированием. Лабораторное применение.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Диэтилпирокарбонат (DEPC), также называемый диэтилдикарбонатом (название IUPAC), используется в лаборатории для инактивации ферментов РНКазы в воде и на лабораторной посуде. Он делает это посредством ковалентной модификации гистидина (наиболее сильно), лизина, цистеина и тирозина. Вода, обработанная DEPC (и, следовательно, свободная от РНКазы), используется при работе с РНК в лаборатории для снижения риска деградации РНК РНКазами. Обычно воду обрабатывают 0,1% (об/об) DEPC не менее 2 часов при 37 °C, а затем автоклавируют (не менее 15 минут) для инактивации следов DEPC. Инактивация DEPC таким образом приводит к образованию CO2 и этанола. Более высокие концентрации DEPC способны деактивировать большие количества РНКазы, но остаточные следы или побочные продукты могут ингибировать дальнейшие биохимические реакции, такие как in vitro транскрипция. Кроме того, возможна химическая модификация РНК, такая как карбоксиметилирование, при наличии следов DEPC или его побочных продуктов, что приводит к нарушению восстановления неповрежденной РНК даже после обмена буфера (после осаждения). DEPC нестабилен в воде и подвержен гидролизу до углекислого газа и этанола, особенно в присутствии нуклеофила. По этой причине DEPC нельзя использовать с буферами Tris или HEPES. Напротив, его можно использовать с фосфатно-солевым буфером или MOPS. Полезным правилом является то, что ферменты или химические вещества, содержащие активные группы O:, N: или S:, нельзя обрабатывать DEPC для удаления РНКазы, поскольку DEPC реагирует с этими группами. Кроме того, продукты деградации DEPC могут ингибировать in vitro транскрипцию. Дериватизация гистидинов с помощью DEPC также используется для изучения важности гистидильных остатков в ферментах. Модификация гистидина с помощью DEPC приводит к образованию карбэтоксилированных производных по N-омега-2 азоту имидазольного кольца. Модификацию гистидинов с помощью DEPC можно обратить, обработав 0,5 М гидроксиламином при нейтральном pH. DEPC также может использоваться для исследования структуры двухцепочечной ДНК.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC), also called diethyl dicarbonate (IUPAC name), is used in the laboratory to inactivate RNase enzymes in water and on laboratory utensils. It does so by the covalent modification of histidine (most strongly), lysine, cysteine, and tyrosine residues. DEPC treated (and therefore RNase free) water is used in handling of RNA in the laboratory to reduce the risk of RNA being degraded by RNases. Water is usually treated with 0.1% v/v DEPC for at least 2 hours at 37 °C and then autoclaved (at least 15 min) to inactivate traces of DEPC. Inactivation of DEPC in this manner yields CO2 and ethanol. Higher concentrations of DEPC are capable of deactivating larger amounts of RNase, but remaining traces or byproducts may inhibit further biochemical reactions such as in vitro transcription. Furthermore, chemical modification of RNA such as carboxymethylation is possible when traces of DEPC or its byproducts are present, resulting in impaired recovery of intact RNA even after buffer exchange (after precipitation). DEPC is unstable in water and susceptible to hydrolysis to carbon dioxide and ethanol, especially in the presence of a nucleophile. For this reason, DEPC cannot be used with Tris or HEPES buffers. In contrast, it can be used with phosphate buffered saline or MOPS. A handy rule is that enzymes or chemicals which have active O:, N: or S: cannot be treated with DEPC to become RNase free, as DEPC reacts with these species. Furthermore, DEPC degradation products can inhibit in vitro transcription. DEPC derivatization of histidines is also used to study the importance of histidyl residues in enzymes. Modification of histidine by DEPC results in carbethoxylated derivates at the N omega 2 nitrogen of the imidazole ring. DEPC modification of histidines can be reversed by treatment with 0.5 M hydroxylamine at neutral pH. DEPC can also be used for probing the structure of double stranded DNA.