Многолокусная секвенция типирования микроорганизмов

Введение

Метод молекулярной биологии для типирования микроорганизмов

Мультилокусное секвенирование типов (MLST) – это метод молекулярной биологии для типирования по нескольким локусам, использующий последовательности ДНК внутренних фрагментов множества генов домашнего хозяйства для характеристики изолятов микробных видов. Первая схема MLST была разработана для Neisseria meningitidis, возбудителя менингококкового менингита и септицемии. С момента внедрения для изучения эволюционной истории, MLST используется не только для патогенов человека, но и для патогенов растений.

Принцип

MLST непосредственно измеряет вариации последовательности ДНК в наборе генов домашнего хозяйства и характеризует штаммы по их уникальным аллельным профилям. Принцип MLST прост: метод включает в себя ПЦР-амплификацию с последующим секвенированием ДНК. Нуклеотидные различия между штаммами могут быть проверены по переменному числу генов в зависимости от требуемой степени дискриминации. Рабочий процесс MLST включает в себя: 1) сбор данных, 2) анализ данных и 3) многолокусный анализ последовательностей. На этапе сбора данных окончательная идентификация вариаций достигается путем определения нуклеотидной последовательности фрагментов генов. На этапе анализа данных всем уникальным последовательностям присваиваются номера аллелей, они объединяются в аллельный профиль и получают тип последовательности (ST). Если обнаруживаются новые аллели и ST, они хранятся в базе данных после верификации. На заключительном этапе анализа MLST родство изолятов определяется путем сравнения аллельных профилей. Исследователи проводят эпидемиологические и филогенетические исследования, сравнивая ST различных клональных комплексов. В процессе секвенирования и идентификации генерируется большой объем данных, поэтому для организации, управления, анализа и объединения всех биологических данных используются биоинформатические методы. Для достижения баланса между приемлемой идентификационной способностью, временем и стоимостью типирования штаммов в лабораториях обычно используется около семи-восьми генов домашнего хозяйства. В качестве примера, для типирования MLST *Staphylococcus aureus* используются семь генов домашнего хозяйства, включая карбамат-киназу (arcC), шикимат-дегидрогеназу (aroE), глицерол-киназу (glpF), гуанилат-киназу (gmk), фосфат-ацетилтрансферазу (pta), триозофосфат-изомеразу (tpi) и ацетил-коэнзим А ацетилтрансферазу (yqiL), как указано на веб-сайте MLST. Однако нередко используется до десяти генов домашнего хозяйства. Для *Vibrio vulnificus* используются гены домашнего хозяйства: глюкозо-6-фосфат-изомераза (glp), ДНК-гираза, субъединица B (gyrB), малолат-лактат-дегидрогеназа (mdh), метионил-тРНК-синтетаза (metG), фосфорибозиламиноимидазольный синтетаза (purM), треониновая дегидрогеназа (dtdS), диаминопимелат-декарбоксилаза (lysA), трансгидрогеназа альфа-субъединица (pntA), дигидрооротаза (pyrC) и триптофаназа (tnaA). Таким образом, как количество, так и тип генов домашнего хозяйства, исследуемых MLST, могут различаться в зависимости от вида. Для каждого из этих генов домашнего хозяйства различные последовательности обозначаются как аллели, а аллели в локусах формируют аллельный профиль. Серия профилей может служить идентификационным маркером для типирования штаммов. Последовательности, различающиеся даже на один нуклеотид, обозначаются как разные аллели, и не применяется никакого взвешивания для учета количества нуклеотидных различий между аллелями, поскольку невозможно определить, являются ли различия в нескольких нуклеотидных участках результатом множественных точечных мутаций или единичного рекомбинационного обмена. Большое количество потенциальных аллелей в каждом локусе позволяет различать миллиарды различных аллельных профилей, и вероятность случайного обнаружения штамма с наиболее распространенным аллелем в каждом локусе составляет примерно один случай на 10 000 изолятов. Несмотря на высокую дискриминационную способность MLST, накопление нуклеотидных изменений в генах домашнего хозяйства – относительно медленный процесс, а аллельный профиль бактериального изолята достаточно стабилен во времени, что делает метод идеальным для глобальной эпидемиологии. Родство изолятов отображается в виде дендрограммы, построенной на основе матрицы попарных различий между их аллельными профилями, eBURST или минимального остовного дерева (MST). Дендрограмма – это лишь удобный способ отображения изолятов с идентичными или очень похожими аллельными профилями, которые, предположительно, произошли от общего предка; отношения между изолятами, различающимися более чем по трем из семи локусов, вероятно, ненадежны и не должны использоваться для определения их филогенеза. MST соединяет все образцы таким образом, чтобы суммарное расстояние по всем ветвям дерева было минимальным. Альтернативно, родство изолятов также можно проанализировать с помощью многолокусного анализа последовательностей (MLSA). Этот метод не использует назначенные аллели, а вместо этого конкатенирует последовательности фрагментов генов домашнего хозяйства и использует эту конкатенированную последовательность для определения филогенетических взаимосвязей. В отличие от MLST, этот анализ присваивает более высокую степень сходства последовательностям, различающимся только на один нуклеотид, и более низкую степень сходства последовательностям с множественными нуклеотидными различиями. В результате этот анализ больше подходит для организмов с клональной эволюцией и менее подходит для организмов, в которых часто происходят рекомбинационные события. Его также можно использовать для определения филогенетических взаимосвязей между близкородственными видами. Термины MLST и MLSA часто считаются взаимозаменяемыми, однако это неверно, поскольку каждый метод анализа имеет свои отличительные особенности и области применения. Следует соблюдать осторожность при использовании правильного термина.

MLST directly measures the DNA sequence variations in a set of housekeeping genes and characterizes strains by their unique allelic profiles. The principle of MLST is simple: the technique involves PCR amplification followed by DNA sequencing. Nucleotide differences between strains can be checked at a variable number of genes depending on the degree of discrimination desired. The workflow of MLST involves: 1) data collection, 2) data analysis and 3) multilocus sequence analysis. In the data collection step, definitive identification of variation is obtained by nucleotide sequence determination of gene fragments. In the data analysis step, all unique sequences are assigned allele numbers and combined into an allelic profile and assigned a sequence type (ST). If new alleles and STs are found, they are stored in the database after verification. In the final analysis step of MLST, the relatedness of isolates are made by comparing allelic profiles. Researchers do epidemiological and phylogenetical studies by comparing STs of different clonal complexes. A huge set of data is produced during the sequencing and identification process so bioinformatic techniques are used to arrange, manage, analyze and merge all of the biological data. To strike the balance between the acceptable identification power, time and cost for the strain typing, about seven to eight house keeping genes are commonly used in the laboratories. Quoting Staphylococcus aureus as an example, seven housekeeping genes are used in MLST typing. These genes include carbamate kinase (arcC), shikimate dehydrogenase (aroE), glycerol kinase (glpF), guanylate kinase (gmk), phosphate acetyltransferase (pta), triosephosphate isomerase (tpi) and acetyl coenzyme A acetyltransferase (yqiL) as specified by the MLST website. However, it is not uncommon for up to ten housekeeping genes to be used. For Vibrio vulnificus, the housekeeping genes used are glucose 6 phosphate isomerase (glp), DNA gyrase, subunit B (gyrB), malate lactate dehydrogenase (mdh), methionyl tRNA synthetase (metG), phosphoribosylaminoimidazole synthetase (purM), threonine dehydrogenase (dtdS), diaminopimelate decarboxylase (lysA), transhydrogenase alpha subunit (pntA), dihydroorotase (pyrC) and tryptophanase (tnaA). Thus both the number and type of housekeeping genes interrogated by MLST may differ from species to species. For each of these housekeeping genes, the different sequences are assigned as alleles and the alleles at the loci provide an allelic profile. A series of profiles can then be the identification marker for strain typing. Sequences that differ at even a single nucleotide are assigned as different alleles and no weighting is given to take into account the number of nucleotide differences between alleles, as we cannot distinguish whether differences at multiple nucleotide sites are a result of multiple point mutations or a single recombinational exchange. The large number of potential alleles at each of the loci provides the ability to distinguish billions of different allelic profiles, and a strain with the most common allele at each locus would only be expected to occur by chance approximately once in 10,000 isolates. Despite MLST providing high discriminatory power, the accumulation of nucleotide changes in housekeeping genes is a relatively slow process and the allelic profile of a bacterial isolate is sufficiently stable over time for the method to be ideal for global epidemiology. The relatedness of isolates is displayed as a dendrogram constructed using the matrix of pairwise differences between their allelic profiles, eBURST or a minimum spanning tree (MST). The dendrogram is only a convenient way of displaying those isolates that have identical or very similar allelic profiles that can be assumed to be derived from a common ancestor; the relationships between isolates that differ at more than three out of seven loci are likely to be unreliable and should not be taken to infer their phylogeny. The MST connects all samples in such a way that the summed distance of all branches of the tree is minimal. Alternatively, the relatedness of isolates can also be analysed with MultiLocus Sequence Analysis (MLSA). This does not use the assigned alleles, but instead concatenates the sequences of the gene fragments of the housekeeping genes and uses this concatenated sequence to determine phylogenetic relationships. In contrast to MLST, this analysis does assign a higher similarity between sequences differing only a single nucleotide and a lower similarity between sequences with multiple nucleotide differences. As a result, this analysis is more suitable for organisms with a clonal evolution and less suitable for organisms in which recombinational events occur very often. It can also be used to determine phylogenetic relationships between closely related species. The terms MLST and MLSA are very often considered interchangeable. This is however not correct as each analysis method has its distinctive features and uses. Care should be taken to use the correct term.

Сравнение с другими методами

Ранее были разработаны методы серологического типирования для дифференцирования бактериальных изолятов, но иммунологическое типирование имеет недостатки, такие как зависимость от небольшого числа антигенных локусов и непредсказуемая реактивность антител с различными антигенными вариантами. Для определения родства патогенов было предложено несколько схем молекулярного типирования, таких как импульсный гелевый электрофорез (PFGE), риботипирование и ПЦР-фингерпринтинг. Однако эти методы субтипирования, основанные на полосах ДНК, не позволяют проводить содержательный эволюционный анализ. Несмотря на то, что многие исследователи считают PFGE «золотым стандартом», типирование многих штаммов этим методом невозможно из-за деградации ДНК в процессе (размытые полосы на геле). Подход MLST отличается от многолокусного электрофореза ферментов (MLEE), который основан на различных электрофоретических подвижностях (ЭП) нескольких ключевых метаболических ферментов. Аллели в каждом локусе определяют ЭП их продуктов, поскольку различные аминокислотные последовательности ферментов приводят к разной подвижности и, соответственно, к различным полосам при электрофорезе. Связь между изолятами затем можно визуализировать с помощью дендрограммы, построенной на основе матрицы попарных различий между электрофоретическими типами. Этот метод имеет более низкое разрешение, чем MLST, по нескольким причинам, которые связаны с тем, что фенотипическое разнообразие ферментов является лишь косвенным показателем разнообразия последовательностей ДНК. Во-первых, ферменты могут иметь разные аминокислотные последовательности, не демонстрируя при этом достаточной разницы в ЭП для формирования отчетливых полос. Во-вторых, «молчащие мутации» могут изменять последовательность ДНК гена, не изменяя кодируемые аминокислоты. В-третьих, фенотип фермента может легко изменяться в ответ на условия окружающей среды, что негативно сказывается на воспроизводимости результатов MLEE. Распространенными модификациями ферментов являются фосфорилирование, связывание кофакторов и отщепление транспортных последовательностей. Это также ограничивает сопоставимость данных MLEE, полученных в разных лабораториях, в то время как MLST предоставляет переносимые и сопоставимые данные о последовательности ДНК и обладает большим потенциалом для автоматизации и стандартизации. MLST не следует путать с ДНК-баркодированием. Последнее – это таксономический метод, использующий короткие генетические маркеры для идентификации конкретных видов эукариот. Он основан на том факте, что митохондриальная ДНК (мтДНК) или некоторые части цистрона рибосомной ДНК имеют относительно высокую скорость мутаций, что приводит к значительным различиям в последовательностях между видами. Методы, основанные на мтДНК, возможны только у эукариот (поскольку у прокариот нет митохондрий), в то время как MLST, хотя и был первоначально разработан для прокариот, теперь находит применение у эукариот и, в принципе, может быть применен к любому царству.

Earlier serological typing approaches had been established for differentiating bacterial isolates, but immunological typing has drawbacks such as reliance on few antigenic loci and unpredictable reactivities of antibodies with different antigenic variants. Several molecular typing schemes have been proposed to determine the relatedness of pathogens such as pulsed field gel electrophoresis (PFGE), ribotyping, and PCR based fingerprinting. But these DNA banding based subtyping methods do not provide meaningful evolutionary analyses. Despite PFGE being considered by many researchers as the “gold standard”, many strains are not typable by this technique due to the degradation of the DNA during the process (gel smears). The approach of MLST is distinct from Multi locus enzyme electrophoresis (MLEE), which is based on different electrophoretic mobilities (EM) of multiple core metabolic enzymes. The alleles at each locus define the EM of their products, as different amino acid sequences between enzymes result in different mobilities and distinct bands when run on a gel. The relatedness of isolates can then be visualized with a dendrogram generated from the matrix of pairwise differences between the electrophoretic types. This method has a lower resolution than MLST for several reasons, all arising from the fact that enzymatic phenotype diversity is merely a proxy for DNA sequence diversity. First, enzymes may have different amino acid sequences without having sufficiently different EM to give distinct bands. Second, "silent mutations" may alter the DNA sequence of a gene without altering the encoded amino acids. Thirdly, the phenotype of the enzyme can easily be altered in response to environmental conditions and badly affect the reproducibility of MLEE results common modifications of enzymes are phosphorylation, cofactor binding and cleavage of transport sequences. This also limits comparability of MLEE data obtained by different laboratories, whereas MLST provides portable and comparable DNA sequence data and has great potential for automation and standardization. MLST should not be confused with DNA barcoding. The latter is a taxonomic method that uses short genetic markers to recognize particular species of eukaryotes. It is based on the fact that mitochondrial DNA (mtDNA) or some parts of the ribosomal DNA cistron have relatively fast mutation rates, which give significant variation in sequences between species. mtDNA methods are only possible in eukaryotes (as prokaryotes lack mitochondria), whereas MLST, although initially developed for prokaryotes, is now finding application in eukaryotes and in principle could be applied to any kingdom.

Преимущества и применения

MLST отличается высокой однозначностью и переносимостью. Материалы, необходимые для определения ST, могут обмениваться между лабораториями. Последовательности праймеров и протоколы доступны в электронном виде. Метод воспроизводим и масштабируем. MLST автоматизирован и сочетает в себе достижения высокопроизводительного секвенирования и биоинформатики с устоявшимися методами популяционной генетики. Данные MLST могут использоваться для изучения эволюционных взаимосвязей между бактериями. MLST обладает хорошей дискриминационной способностью для дифференциации изолятов. Область применения MLST огромна, и он представляет собой ресурс для научных, медицинских и ветеринарных сообществ, а также пищевой промышленности. Ниже приведены примеры применения MLST.

Кампилобактер

Кампилобактер является частой причиной бактериальных инфекционных заболеваний кишечника, обычно возникающих при употреблении недостаточно прожаренного мяса птицы или непастеризованного молока. Однако его эпидемиология изучена недостаточно, поскольку вспышки выявляются редко, что затрудняет отслеживание источников и путей передачи инфекции. Кроме того, геномы кампилобактерий генетически разнообразны и нестабильны, подвержены частой меж- и внутригеномной рекомбинации, а также фазовой изменчивости, что осложняет интерпретацию данных, полученных с помощью многих методов типирования. До недавнего времени, с внедрением метода MLST, типирование кампилобактерий значительно продвинулось и пополнило базу данных MLST. По состоянию на 1 мая 2008 года база данных Campylobacter MLST содержит 3516 изолятов и около 30 публикаций, использующих или упоминающих MLST в исследованиях кампилобактерий (http://pubmlst.org/campylobacter/).

Нейссерия менингитидис

MLST позволил получить более детальное представление о бактериях в человеческих популяциях и о штаммовых вариантах, которые могут быть патогенными для человека, растений и животных. Метод MLST был впервые использован Maiden et al. (1) для характеристики Neisseria meningitidis, используя шесть локусов. Применение MLST позволило четко разграничить основные линии менингококков, известные как возбудители инвазивных заболеваний по всему миру. Для повышения дискриминационной способности между основными инвазивными линиями сейчас используется семь локусов, которые многие лаборатории приняли в качестве предпочтительного метода для характеристики изолятов менингококков. Хорошо известно, что в N. meningitidis часто происходят рекомбинационные обмены, приводящие к быстрой диверсификации менингококковых клонов. MLST успешно предоставил надежный метод для характеристики клонов и у других видов бактерий, у которых скорость клональной диверсификации обычно ниже.

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк)

S. aureus вызывает множество заболеваний. Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) вызывает все большую обеспокоенность из-за устойчивости практически ко всем антибиотикам, кроме ванкомицина. Однако большинство тяжелых инфекций S. aureus в сообществе и многие в больницах вызываются метициллин-чувствительными изолятами (MSSA), и было сделано мало попыток выявить гипервирулентные клоны MSSA, связанные с тяжелыми заболеваниями. Поэтому MLST был разработан для обеспечения однозначного метода характеристики клонов MRSA и идентификации клонов MSSA, ассоциированных с тяжелыми заболеваниями.

Streptococcus pyogenes (Стрептококк пиогенный)

S. pyogenes вызывает заболевания, варьирующиеся от фарингита до угрожающего жизни импетиго, включая некротизирующий фасциит. Для S. pyogenes разработана схема MLST. В настоящее время база данных (mlst.net) содержит аллельные профили изолятов, представляющих глобальное разнообразие организма, а также изоляты, выделенные при тяжелых инвазивных инфекциях.

Candida albicans (обычно в виде

C. albicans – грибковый патоген человека, вызывающий инфекции кровотока, приобретаемые в стационаре. Метод MLST используется для характеристики изолятов C. albicans. Комбинация аллелей в различных локусах формирует уникальные диплоидные типы последовательностей, которые позволяют различать штаммы. Показано, что MLST успешно применяется для изучения эпидемиологии C. albicans в больницах, а также разнообразия изолятов C. albicans, выделенных из различных экологических ниш, включая организмы человека и животных.

Кронобактер

Род Cronobacter состоит из 7 видов. До 2007 года ко всем этим организмам применялось единое видовое название Enterobacter sakazakii. Cronobacter MLST был впервые использован для различения C. sakazakii и C. malonaticus, поскольку секвенирование 16S рРНК не всегда достаточно точно, а биотипирование слишком субъективно. Схема Cronobacter MLST использует 7 аллелей: atpD, fusA, glnS, gltB, gyrB, infB и ppsA, что обеспечивает конкатенированную последовательность длиной 3036 пар оснований для филогенетического анализа (MLSA) и сравнительной геномики. MLST также применялся для официального признания новых видов Cronobacter. Этот метод выявил тесную связь между одной генетической линией, последовательным типом 4 (ST4), и случаями неонатального менингита. Сайт Cronobacter MLST находится по адресу http://www.pubMLST.org/cronobacter.

Ограничения

MLST наиболее эффективен в популяционно-генетических исследованиях, но является дорогостоящим методом. Вследствие консервативности последовательностей генов-хозяев, MLST иногда недостаточно дискриминационен для дифференциации бактериальных штаммов, что ограничивает его применение в эпидемиологических расследованиях. Для повышения дискриминационной способности MLST был разработан метод многолокусного типирования по генам вирулентности (MVLST), используемый, например, для *Listeria monocytogenes*. MVLST расширяет преимущества MLST, но ориентирован на гены вирулентности, которые могут быть более полиморфными, чем гены-хозяева. В эпидемиологической ситуации важны не только факторы популяционной генетики, но и факторы вирулентности, играющие ключевую роль в развитии заболевания, мониторинг которых затруднен при проведении популяционно-генетических исследований. Это связано с тем, что гены, определяющие вирулентность, часто подвержены высокой частоте рекомбинации и мобильны между штаммами, в отличие от генов, используемых в популяционно-генетическом анализе. Таким образом, например, при изучении *Escherichia coli* выявление штаммов, несущих гены токсинов, более важно, чем оценка популяционной генетики преобладающих штаммов. Развитие технологий секвенирования нового поколения позволило получать информацию о последовательности всего бактериального генома с относительно небольшими затратами и усилиями, и теперь MLST может быть определен на основе данных секвенирования всего генома, а не путем секвенирования каждого локуса по отдельности, как это делалось при первоначальной разработке MLST. Секвенирование всего генома предоставляет более полную информацию для дифференциации бактериальных штаммов (MLST использует приблизительно 0,1% геномной последовательности для определения типа, игнорируя остальную часть генома бактерии). Например, секвенирование целого генома большого числа изолятов показало, что единственная линия MLST ST258 *Klebsiella pneumoniae* включает в себя два различных генетических клада, что предоставляет дополнительную информацию об эволюции и распространении этих мультирезистентных организмов и опровергает предыдущую гипотезу об их едином клональном происхождении.

Базы данных

Базы данных MLST содержат эталонные аллельные последовательности и типы последовательностей для каждого организма, а также эпидемиологические данные. Веб-сайты содержат программное обеспечение для поиска и анализа, позволяющее пользователям запрашивать свои аллельные последовательности и типы последовательностей. MLST широко используется как инструмент исследователями и работниками общественного здравоохранения. В настоящее время большинство баз данных MLST размещены на веб-сервере, расположенном в Оксфордском университете (pubmlst.org). База данных, размещенная на этом сайте, содержит специфичные для организма эталонные аллельные последовательности и списки ST для отдельных организмов. Для упрощения сбора и форматирования используемых последовательностей был разработан простой и бесплатный плагин для Firefox (ссылка).