Микромассивы: принципы, типы и применение.

Введение

Маломасштабный двумерный массив образцов на твердой подложке.

Микромассив – это мультиплексная лаборатория на чипе. Его задача – одновременное обнаружение экспрессии тысяч биологических взаимодействий. Это двумерный массив на твердой подложке – обычно стеклянной пластине или кремниевой тонкой пленке – который анализирует (исследует) большие объемы биологического материала, используя высокопроизводительный скрининг, миниатюризированные, мультиплексные и параллельные методы обработки и детекции. Концепция и методология микромассивов были впервые представлены и проиллюстрированы в микромассивах антител (также называемых антительными матрицами) Це Вэнь Чан в 1983 году в научной публикации и серии патентов. Индустрия "генных чипов" начала значительно расти после статьи 1995 года в журнале Science, опубликованной лабораториями Рона Дэвиса и Пэта Брауна из Стэнфордского университета. С появлением таких компаний, как Affymetrix, Agilent, Applied Microarrays, Arrayjet, Illumina и других, технология ДНК-микромассивов стала наиболее сложной и широко используемой, в то время как применение белковых, пептидных и углеводных микромассивов расширяется. Типы микромассивов включают:
ДНК-микромассивы, такие как cDNA-микромассивы, олигонуклеотидные микромассивы, BAC-микромассивы и SNP-микромассивы
MMChips для мониторинга популяций микроРНК
Белковые микромассивы
Пептидные микромассивы для детального анализа или оптимизации белок-белковых взаимодействий
Тканевые микромассивы
Клеточные микромассивы (также называемые микромассивами трансфекции)
Микромассивы химических соединений
Микромассивы антител
Гликанные массивы (углеводные массивы)
Микромассивы фенотипов
Микромассивы белковых лизатов обратной фазы, микромассивы лизатов или сыворотки
Интерферометрический датчик отражательной визуализации (IRIS)

Специалисты в области CMOS-биотехнологий разрабатывают новые типы микромассивов. После введения магнитных наночастиц отдельные клетки могут перемещаться независимо и одновременно на микромассиве магнитных катушек. Ведется разработка микромассива ядерных магнитно-резонансных микрокатушек.

Изготовление и эксплуатация микроареев

Большое количество технологий лежит в основе платформы микромассивов, включая материальные подложки, нанесение биомолекулярных массивов и микрофлюидную упаковку массивов. Микромассивы можно классифицировать по способу физической изоляции каждого элемента массива: нанесением (созданием небольших физических лунок), синтезом на чипе (синтезом целевых ДНК-зондов, прикрепленных непосредственно к массиву) или на основе бусин (прикреплением образцов к бусинам с кодовой маркировкой, случайным образом распределенным по массиву).

Производственный процесс

Первоначальная публикация о процессе производства микрочипов датируется 1995 годом, когда 48 cDNA растений были нанесены на стеклянный слайд, обычно используемый для световой микроскопии. Современные микрочипы, напротив, теперь включают тысячи зондов и различные носители с покрытиями. Для изготовления микрочипов требуется как биологическая, так и физическая информация, включая библиотеки образцов, принтеры и подложки слайдов. При этом все процедуры и растворы всегда зависят от используемой технологии изготовления. Основной принцип микрочипа заключается в нанесении на слайд нескольких тысяч небольших пятен растворов, содержащих различные виды зондов. Современные принтеры оснащены HEPA-фильтрами и поддерживают контролируемую влажность и температуру окружающей среды, обычно около 25°C и 50% влажности. Ранние микрочипы наносились непосредственно на поверхность с помощью печатных головок принтера, которые осаждали образцы в заданном пользователем порядке на слайде. Современные методы быстрее, дают меньше перекрестного загрязнения и обеспечивают лучшую морфологию пятен. Поверхность, на которую наносятся зонды, должна быть чистой, свободной от пыли и гидрофобной, особенно для микрочипов высокой плотности. Покрытия для слайдов включают поли-L-лизин, аминосилан, эпоксид и другие, в том числе решения от производителей, и выбираются в зависимости от типа используемого образца. Текущие усилия по развитию технологии микрочипов направлены на создание однородных, плотных массивов при одновременном уменьшении необходимого объема раствора и минимизации загрязнения или повреждения. Для процесса изготовления необходима библиотека образцов, содержащая всю релевантную информацию. На ранних этапах развития технологии микрочипов единственным используемым образцом была ДНК, полученная из общедоступных библиотек клонов и амплифицированная с помощью бактериальных векторов. Современные подходы используют не только ДНК в качестве образца, но и белки, антитела, антигены, гликоны, клеточные лизаты и другие малые молекулы. Все используемые образцы предварительно синтезируются, регулярно обновляются и проще в обслуживании. Методы изготовления массивов включают контактную печать, литографию, бесконтактную и безклеточную печать.

The initial publication on microarray production process dates back to 1995, when 48 cDNAs of a plant were printed on glass slide typically used for light microscopy, modern microarrays on the other hand include now thousands of probes and different carriers with coatings. The fabrication of the microarray requires both biological and physical information, including sample libraries, printers, and slide substrates. Though all procedures and solutions always dependent on the fabrication technique employed. The basic principle of the microarray is the printing of small stains of solutions containing different species of the probe on a slide several thousand times. Modern printers are HEPA filtered and have controlled humidity and temperature surroundings, which is typically around 25°C, 50% humidity. Early microarrays were directly printed onto the surface by using printer pins which deposit the samples in a user defined pattern on the slide. Modern methods are faster, generate less cross contamination, and produce better spot morphology. The surface to which the probes are printed must be clean, dust free and hydrophobic, for high density microarrays. Slide coatings include poly L lysine, amino silane, epoxy and others, including manufacturers solutions and are chosen based on the type of sample used. Ongoing efforts to advance microarray technology aim to create uniform, dense arrays while reducing the necessary volume of solution and minimizing contamination or damage. For the manufacturing process, a sample library which contains all relevant information is needed. In the early stages of microarray technology, the sole sample used was DNA, obtained from commonly available clone libraries and acquired through DNA amplification via bacterial vectors. Modern approaches do not include just DNA as a sample anymore, but also proteins, antibodies, antigens, glycans, cell lysates and other small molecules. All samples used are presynthesized, regularly updated, and more straightforward to maintain. Array fabrication techniques include contact printing, lithography, non contact and cell free printing.

Литография

Литография объединяет различные методы, такие как фотолитография, интерференционная литография, лазерная запись, электронно-лучевая литография и литография пером Dip. Наиболее широко используемым и исследуемым методом остаётся фотолитография, в которой фотолитографические маски используются для прицельного нанесения конкретных нуклеотидов на поверхность. Ультрафиолетовый свет пропускается через маску, которая действует как фильтр, либо пропуская, либо блокируя свет, направленный на химически защищенную поверхность микромассива. В областях, где ультрафиолетовый свет был заблокирован, остаётся защита от добавления нуклеотидов, в то время как в областях, подвергшихся воздействию ультрафиолетового света, возможно дальнейшее добавление нуклеотидов. С помощью этого метода можно создавать высококачественные массивы с очень высокой плотностью ДНК, используя компактное устройство с небольшим количеством движущихся частей.

Не контактировать

Методы бесконтактной печати различаются, включая печать на основе фотохимии, электропечать и дозирование капель. В отличие от других методов, бесконтактная печать не предполагает контакта между поверхностью и штампом, иглой или другим используемым дозатором. Основными преимуществами являются снижение загрязнения, упрощение очистки и повышение производительности, которое постоянно растет. Многие из этих методов позволяют параллельно загружать зонды, что дает возможность одновременного производства нескольких массивов.