Одноцепочечные фрагменты антител: структура, свойства и применение.
Single-chain variable fragment
scFv фрагменты: структура, свойства и применение в биохимии. Синтетические белки, сохраняющие специфичность антител, но без Fc-фрагмента. Очистка протеином L.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Фрагмент
Fragment
Одноцепочечный фрагмент переменной области (scFv) фактически не является фрагментом антитела, а представляет собой белок-слияние переменных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) иммуноглобулинов, соединенных коротким линкерным пептидом из десяти до примерно 25 аминокислот. Линкер обычно богат глицином для обеспечения гибкости, а также серином или треонином для растворимости, и может соединять N-конец VH с C-концом VL или наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление постоянных областей и введение линкера.
A single chain variable fragment (scFv) is not actually a fragment of an antibody, but instead is a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins, connected with a short linker peptide of ten to about 25 amino acids. The linker is usually rich in glycine for flexibility, as well as serine or threonine for solubility, and can either connect the N terminus of the VH with the C terminus of the VL, or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite removal of the constant regions and the introduction of the linker.
Очищение
У одноцепочечных переменных фрагментов отсутствует постоянная Fc-область, присутствующая в полных молекулах антител, и, следовательно, стандартные сайты связывания (например, белок G) нельзя использовать для очистки антител. Эти фрагменты часто можно очищать или иммобилизовать с помощью белка L, поскольку белок L взаимодействует с переменной областью легких цепей каппа. Чаще всего ученые добавляют шестигистидиновый тег к C-концу молекулы scFv и очищают их с помощью иммобилизованной металл-аффинной хроматографии (IMAC). Некоторые scFv также могут быть захвачены белком A, если они содержат человеческий домен VH3.
Single chain variable fragments lack the constant Fc region found in complete antibody molecules, and, thus, the common binding sites (e. g., protein G) cannot be used to purify antibodies. These fragments can often be purified or immobilized using protein L, since protein L interacts with the variable region of kappa light chains. More commonly, scientists incorporate a six histidine tag on the c terminus of the scFv molecule and purify them using immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Some scFv can also be captured by protein A if they contain a human VH3 domain.
Бивалентные и тривалентные свф
Дивалентные (или бивалентные) одноцепочечные переменные фрагменты (di scFvs, bi scFvs) могут быть получены путем объединения двух scFvs. Это достигается созданием единой пептидной цепи, содержащей две VH и две VL области, что приводит к тандемным scFvs. Альтернативный подход – создание scFvs с линкерными пептидами, слишком короткими для сворачивания двух вариабельных областей вместе (около пяти аминокислот), что вынуждает scFvs димеризоваться. Этот тип известен как диабоди. Показано, что диабоди обладают константами диссоциации до 40 раз ниже, чем соответствующие scFvs, что свидетельствует о значительно более высоком сродстве к мишени. Следовательно, лекарственные препараты на основе диабоди могут применяться в более низких дозах, чем другие терапевтические антитела, и способны к высокоспецифичному нацеливанию на опухоли in vivo. Еще более короткие линкеры (одна или две аминокислоты) приводят к образованию тримеров, называемых триабоди или трибоди. Также были получены тетрабоди, демонстрирующие еще более высокое сродство к своим мишеням, чем диабоди. Все эти форматы могут состоять из вариабельных фрагментов, специфичных к двум различным антигенам, в таком случае они представляют собой типы биспецифических антител. Наиболее разработанными из них являются биспецифические тандемные di scFvs, известные как биспецифические T-клеточные активаторы (конструкции антител BiTE).
Divalent (or bivalent) single chain variable fragments (di scFvs, bi scFvs) can be engineered by linking two scFvs. This can be done by producing a single peptide chain with two VH and two VL regions, yielding tandem scFvs. Another possibility is the creation of scFvs with linker peptides that are too short for the two variable regions to fold together (about five amino acids), forcing scFvs to dimerize. This type is known as diabodies. Diabodies have been shown to have dissociation constants up to 40 fold lower than corresponding scFvs, meaning that they have a much higher affinity to their target. Consequently, diabody drugs could be dosed much lower than other therapeutic antibodies and are capable of highly specific targeting of tumors in vivo. Still shorter linkers (one or two amino acids) lead to the formation of trimers, so called triabodies or tribodies. Tetrabodies have also been produced. They exhibit an even higher affinity to their targets than diabodies. All of these formats can be composed from variable fragments with specificity for two different antigens, in which case they are types of bispecific antibodies. The furthest developed of these are bispecific tandem di scFvs, known as bi specific T cell engagers (BiTE antibody constructs).