Иммунопреципитация и выделение белковых комплексов.

Введение

Лабораторные методы в биохимии

Иммунопреципитация (IP) – это метод осаждения белкового антигена из раствора с помощью антитела, специфически связывающегося с данным белком. Этот процесс позволяет изолировать и концентрировать конкретный белок из образца, содержащего тысячи различных белков. Для проведения иммунопреципитации необходимо соединить антитело с твердым носителем на одном из этапов процедуры.

Индивидуальная иммунопреципитация белка (IP)

Используется антитело, специфичное к известному белку, для выделения именно этого белка из раствора, содержащего множество различных белков. Такие растворы часто представляют собой грубый лизат растительной или животной ткани. В качестве других типов образцов могут использоваться жидкости организма или другие биологические материалы.

Иммунопреципитация белкового комплекса (Co-IP)

Иммунопреципитация неповрежденных белковых комплексов (то есть антигена вместе с любыми белками или лигандами, связанными с ним) известна как ко-иммунопреципитация (Co IP). Co IP заключается в выборе антитела, нацеленного на известный белок, который предположительно входит в состав более крупного белкового комплекса. Нацеливаясь на этот известный компонент с помощью антитела, становится возможным выделить весь белковый комплекс из раствора и, таким образом, идентифицировать неизвестные его компоненты. Это работает, когда белки, входящие в комплекс, прочно связываются друг с другом, что позволяет извлечь из раствора несколько компонентов комплекса, «захватив» один из них антителом. Этот принцип выделения белковых комплексов из раствора иногда называют «pull down». Co IP – это мощный метод, который молекулярные биологи регулярно используют для анализа белок-белковых взаимодействий. Конкретное антитело часто отбирает субпопуляцию целевого белка, у которого эпитоп доступен для связывания, и поэтому не позволяет идентифицировать белки в комплексах, где эпитоп скрыт. Это проявляется в том, что даже при использовании большого избытка антитела редко удается осадить из образца даже половину данного белка. По мере проведения последовательных раундов нацеливания и иммунопреципитации число идентифицированных белков может продолжать расти. При этом идентифицированные белки не обязательно существуют одновременно в одном комплексе, а могут представлять собой сеть белков, взаимодействующих друг с другом в разное время и с разными целями. Повторение эксперимента с нацеливанием на различные компоненты белкового комплекса позволяет исследователю перепроверить результаты. Каждый раунд «pull down» должен приводить к восстановлению как исходного известного белка, так и других ранее идентифицированных компонентов комплекса (и даже новых дополнительных компонентов). Повторяя иммунопреципитацию таким образом, исследователь подтверждает, что каждый идентифицированный компонент белкового комплекса был правильно идентифицирован. Если конкретный белок может быть восстановлен только при нацеливании на один из известных компонентов, но не при нацеливании на другие, то его статус как компонента комплекса может быть поставлен под вопрос.

Immunoprecipitation of intact protein complexes (i. e. antigen along with any proteins or ligands that are bound to it) is known as co immunoprecipitation (Co IP). Co IP works by selecting an antibody that targets a known protein that is believed to be a member of a larger complex of proteins. By targeting this known member with an antibody it may become possible to pull the entire protein complex out of solution and thereby identify unknown members of the complex. This works when the proteins involved in the complex bind to each other tightly, making it possible to pull multiple members of the complex out of the solution by latching onto one member with an antibody. This concept of pulling protein complexes out of solution is sometimes referred to as a "pull down". Co IP is a powerful technique that is used regularly by molecular biologists to analyze protein–protein interactions. A particular antibody often selects for a subpopulation of its target protein that has the epitope exposed, thus failing to identify any proteins in complexes that hide the epitope. This can be seen in that it is rarely possible to precipitate even half of a given protein from a sample with a single antibody, even when a large excess of antibody is used. As successive rounds of targeting and immunoprecipitations take place, the number of identified proteins may continue to grow. The identified proteins may not ever exist in a single complex at a given time, but may instead represent a network of proteins interacting with one another at different times for different purposes. Repeating the experiment by targeting different members of the protein complex allows the researcher to double check the result. Each round of pull downs should result in the recovery of both the original known protein as well as other previously identified members of the complex (and even new additional members). By repeating the immunoprecipitation in this way, the researcher verifies that each identified member of the protein complex was a valid identification. If a particular protein can only be recovered by targeting one of the known members but not by targeting other of the known members then that protein's status as a member of the complex may be subject to question.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) – это метод, используемый для определения местоположения участков связывания ДНК в геноме для конкретного интересующего белка. Эта методика позволяет получить представление о взаимодействиях белок-ДНК, происходящих внутри ядра живых клеток или тканей. In vivo природа этого метода отличается от других подходов, традиционно используемых для решения тех же задач. Принцип, лежащий в основе этого анализа, заключается в том, что белки, связывающие ДНК (включая факторы транскрипции и гистоны) в живых клетках, могут быть сшиты с ДНК, к которой они связываются. Используя антитело, специфичное к предполагаемому белку, связывающему ДНК, можно иммунопреципитировать комплекс белок-ДНК из клеточных лизатов. Сшивание часто достигается обработкой клеток (или ткани) формальдегидом, хотя иногда бывает целесообразно использовать более четкий и воспроизводимый сшивающий агент, такой как диметил 3,3′-дитиобиспропионимидат 2 HCl (DTBP). После сшивания клетки лизируют, а ДНК фрагментируют на отрезки длиной 0,2–1,0 кб с помощью соникации. На этом этапе проводится иммунопреципитация, приводящая к очистке комплексов белок-ДНК. Затем очищенные комплексы белок-ДНК нагревают для обратимого разрушения формальдегидных сшивок между белком и ДНК, что позволяет отделить ДНК от белков. Идентичность и количество изолированных фрагментов ДНК можно определить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ограничением проведения ПЦР на изолированных фрагментах является необходимость знать, какой геномный регион исследуется, чтобы подобрать правильные праймеры для ПЦР. Иногда это ограничение обходят, клонируя изолированную геномную ДНК в плазмидный вектор, а затем используя праймеры, специфичные к области клонирования этого вектора. В качестве альтернативы, когда необходимо определить места связывания белка в масштабе всего генома, используется ChIP-секвенирование, которое в последнее время стало стандартной технологией, позволяющей локализовать сайты связывания белка с высокой пропускной способностью и экономической эффективностью, а также характеризовать цистрому. Ранее также использовались ДНК-микроматрицы (ChIP-on-chip или ChIP-chip).

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a method used to determine the location of DNA binding sites on the genome for a particular protein of interest. This technique gives a picture of the protein–DNA interactions that occur inside the nucleus of living cells or tissues. The in vivo nature of this method is in contrast to other approaches traditionally employed to answer the same questions. The principle underpinning this assay is that DNA binding proteins (including transcription factors and histones) in living cells can be cross linked to the DNA that they are binding. By using an antibody that is specific to a putative DNA binding protein, one can immunoprecipitate the protein–DNA complex out of cellular lysates. The crosslinking is often accomplished by applying formaldehyde to the cells (or tissue), although it is sometimes advantageous to use a more defined and consistent crosslinker such as dimethyl 3,3′ dithiobispropionimidate 2 HCl (DTBP). Following crosslinking, the cells are lysed and the DNA is broken into pieces 0.2–1.0 kb in length by sonication. At this point the immunoprecipitation is performed resulting in the purification of protein–DNA complexes. The purified protein–DNA complexes are then heated to reverse the formaldehyde cross linking of the protein and DNA complexes, allowing the DNA to be separated from the proteins. The identity and quantity of the DNA fragments isolated can then be determined by polymerase chain reaction (PCR). The limitation of performing PCR on the isolated fragments is that one must have an idea which genomic region is being targeted in order to generate the correct PCR primers. Sometimes this limitation is circumvented simply by cloning the isolated genomic DNA into a plasmid vector and then using primers that are specific to the cloning region of that vector. Alternatively, when one wants to find where the protein binds on a genome wide scale, ChIP sequencing is used and has recently emerged as a standard technology that can localize protein binding sites in a high throughput, cost effective fashion, allowing also for the characterization of the cistrome. Previously, DNA microarray was also used (ChIP on chip or ChIP chip).

Иммунопреципитация RNP (RIP и CLIP)

RIP и CLIP очищают специфический белок, связывающий РНК, для идентификации связанных с ним РНК, тем самым изучая рибонуклеопротеины (РНП). В RIP совместно очищенные РНК извлекаются, и их обогащение сравнивается с контрольной группой, что изначально проводилось с помощью микромассивов или РТ-ПЦР. В CLIP клетки подвергаются УФ-сшиванию до лизиса, после чего следуют дополнительные этапы очистки, помимо стандартной иммунопреципитации, включая частичную фрагментацию РНК, промывку при высокой концентрации соли, разделение SDS-PAGE, перенос на мембрану и идентификацию прямых сайтов связывания РНК посредством секвенирования кДНК.

Маркированные белки

Одним из основных технических препятствий иммунопреципитации является значительная сложность в создании антитела, специфически нацеленного на единственный известный белок. Чтобы преодолеть эту проблему, многие исследовательские группы вводят теги на C- или N-концевой конец белка, представляющего интерес. Преимущество заключается в том, что один и тот же тег можно многократно использовать для различных белков, и исследователь может использовать одно и то же антитело каждый раз. Преимущества использования меченых белков настолько велики, что эта методика стала широко распространенной для всех типов иммунопреципитации, включая все описанные выше виды IP. Примеры используемых тегов – тег зеленого флуоресцентного белка (GFP), тег глутатион-S-трансферазы (GST) и FLAG-тег. Хотя использование тега для проведения "pull-down" экспериментов удобно, это вызывает определенные опасения относительно биологической релевантности, поскольку сам тег может маскировать нативные взаимодействия или вводить новые, неестественные взаимодействия.

Методы

Два основных метода иммунопреципитации — метод прямого захвата и метод непрямого захвата.

Прямые

Антитела, специфичные к определенному белку (или группе белков), иммобилизуются на твердом субстрате, таком как суперпарамагнитные микрочастицы или микроскопические агарозные (немагнитные) шарики. Затем шарики с прикрепленными антителами добавляются к смеси белков, и белки, являющиеся мишенями для этих антител, захватываются на шариках посредством антител; иными словами, происходит их иммунопреципитация.

Косвенно

Антитела, специфичные к определенному белку или группе белков, добавляются непосредственно в смесь белков. Антитела еще не присоединены к твердой фазе. Антитела свободно перемещаются в белковой смеси и связываются со своими мишенями. По мере протекания времени в смесь антител и белков добавляются шарики, покрытые белком A/G. В этот момент антитела, которые теперь связаны со своими мишенями, прикрепляются к шарикам. С этого момента прямые и непрямые протоколы сходятся, поскольку образцы теперь содержат одинаковые компоненты. Оба метода приводят к одному и тому же конечному результату, когда белок или белковые комплексы связаны с антителами, которые, в свою очередь, иммобилизованы на шариках.

Выбор

Иногда предпочтительнее использовать косвенный подход, когда концентрация белка-мишени низкая или когда специфическое сродство антитела к белку слабое. Косвенный метод также используется, когда кинетика связывания антитела с белком замедлена по различным причинам. В большинстве случаев прямой метод является методом выбора и предпочтительным.

Агароза

Исторически, твердой фазой для иммунопреципитации, используемой большинством ученых, были высокопористые агарозные бусины (также известные как агарозные смолы или суспензии). Преимуществом этой технологии является очень высокая потенциальная емкость связывания, поскольку практически вся губчатая структура частицы агарозы (размером от 50 до 150 мкм) доступна для связывания антител (которые, в свою очередь, связывают целевые белки) и использования стандартного лабораторного оборудования для всех этапов протокола иммунопреципитации без необходимости в каком-либо специализированном оборудовании. Преимущество чрезвычайно высокой емкости связывания необходимо тщательно сопоставлять с количеством антител, которое исследователь готов использовать для покрытия агарозных бусин. Поскольку антитела могут быть существенным фактором, ограничивающим затраты, лучше всего рассчитывать, исходя из количества белка, которое необходимо захватить (в зависимости от последующего анализа), количества антител, необходимого для связывания этого количества белка (с небольшим избытком для компенсации неэффективности системы), и, далее, количества агарозы, необходимого для связывания этого количества антител. В случаях, когда насыщение антителами не требуется, эта технология не имеет себе равных в способности захватывать чрезвычайно большие количества целевых белков. Однако следует учитывать, что "высокая емкость как преимущество" может превратиться в "высокая емкость как недостаток", когда огромная емкость сефарозы/агарозы не полностью насыщена антителами. Часто бывает, что количество антител, доступного исследователю для эксперимента по иммунопреципитации, недостаточно для насыщения используемых агарозных бусин. В таких случаях исследователь может получить частицы агарозы, лишь частично покрытые антителами, и часть емкости связывания агарозы, не занятая антителами, может связывать любые вещества, что приводит к повышенному фоновому сигналу из-за неспецифического связывания компонентов лизата с бусинами, что затрудняет интерпретацию данных. Хотя некоторые считают, что в таких случаях целесообразно подбирать количество агарозы (исходя из ее емкости связывания) к желаемому количеству антител для иммунопреципитации, простой способ снизить проблему неспецифического связывания с агарозными бусинами и повысить специфичность – предварительно очистить лизат, что настоятельно рекомендуется для любой иммунопреципитации.

Historically the solid phase support for immunoprecipitation used by the majority of scientists has been highly porous agarose beads (also known as agarose resins or slurries). The advantage of this technology is a very high potential binding capacity, as virtually the entire sponge like structure of the agarose particle (50 to 150 μm in size) is available for binding antibodies (which will in turn bind the target proteins) and the use of standard laboratory equipment for all aspects of the IP protocol without the need for any specialized equipment. The advantage of an extremely high binding capacity must be carefully balanced with the quantity of antibody that the researcher is prepared to use to coat the agarose beads. Because antibodies can be a cost limiting factor, it is best to calculate backward from the amount of protein that needs to be captured (depending upon the analysis to be performed downstream), to the amount of antibody that is required to bind that quantity of protein (with a small excess added in order to account for inefficiencies of the system), and back still further to the quantity of agarose that is needed to bind that particular quantity of antibody. In cases where antibody saturation is not required, this technology is unmatched in its ability to capture extremely large quantities of captured target proteins. The caveat here is that the "high capacity advantage" can become a "high capacity disadvantage" that is manifested when the enormous binding capacity of the sepharose/agarose beads is not completely saturated with antibodies. It often happens that the amount of antibody available to the researcher for their immunoprecipitation experiment is less than sufficient to saturate the agarose beads to be used in the immunoprecipitation. In these cases the researcher can end up with agarose particles that are only partially coated with antibodies, and the portion of the binding capacity of the agarose beads that is not coated with antibody is then free to bind anything that will stick, resulting in an elevated background signal due to non specific binding of lysate components to the beads, which can make data interpretation difficult. While some may argue that for these reasons it is prudent to match the quantity of agarose (in terms of binding capacity) to the quantity of antibody that one wishes to be bound for the immunoprecipitation, a simple way to reduce the issue of non specific binding to agarose beads and increase specificity is to preclear the lysate, which for any immunoprecipitation is highly recommended.

Предварительное очищение

Лизаты представляют собой сложные смеси белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот, и следует исходить из того, что некоторое количество неспецифического связывания с антителом IP, белком A/G или твердой фазой произойдет и негативно повлияет на обнаружение иммунопреципитированных мишеней. В большинстве случаев лизат предварительно очищают в начале каждого эксперимента по иммунопреципитации (см. шаг 2 в разделе "протокол" ниже). Однако этот подход не учитывает неспецифическое связывание с антителом IP, которое может быть значительным. Поэтому альтернативным методом предварительной очистки является инкубация белковой смеси с теми же компонентами, которые будут использоваться в иммунопреципитации, за исключением того, что вместо самого антитела IP используется неспецифическое, нерелевантное антитело того же подкласса, что и антитело IP. для применения в иммунопреципитации, хотя стандартные иммунопреципитации на основе агарозы выполнялись в течение 1 часа, хотя и нет объективных доказательств, подтверждающих это утверждение. Технология магнитных частиц снижает количество манипуляций с образцом за счет уменьшения физического воздействия на образец при магнитной сепарации по сравнению с многократным центрифугированием при использовании агарозы, что может существенно способствовать увеличению выхода лабильных (хрупких) белковых комплексов. При выборе носителя для иммунопреципитации также следует учитывать такие дополнительные факторы, как связывающая способность, стоимость реагента, необходимость дополнительного оборудования и возможность автоматизации процесса IP.

Обязательная способность

Сторонники как агарозы, так и магнитных бусин могут спорить о том, благоприятствует ли существенная разница в связывающей способности этих двух типов бусин какому-либо конкретному из них. При прямом сравнении агарозные бусины имеют значительно большую площадь поверхности и, следовательно, большую связывающую способность, чем магнитные бусины, благодаря большему размеру и губчатой структуре. Однако вариабельный размер пор агарозы создает потенциальный верхний предел размера, который может повлиять на связывание чрезвычайно крупных белков или белковых комплексов с внутренними связывающими участками, и поэтому магнитные бусины могут быть более подходящими для иммунопреципитации больших белков или белковых комплексов, чем агарозные бусины, хотя независимых сравнительных данных, подтверждающих это, недостаточно. Некоторые утверждают, что значительно большая связывающая способность агарозных бусин может быть недостатком из-за повышенной способности к неспецифическому связыванию. Другие могут рекомендовать использовать магнитные бусины, поскольку для насыщения общей связывающей способности агарозных бусин требуется большее количество антител, что, очевидно, является экономическим недостатком использования агарозы. Хотя эти аргументы верны вне контекста их практического применения, они игнорируют два ключевых аспекта принципа иммунопреципитации, которые показывают, что выбор между агарозой и магнитными бусинами определяется не только связывающей способностью. Во-первых, неспецифическое связывание не ограничивается антителосвязывающими участками на иммобилизованной матрице; любая поверхность антитела или компонент реакции иммунопреципитации может связываться с неспецифическими компонентами лизата, и поэтому неспецифическое связывание будет происходить даже при использовании полностью насыщенных бусин. Именно поэтому важно предварительно очистить образец перед проведением иммунопреципитации. Во-вторых, способность захватывать целевой белок напрямую зависит от количества иммобилизованного антитела, поэтому при сопоставимом сравнении иммунопреципитации с использованием агарозы и магнитных бусин количество белка, которое может захватить любая из матриц, ограничено количеством добавленного антитела. Таким образом, решение о насыщении любого типа матрицы зависит от необходимого количества белка, как описано выше в разделе «Агароза» на этой странице.

Proponents of both agarose and magnetic beads can argue whether the vast difference in the binding capacities of the two beads favors one particular type of bead. In a bead to bead comparison, agarose beads have significantly greater surface area and therefore a greater binding capacity than magnetic beads due to the large bead size and sponge like structure. But the variable pore size of the agarose causes a potential upper size limit that may affect the binding of extremely large proteins or protein complexes to internal binding sites, and therefore magnetic beads may be better suited for immunoprecipitating large proteins or protein complexes than agarose beads, although there is a lack of independent comparative evidence that proves either case. Some argue that the significantly greater binding capacity of agarose beads may be a disadvantage because of the larger capacity of non specific binding. Others may argue for the use of magnetic beads because of the greater quantity of antibody required to saturate the total binding capacity of agarose beads, which would obviously be an economical disadvantage of using agarose. While these arguments are correct outside the context of their practical use, these lines of reasoning ignore two key aspects of the principle of immunoprecipitation that demonstrates that the decision to use agarose or magnetic beads is not simply determined by binding capacity. First, non specific binding is not limited to the antibody binding sites on the immobilized support; any surface of the antibody or component of the immunoprecipitation reaction can bind to nonspecific lysate constituents, and therefore nonspecific binding will still occur even when completely saturated beads are used. This is why it is important to preclear the sample before the immunoprecipitation is performed. Second, the ability to capture the target protein is directly dependent upon the amount of immobilized antibody used, and therefore, in a side by side comparison of agarose and magnetic bead immunoprecipitation, the most protein that either support can capture is limited by the amount of antibody added. So the decision to saturate any type of support depends on the amount of protein required, as described above in the Agarose section of this page.

Стоимость

Цена использования любого типа носителя является ключевым фактором, определяющим выбор между агарозой и магнитными частицами для иммунопреципитации. Первоначальная оценка стоимости магнитных частиц по сравнению с сефарозой может показать, что сефароза дешевле. Однако магнитные частицы могут быть конкурентоспособными по цене с агарозой для иммунопреципитации аналитического масштаба, в зависимости от используемого метода иммунопреципитации и необходимого объема частиц на реакцию. При использовании традиционного метода иммунопреципитации, описанного ниже, когда все компоненты добавляются в пробирку во время реакции, физические свойства агарозы требуют минимального количества носителя для каждого эксперимента (обычно от 25 до 50 мкл на реакцию). Это связано с тем, что сефарозу необходимо концентрировать на дне пробирки центрифугированием, а супернатант удалять после каждой инкубации, промывки и т.д. Это накладывает абсолютные физические ограничения на процесс, поскольку осадок из агарозы объемом менее 25-50 мкл трудно, если не невозможно, визуально обнаружить на дне пробирки. В случае магнитных частиц минимальный объем не требуется благодаря магнитному разделению, и, следовательно, в зависимости от целевого антигена и антител для иммунопреципитации, можно использовать значительно меньшее количество магнитных частиц. В то же время, вместо обычных микроцентрифужных пробирок можно использовать спин-колонки, чтобы значительно уменьшить необходимое количество агарозы на реакцию. Спин-колонки содержат фильтр, который позволяет всем компонентам иммунопреципитации, кроме частиц, проходить через него при кратковременном центрифугировании, что позволяет использовать значительно меньше агарозы с минимальными потерями.

Оборудование

Как упоминалось выше, для использования агарозных шариков в приложениях иммунопреципитации требуется только стандартное лабораторное оборудование, тогда как для иммунопреципитации на основе магнитных шариков необходимы мощные магниты. Несмотря на то, что оборудование для магнитного отмывания может быть дорогостоящим, быстрое проведение иммунопреципитации с использованием магнитных шариков может оказаться финансово выгодным, особенно при приближении сроков подачи заявок на гранты, поскольку 30-минутный протокол с магнитными шариками, в отличие от ночной инкубации при 4 °C с агарозными шариками, позволяет получить больше данных за меньшее время.

Автоматизация

Дополнительным преимуществом использования магнитных шариков является то, что автоматизированные устройства для иммунопреципитации становятся все более распространенными. Эти устройства не только уменьшают трудозатраты и время, необходимое для проведения иммунопреципитации, но и могут применяться в высокопроизводительных исследованиях.

Резюме

Хотя очевидные преимущества использования магнитных бусин включают в себя повышение скорости реакции, более бережное обращение с образцами и возможность автоматизации, выбор между агарозой и магнитными бусинами, основанный на связывающей способности носителя и стоимости продукта, может зависеть от целевого белка и используемого метода иммунопреципитации. Как и в случае любых анализов, для определения оптимального метода для конкретного применения требуется эмпирическое тестирование.

Предыстория

После выбора технологии с использованием твердого носителя, антитела конъюгируют с бусинами, и бусины, покрытые антителами, можно добавить к гетерогенному образцу белка (например, к гомогенизированной ткани). В этот момент антитела, иммобилизованные на бусинах, связываются с белками, которые они специфически распознают. После этого этап иммунопреципитации протокола фактически завершен, поскольку специфические интересующие белки связаны с антителами, которые сами иммобилизованы на бусинах. Отделение иммунокомплексов от лизата – крайне важная серия этапов, поскольку белки должны оставаться связанными друг с другом (в случае ко-иммунопреципитации) и связанными с антителом во время промывок для удаления несвязанных белков и снижения фонового шума. При работе с агарозными бусинами бусины необходимо осадить из образца кратковременным центрифугированием при скорости 600–3000 x g (кратное стандартной силе тяжести). Этот этап можно выполнить в стандартной микроцентрифужной трубке, но для более быстрого разделения, большей воспроизводимости и более высокого выхода процесс часто проводят в небольших спиновых колонках с размером пор, позволяющим жидкости, но не агарозным бусинам, проходить через них. После центрифугирования агарозные бусины образуют рыхлый, пушистый осадок на дне трубки. Сверхнатидант, содержащий загрязнители, может быть аккуратно удален, чтобы не потревожить осадок. Затем к бусинам добавляют промывочный буфер, и после перемешивания бусины снова отделяют центрифугированием. При использовании суперпарамагнитных бусин образец помещают в магнитное поле, чтобы бусины собирались на стенке трубки. Эта процедура обычно завершается примерно за 30 секунд, после чего оставшаяся (нежелательная) жидкость удаляется пипеткой. Промывка осуществляется ресуспендированием бусин (вне магнитного поля) в промывочном растворе, а затем повторной концентрацией бусин на стенке трубки (помещением трубки обратно на магнит). Промывку обычно повторяют несколько раз для обеспечения достаточного удаления загрязнителей. Если суперпарамагнитные бусины имеют однородный размер, а магнит спроектирован правильно, бусины будут равномерно концентрироваться на стенке трубки, и промывочный раствор можно легко и полностью удалить. После промывки осажденные белки элюируют и анализируют с помощью гель-электрофореза, масс-спектрометрии, вестерн-блоттинга или любым другим методом для идентификации компонентов комплекса. Время выполнения протокола иммунопреципитации сильно варьируется в зависимости от различных факторов, при этом время протокола увеличивается с количеством необходимых промывок или с более медленной кинетикой реакции пористых агарозных бусин.

Once the solid substrate bead technology has been chosen, antibodies are coupled to the beads and the antibody coated beads can be added to the heterogeneous protein sample (e. g. homogenized tissue). At this point, antibodies that are immobilized to the beads will bind to the proteins that they specifically recognize. Once this has occurred the immunoprecipitation portion of the protocol is actually complete, as the specific proteins of interest are bound to the antibodies that are themselves immobilized to the beads. Separation of the immunocomplexes from the lysate is an extremely important series of steps, because the protein(s) must remain bound to each other (in the case of co IP) and bound to the antibody during the wash steps to remove non bound proteins and reduce background. When working with agarose beads, the beads must be pelleted out of the sample by briefly spinning in a centrifuge with forces between 600–3,000 x g (times the standard gravitational force). This step may be performed in a standard microcentrifuge tube, but for faster separation, greater consistency and higher recoveries, the process is often performed in small spin columns with a pore size that allows liquid, but not agarose beads, to pass through. After centrifugation, the agarose beads will form a very loose fluffy pellet at the bottom of the tube. The supernatant containing contaminants can be carefully removed so as not to disturb the beads. The wash buffer can then be added to the beads and after mixing, the beads are again separated by centrifugation. With superparamagnetic beads, the sample is placed in a magnetic field so that the beads can collect on the side of the tube. This procedure is generally complete in approximately 30 seconds, and the remaining (unwanted) liquid is pipetted away. Washes are accomplished by resuspending the beads (off the magnet) with the washing solution and then concentrating the beads back on the tube wall (by placing the tube back on the magnet). The washing is generally repeated several times to ensure adequate removal of contaminants. If the superparamagnetic beads are homogeneous in size and the magnet has been designed properly, the beads will concentrate uniformly on the side of the tube and the washing solution can be easily and completely removed. After washing, the precipitated protein(s) are eluted and analyzed by gel electrophoresis, mass spectrometry, western blotting, or any number of other methods for identifying constituents in the complex. Protocol times for immunoprecipitation vary greatly due to a variety of factors, with protocol times increasing with the number of washes necessary or with the slower reaction kinetics of porous agarose beads.

Шаги

Лизировать клетки и подготовить образец для иммунопреципитации. Предварительно очистить образец, пропустив его через бусины отдельно или бусины, связанные с неспецифическим антителом, чтобы удалить белки, неспецифически связывающиеся с компонентами иммунопреципитации. Инкубировать раствор с антителом к белку, представляющему интерес. Антитело можно присоединить к твердой фазе до этого этапа (прямой метод) или после него (косвенный метод). Продолжить инкубацию для формирования комплексов антиген-антитело. Осадить интересующий комплекс, отделив его от основного раствора. Промыть осажденный комплекс несколько раз. После каждой промывки центрифугировать при использовании агарозных бусин или поместить пробирку на магнит при использовании суперпарамагнитных бусин, а затем удалить надосадочную жидкость. После финальной промывки удалить максимально возможное количество надосадочной жидкости. Элюировать белки с твердой фазы, используя буфер для приготовления образцов с низким pH или SDS. Анализировать полученные комплексы или антигены, представляющие интерес. Это можно сделать различными способами: SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) с последующим окрашиванием геля. SDS-PAGE с последующим: окрашиванием геля, выделением отдельных окрашенных белковых полос и секвенированием белков в полосах методом матрично-индуцированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) масс-спектрометрии. Перенос на мембрану и вестерн-блоттинг с использованием другого антитела к белкам, взаимодействующим с антигеном, с последующим детектированием с помощью хемилюминесцентного или флуоресцентного вторичного антитела.