Метод обратной транскрипции ПЦР для анализа РНК

Введение

Лабораторный метод для увеличения количества образца РНК с целью изучения.

Реакция полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) – это лабораторный метод, сочетающий обратную транскрипцию РНК в ДНК (в данном контексте называемую комплементарной ДНК или cDNA) и амплификацию специфических ДНК-фрагментов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основном используется для измерения количества определенной РНК. Это достигается путем мониторинга реакции амплификации с помощью флуоресценции, метода, называемого ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (qPCR). Путаница может возникнуть из-за того, что некоторые авторы используют аббревиатуру RT-PCR для обозначения ПЦР в реальном времени. В данной статье RT-PCR будет означать реакцию полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Комбинированные методы RT-PCR и qPCR обычно используются для анализа экспрессии генов и количественного определения вирусной РНК в исследовательских и клинических условиях. Тесная взаимосвязь между RT-PCR и qPCR привела к метафорическому использованию термина qPCR для обозначения RT-PCR. Такое использование может быть вводящим в заблуждение, поскольку RT-PCR может использоваться без qPCR, например, для молекулярного клонирования, секвенирования или простого обнаружения РНК. И наоборот, qPCR может использоваться без RT-PCR, например, для количественного определения копийности определенного фрагмента ДНК.

История

С момента своего появления в 1977 году, Northern blot широко использовался для количественной оценки РНК, несмотря на свои недостатки: (а) трудоемкость, (б) необходимость в большом количестве РНК для обнаружения и (в) количественная неточность при низкой концентрации РНК. Однако, после изобретения ПЦР Кари Муллисом в 1983 году, обратная транскрипция ПЦР (RT-PCR) вытеснила Northern blot как предпочтительный метод для обнаружения и количественной оценки РНК. RT-PCR стала золотым стандартом для обнаружения и/или сравнения уровней РНК по нескольким причинам: (а) не требует дополнительной обработки после ПЦР, (б) позволяет измерять широкий диапазон (>107-кратный) концентрации РНК и (в) предоставляет информацию как о качественных, так и о количественных данных.

РТ-ПЦР конечной точки против РТ-ПЦР в реальном времени

Количественное определение продуктов обратной транскрипции ПЦР в основном подразделяется на два типа: с определением в конечной точке и в реальном времени. Метод с определением в конечной точке предпочтителен для измерения изменений экспрессии генов в небольшом числе образцов, однако ПЦР в реальном времени стала золотым стандартом для подтверждения количественных результатов, полученных при массивном анализе или оценке изменений экспрессии генов в глобальном масштабе.

Конечная точка РТ-ПЦР

Методы измерения конечных точек РТ-ПЦР требуют обнаружения уровней экспрессии генов с использованием флуоресцентных красителей, таких как бромид этидия, мечения продуктов ПЦР P32 с помощью фосфоримагера или сцинтилляционного счета. Относительная РТ-ПЦР. Относительная количественная оценка РТ-ПЦР включает ко-амплификацию внутреннего контроля одновременно с геном-мишенью. Внутренний контроль используется для нормализации образцов. После нормализации возможно прямое сравнение относительных количеств транскриптов в нескольких образцах мРНК. Важно отметить, что внутренний контроль должен быть выбран таким образом, чтобы он не подвергался влиянию экспериментальной обработки. Уровень экспрессии должен быть постоянным во всех образцах и для мРНК-мишени, чтобы результаты были точными и значимыми. Поскольку количественная оценка результатов анализируется путем сравнения линейного диапазона амплификации мишени и контроля, крайне важно учитывать начальную концентрацию целевых молекул и скорость их амплификации перед началом анализа. Результаты анализа выражаются как отношение сигнала гена к сигналу внутреннего контроля, которые затем могут быть использованы для сравнения между образцами при оценке относительной экспрессии РНК-мишени. Конкурентная РТ-ПЦР. Конкурентная РТ-ПЦР используется для абсолютной количественной оценки. Она включает использование синтетической “конкурентной” РНК, которую можно отличить от целевой РНК небольшой разницей в размере или последовательности. Важно, чтобы дизайн синтетической РНК был идентичен последовательности, но немного короче, чем целевая РНК, для получения точных результатов. После разработки и синтеза известное количество конкурентной РНК добавляется к экспериментальным образцам и ко-амплифицируется с мишенью с помощью РТ-ПЦР. Затем создается калибровочная кривая концентрации конкурентной РНК, которая используется для сравнения сигналов РТ-ПЦР, полученных из эндогенных транскриптов, для определения количества мишени, присутствующей в образце. Сравнительная РТ-ПЦР. Сравнительная РТ-ПЦР аналогична конкурентной РТ-ПЦР в том, что РНК-мишень конкурирует за реагенты амплификации в одной реакции с внутренним стандартом с несвязанной последовательностью. После завершения реакции результаты сравниваются с внешней стандартной кривой для определения концентрации РНК-мишени. По сравнению с методами относительной и конкурентной количественной оценки, сравнительная РТ-ПЦР считается более удобным методом, поскольку она не требует от исследователя проведения предварительного эксперимента; при относительной РТ-ПЦР необходимо заранее определить диапазон экспоненциальной амплификации мРНК, а при конкурентной РТ-ПЦР необходимо синтезировать синтетическую конкурентную РНК.

The measurement approaches of end point RT PCR requires the detection of gene expression levels by the use of fluorescent dyes like ethidium bromide, P32 labeling of PCR products using phosphorimager, or by scintillation counting. Relative RT PCR Relative quantifications of RT PCR involves the co amplification of an internal control simultaneously with the gene of interest. The internal control is used to normalize the samples. Once normalized, a direct comparison of relative transcript abundances across multiple samples of mRNA can be made. One precaution to note is that the internal control must be chosen so that it is not affected by the experimental treatment. The expression level should be constant across all samples and with the mRNA of interest for the results to be accurate and meaningful. Because the quantification of the results are analyzed by comparing the linear range of the target and control amplification, it is crucial to take into consideration the starting target molecules concentration and their amplification rate prior to starting the analysis. The results of the analysis are expressed as the ratios of gene signal to internal control signal, which the values can then be used for the comparison between the samples in the estimation of relative target RNA expression. Competitive RT PCR Competitive RT PCR technique is used for absolute quantification. It involves the use of a synthetic “competitor” RNA that can be distinguished from the target RNA by a small difference in size or sequence. It is important for the design of the synthetic RNA be identical in sequence but slightly shorter than the target RNA for accurate results. Once designed and synthesized, a known amount of the competitor RNA is added to experimental samples and is co amplified with the target using RT PCR. Then, a concentration curve of the competitor RNA is produced and it is used to compare the RT PCR signals produced from the endogenous transcripts to determine the amount of target present in the sample. Comparative RT PCR Comparative RT PCR is similar to the competitive RT PCR in that the target RNA competes for amplification reagents within a single reaction with an internal standard of unrelated sequence. Once the reaction is complete, the results are compared to an external standard curve to determine the target RNA concentration. In comparison to the relative and competitive quantification methods, comparative RT PCR is considered to be the more convenient method to use since it does not require the investigator to perform a pilot experiment; in relative RT PCR, the exponential amplification range of the mRNA must be predetermined and in competitive RT PCR, a synthetic competitor RNA must be synthesized.

РТ-ПЦР в реальном времени

Появление новых методов флуоресцентной маркировки ДНК за последние несколько лет позволило проводить анализ и обнаружение продуктов ПЦР в реальном времени и, как следствие, привело к широкому распространению ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов. В настоящее время ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (РТ-ПЦР) является не только методом выбора для количественной оценки экспрессии генов, но и предпочтительным методом получения результатов анализа микрочипов и экспрессии генов в глобальном масштабе. В настоящее время доступно четыре различных флуоресцентных ДНК-зонда для обнаружения продуктов ПЦР в режиме реального времени с помощью РТ-ПЦР: SYBR Green, TaqMan, молекулярные маяки и зонды-скорпионы. Все эти зонды позволяют обнаруживать продукты ПЦР, генерируя флуоресцентный сигнал. В то время как краситель SYBR Green излучает флуоресцентный сигнал, просто связываясь с двухцепочечной ДНК в растворе, генерация флуоресценции зондов TaqMan, молекулярных маяков и зондов-скорпионов зависит от явления переноса энергии резонансного типа (FRET) между молекулой красителя и гасителем, конъюгированными с олигонуклеотидными субстратами. SYBR Green: когда SYBR Green связывается с двухцепочечной ДНК продуктов ПЦР, он излучает свет при возбуждении. Интенсивность флуоресценции возрастает по мере накопления продуктов ПЦР. Этот метод прост в использовании, поскольку не требует разработки зондов из-за неспецифичности его связывания. Однако, поскольку краситель не различает двухцепочечную ДНК продуктов ПЦР и димеры праймеров, переоценка целевой концентрации является распространенной проблемой. Если требуется точное количественное определение, необходимо проводить дополнительный анализ для валидации результатов. Тем не менее, среди методов обнаружения продуктов РТ-ПЦР в реальном времени, SYBR Green является наиболее экономичным и простым в использовании. Кроме того, эти зонды чувствительны к свету и должны быть тщательно заморожены в виде аликвот для предотвращения деградации. Молекулярные маяки: аналогично зондам TaqMan, молекулярные маяки также используют FRET-детектирование с флуоресцентными зондами, присоединенными к 5'-концу, и гасителем, присоединенным к 3'-концу олигонуклеотидного субстрата. Однако, в то время как флуоресцентные зонды TaqMan расщепляются во время амплификации, молекулярные маяки остаются неповрежденными и повторно связываются с новой мишенью во время каждого цикла реакции. В свободном растворе близкое расположение флуоресцентного зонда и молекулы-гасителя предотвращает флуоресценцию посредством FRET. Однако, когда молекулярные маяки гибридизуются с мишенью, флуоресцентный краситель и гаситель разделяются, что приводит к излучению света при возбуждении. Как и в случае зондов TaqMan, синтез молекулярных маяков дорог и требует отдельных зондов для каждой РНК-мишени. Мультиплексные зонды: зонды TaqMan, молекулярные маяки и зонды-скорпионы позволяют одновременно измерять продукты ПЦР в одной пробирке. Это возможно, поскольку каждый из различных флуоресцентных красителей может быть связан с определенным спектром эмиссии. Использование мультиплексных зондов не только экономит время и усилия, не снижая при этом полезности анализа, но и находит применение в широких областях исследований, таких как анализ делеций генов, анализ мутаций и полиморфизмов, количественный анализ и обнаружение РНК, что делает его незаменимым инструментом для лабораторий различных дисциплин. Для количественной оценки результатов, полученных с помощью РТ-ПЦР в реальном времени, обычно используются две стратегии: метод стандартной кривой и метод сравнительного порогового значения.

The emergence of novel fluorescent DNA labeling techniques in the past few years has enabled the analysis and detection of PCR products in real time and has consequently led to the widespread adoption of real time RT PCR for the analysis of gene expression. Not only is real time RT PCR now the method of choice for quantification of gene expression, it is also the preferred method of obtaining results from array analyses and gene expressions on a global scale. Currently, there are four different fluorescent DNA probes available for the real time RT PCR detection of PCR products: SYBR Green, TaqMan, molecular beacons, and scorpion probes. All of these probes allow the detection of PCR products by generating a fluorescent signal. While the SYBR Green dye emits its fluorescent signal simply by binding to the double stranded DNA in solution, the TaqMan probes', molecular beacons' and scorpions' generation of fluorescence depend on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) coupling of the dye molecule and a quencher moiety to the oligonucleotide substrates. SYBR Green When the SYBR Green binds to the double stranded DNA of the PCR products, it will emit light upon excitation. The intensity of the fluorescence increases as the PCR products accumulate. This technique is easy to use since designing of probes is not necessary given lack of specificity of its binding. However, since the dye does not discriminate the double stranded DNA from the PCR products and those from the primer dimers, overestimation of the target concentration is a common problem. Where accurate quantification is an absolute necessity, further assay for the validation of results must be performed. Nevertheless, among the real time RT PCR product detection methods, SYBR Green is the most economical and easiest to use. Additionally, these probes are light sensitive and must be carefully frozen as aliquots to prevent degradation. Molecular beacon probes Similar to the TaqMan probes, molecular beacons also make use of FRET detection with fluorescent probes attached to the 5' end and a quencher attached to the 3' end of an oligonucleotide substrate. However, whereas the TaqMan fluorescent probes are cleaved during amplification, molecular beacon probes remain intact and rebind to a new target during each reaction cycle. When free in solution, the close proximity of the fluorescent probe and the quencher molecule prevents fluorescence through FRET. However, when molecular beacon probes hybridize to a target, the fluorescent dye and the quencher are separated resulting in the emittance of light upon excitation. As is with the TaqMan probes, molecular beacons are expensive to synthesize and require separate probes for each RNA target. Multiplex probes TaqMan probes, molecular beacons, and scorpions allow the concurrent measurement of PCR products in a single tube. This is possible because each of the different fluorescent dyes can be associated with a specific emission spectra. Not only does the use of multiplex probes save time and effort without compromising test utility, its application in wide areas of research such as gene deletion analysis, mutation and polymorphism analysis, quantitative analysis, and RNA detection, make it an invaluable technique for laboratories of many discipline. Two strategies are commonly employed to quantify the results obtained by real time RT PCR; the standard curve method and the comparative threshold method.

Применение

Экспоненциальное усиление с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции обеспечивает высокочувствительный метод, позволяющий обнаруживать крайне низкое количество копий молекул РНК. РТ-ПЦР широко применяется в диагностике генетических заболеваний и, полуколичественно, для определения обилия специфических молекул РНК в клетке или ткани как показателя экспрессии генов.

Методы исследования

RT-PCR обычно используется в исследовательских методах для измерения экспрессии генов. Например, Лин и др. использовали qRT-PCR для измерения экспрессии генов Gal в клетках дрожжей. Сначала Лин и др. внесли мутацию в белок, который предположительно участвует в регуляции генов Gal. Предполагалось, что эта мутация избирательно подавляет экспрессию Gal. Для подтверждения этого проанализировали уровни экспрессии генов клеток дрожжей, содержащих эту мутацию, с помощью qRT-PCR. Исследователи убедительно установили, что мутация этого регуляторного белка снижает экспрессию Gal. Для дальнейшего изучения экспрессии генов РНК используется Northern blot анализ.

Вставка генов

RT-PCR также может быть очень полезен при встраивании генов эукариот в прокариоты. Поскольку большинство генов эукариот содержат интроны, которые присутствуют в геноме, но отсутствуют в зрелой мРНК, кДНК, полученная в результате RT-PCR, представляет собой точную (несмотря на подверженность ошибкам обратных транскриптаз) последовательность ДНК, которая будет непосредственно транслироваться в белок после транскрипции. При экспрессии этих генов в прокариотических клетках с целью производства или очистки белка, РНК, образующаяся непосредственно при транскрипции, не требует сплайсинга, так как транскрипт содержит только экзоны. (Прокариоты, такие как E. coli, не имеют механизма сплайсинга мРНК, характерного для эукариот).

Диагностика генетических заболеваний

РТ-ПЦР может использоваться для диагностики генетических заболеваний, таких как синдром Леш-Нихана. Это генетическое заболевание вызвано нарушением функции гена HPRT1, что клинически проявляется в образовании смертельных мочевых камней и симптомах, сходных с подагрой. Анализ уровня экспрессии мРНК HPRT1 у беременной матери и плода позволит определить, является ли мать носителем, и оценить вероятность развития синдрома Леш-Нихана у плода.

Выявление рака

Ученые работают над способами применения РТ-ПЦР для выявления рака с целью улучшения прогноза и мониторинга ответа на терапию. Циркулирующие опухолевые клетки производят уникальные мРНК-транскрипты в зависимости от типа рака. Задача состоит в том, чтобы определить, какие мРНК-транскрипты являются наиболее подходящими биомаркерами для конкретного типа раковых клеток, а затем анализировать уровни их экспрессии с помощью РТ-ПЦР. РТ-ПЦР широко используется для изучения геномов вирусов, геномы которых состоят из РНК, таких как вирус гриппа A, ретровирусы, например ВИЧ, и SARS-CoV-2.

Вызовы

Несмотря на значительные преимущества, РТ-ПЦР не лишена недостатков. Экспоненциальный рост реверс-транскрибированной комплементарной ДНК (кДНК) в ходе множественных циклов ПЦР приводит к неточной количественной оценке в конечной точке из-за сложности поддержания линейности. Для обеспечения точного обнаружения и количественного определения содержания РНК в образце была разработана qRT-ПЦР с использованием флуоресцентной модификации для мониторинга продуктов амплификации на каждом цикле ПЦР. Чрезвычайная чувствительность метода может быть палкой о двух концах, поскольку даже незначительное загрязнение ДНК может привести к нежелательным результатам. Простой способ устранения ложноположительных результатов – включение якорей или тегов в 5'-область ген-специфичного праймера. Кроме того, планирование и разработка исследований количественной оценки могут быть технически сложными из-за множества источников вариаций, включая концентрацию матрицы и эффективность амплификации. В качестве контролей можно использовать добавление известного количества РНК в образец, добавление серии разведений РНК для построения стандартной кривой и добавление образца без матрицы (без кДНК).

Протокол

РТ-ПЦР может быть выполнена по одностадийному протоколу или по двухстадийному протоколу.

Двухступенчатая РТ-ПЦР

Двухступенчатая РТ-ПЦР, как следует из названия, происходит в два этапа: сначала обратная транскрипция, а затем ПЦР. Этот метод более чувствителен, чем одноступенчатый. Для двухступенчатой РТ-ПЦР также полезно использовать готовые наборы. Как и в случае одноступенчатой ПЦР, для достижения наилучших результатов используйте только цельную, высококачественную РНК. Праймер для двухступенчатой ПЦР не обязательно должен быть специфичным к последовательности.

Шаг первый

Сначала в ПЦР-трубке смешайте РНК-шаблон, праймер, смесь dNTP и воду, свободную от нуклеаз. Затем добавьте в ПЦР-трубку ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу. Далее поместите ПЦР-трубку в термоциклер для проведения одного цикла, включающего отжиг, элонгацию и инактивацию обратной транскриптазы. Наконец, сразу переходите к шагу два – ПЦР, или храните продукт на льду до проведения ПЦР.

Шаг второй

В каждую ПЦР-трубку добавьте мастер-микс, содержащий буфер, смесь dNTP, MgCl2, Taq-полимеразу и воду, свободную от нуклеаз. Затем добавьте в трубки необходимый праймер. Далее поместите ПЦР-трубки в термоциклер для проведения 30 циклов программы амплификации, включающей денатурацию, отжиг и элонгацию. Продукты РТ-ПЦР можно проанализировать с помощью гелевого электрофореза.

Руководство по публикации

Количественный анализ РТ-ПЦР считается золотым стандартом для измерения количества копий специфических мишеней цДНК в образце, но он недостаточно стандартизирован. В результате, несмотря на многочисленные публикации, использующие эту технику, многие из них содержат недостаточно подробное описание экспериментальных условий и используют неподходящие методы анализа данных, что приводит к неверным выводам. Из-за присущей изменчивости качества данных количественной ПЦР, рецензентам сложно оценивать такие рукописи, а сами исследования становятся невоспроизводимыми. Осознавая необходимость стандартизации представления информации об экспериментальных условиях, международный консорциум ученых разработал руководство по минимальной информации для публикации результатов количественной ПЦР в реальном времени (MIQE, произносится "майки"). Руководство MIQE определяет минимальный набор данных, необходимый для оценки экспериментов количественной ПЦР, который должен предоставляться при публикации для стимулирования надлежащей экспериментальной практики и обеспечения релевантности, точности, корректной интерпретации и воспроизводимости результатов количественной ПЦР. Помимо рекомендаций по представлению данных, MIQE подчеркивает необходимость стандартизации терминологии, используемой в количественной ПЦР, чтобы избежать путаницы; например, аббревиатура qPCR следует использовать для обозначения количественной ПЦР в реальном времени, RT qPCR – для ПЦР с обратной транскрипцией, а гены, используемые для нормализации, следует называть референсными генами, а не хаус-кипинговыми генами. Также предлагается избегать использования коммерческих названий, таких как зонды TaqMan, заменяя их на зонды гидролиза. Кроме того, предлагается использовать цикл количественного определения (Cq) для обозначения цикла ПЦР, используемого для количественной оценки, вместо порогового цикла (Ct), точки пересечения (Cp) и точки взлета (TOP), которые обозначают одно и то же значение, но были введены разными производителями приборов для ПЦР в реальном времени. Руководство состоит из следующих разделов: 1) дизайн эксперимента, 2) образец, 3) выделение нуклеиновых кислот, 4) обратная транскрипция, 5) информация о мишенях qPCR, 6) олигонуклеотиды, 7) протокол, 8) валидация и 9) анализ данных. Каждый раздел содержит элементы, помеченные как E (обязательные) или D (желательные). Элементы, помеченные E, считаются критически важными и необходимыми, а элементы, помеченные D, – важными для обеспечения передовой практики, хотя и не являющимися обязательными.

Quantitative RT PCR assay is considered to be the gold standard for measuring the number of copies of specific cDNA targets in a sample but it is poorly standardized. As a result, while there are numerous publications utilizing the technique, many provide inadequate experimental detail and use unsuitable data analysis to draw inappropriate conclusions. Due to the inherent variability in the quality of any quantitative PCR data, not only do reviewers have a difficult time evaluating these manuscripts, but the studies also become impossible to replicate. Recognizing the need for the standardization of the reporting of experimental conditions, the Minimum Information for Publication of Quantitative Real Time PCR Experiments (MIQE, pronounced mykee) guidelines have been published by an international consortium of academic scientists. The MIQE guidelines describe the minimum information necessary for evaluating quantitative PCR experiments that should be required for publication to encourage better experimental practice and ensuring the relevance, accuracy, correct interpretation, and repeatability of quantitative PCR data. Besides reporting guidelines, the MIQE stresses the need to standardize the nomenclature associated with quantitative PCR to avoid confusion; for example, the abbreviation qPCR should be used for quantitative real time PCR, while RT qPCR should be used for reverse transcription qPCR, and genes used for normalization should be referred to as reference genes instead of housekeeping genes. It also proposes that commercially derived terms like TaqMan probes should not be used, but instead referred to as hydrolysis probes. Additionally, it is proposed that the quantification cycle (Cq) be used to describe the PCR cycle used for quantification instead of the threshold cycle (Ct), crossing point (Cp), and takeoff point (TOP), which refer to the same value but were coined by different manufacturers of real time instruments. The guideline consists of the following elements: 1) experimental design, 2) sample, 3) nucleic acid extraction, 4) reverse transcription, 5) qPCR target information, 6) oligonucleotides, 7) protocol, 8) validation, and 9) data analysis. Specific items within each element carry a label of either E (essential) or D (desirable). Those labeled E are considered critical and indispensable while those labeled D are considered peripheral yet important for best practices.