Белковые комплексы в водорослях: Фикоцианин и его свойства.

Введение

Белковые комплексы в водорослях

Фикоцианин — это пигментный белковый комплекс из семейства светособирающих фикобилипротеинов, наряду с аллофикоцианином и фикоэритрином. Он является вспомогательным пигментом к хлорофиллу. Все фикобилипротеины растворимы в воде, поэтому они не могут существовать внутри мембраны, как каротиноиды. Вместо этого фикобилипротеины агрегируют, образуя кластеры, которые прикрепляются к мембране, называемые фикобилисомами. Фикоцианин имеет характерный светло-синий цвет, поглощает оранжевый и красный свет, особенно около 620 нм (в зависимости от конкретного типа), и излучает флуоресценцию примерно на 650 нм (также в зависимости от типа). Аллофикоцианин поглощает и излучает на более длинных волнах, чем фикоцианин С или фикоцианин R. Фикоцианины содержатся в цианобактериях (также называемых сине-зелеными водорослями). Фикобилипротеины обладают флуоресцентными свойствами, которые используются в наборах для иммуноанализа. Фикоцианин происходит от греческого слова *phyco*, означающего «водоросли», а *цианин* — от английского слова *cyan*, которое обычно означает оттенок сине-зеленого (близкий к «aqua») и происходит от греческого *kyanos*, означающего несколько иной цвет: «темно-синий». Продукт фикоцианин, производимый *Aphanizomenon flos aquae* и спирулиной, например, используется в пищевой и напитковой промышленности в качестве натурального красителя «Lina Blue» или «EXBERRY Shade Blue» и содержится в кондитерских изделиях и мороженом. Кроме того, флуоресцентное определение пигментов фикоцианина в образцах воды является полезным методом мониторинга биомассы цианобактерий. Фикобилипротеины состоят из двух субъединиц (альфа и бета), имеющих белковый остов, к которому ковалентно присоединены 1–2 линейных тетрапирольных хромофоров. Фикоцианин часто встречается в цианобактериях, которые процветают вблизи горячих источников, поскольку он может быть стабильным до 70 °C, сохраняя идентичные спектроскопические (поглощающие свет) свойства при 20 и 70 °C. Термофилы содержат несколько иные аминокислотные последовательности, что обеспечивает их стабильность в этих более высоких условиях. Молекулярная масса составляет около 30 000 Да. Стабильность этого белка *in vitro* при этих температурах значительно ниже. Фотоспектральный анализ белка после 1 минуты экспозиции при 65 °C в очищенном состоянии показал 50% потерю третичной структуры.

Phycocyanin is a pigment protein complex from the light harvesting phycobiliprotein family, along with allophycocyanin and phycoerythrin. It is an accessory pigment to chlorophyll. All phycobiliproteins are water soluble, so they cannot exist within the membrane like carotenoids can. Instead, phycobiliproteins aggregate to form clusters that adhere to the membrane called phycobilisomes. Phycocyanin is a characteristic light blue color, absorbing orange and red light, particularly near 620 nm (depending on which specific type it is), and emits fluorescence at about 650 nm (also depending on which type it is). Allophycocyanin absorbs and emits at longer wavelengths than phycocyanin C or phycocyanin R. Phycocyanins are found in cyanobacteria (also called blue green algae). Phycobiliproteins have fluorescent properties that are used in immunoassay kits. Phycocyanin is from the Greek phyco meaning “algae” and cyanin is from the English word “cyan", which conventionally means a shade of blue green (close to "aqua") and is derived from the Greek “kyanos" which means a somewhat different color: "dark blue". The product phycocyanin, produced by Aphanizomenon flos aquae and Spirulina, is for example used in the food and beverage industry as the natural coloring agent 'Lina Blue' or 'EXBERRY Shade Blue' and is found in sweets and ice cream. In addition, fluorescence detection of phycocyanin pigments in water samples is a useful method to monitor cyanobacteria biomass. The phycobiliproteins are made of two subunits (alpha and beta) having a protein backbone to which 1–2 linear tetrapyrrole chromophores are covalently bound. C phycocyanin is often found in cyanobacteria which thrive around hot springs, as it can be stable up to around 70 °C, with identical spectroscopic (light absorbing) behaviours at 20 and 70 °C. Thermophiles contain slightly different amino acid sequences making it stable under these higher conditions. Molecular weight is around 30,000 Da. Stability of this protein in vitro at these temperatures has been shown to be substantially lower. Photo spectral analysis of the protein after 1 min exposure to 65 °C conditions in a purified state demonstrated a 50% loss of tertiary structure.

Структура

Фикоцианин имеет общую структурную схему со всеми фикобилипротеинами. Структура начинается со сборки мономеров фикобилипротеина, которые являются гетеродимерами, состоящими из α и β субъединиц, и их соответствующих хромофоров, связанных тиоэфирной связью. Каждая субъединица обычно состоит из восьми α-спиралей. Мономеры спонтанно агрегируют, образуя кольцевидные тримеры (αβ)3, обладающие вращательной симметрией и центральным каналом. Тримеры агрегируют парами, формируя гексамеры (αβ)6, иногда при участии дополнительных линкерных белков. Каждый фикобилизомовый стержень обычно содержит два или более гексамера фикоцианина. Несмотря на общую схожесть в структуре и сборке фикобилипротеинов, наблюдается большое разнообразие в конформациях гексамеров и стержней, даже если рассматривать только фикоцианины. В большем масштабе фикоцианины также различаются по кристаллической структуре, хотя биологическая значимость этого представляется дискуссионной. Например, структура C-фикоцианина из Synechococcus vulcanus была уточнена до разрешения 1,6 Ангстрема. Мономер (αβ) состоит из 332 аминокислот и 3 молекул кофактора фикоцианобилина (PCB). И α- и β-субъединицы содержат PCB в аминокислоте 84, но β-субъединица также имеет дополнительный PCB в положении 155. Этот дополнительный PCB обращен наружу тримерного кольца и, следовательно, предположительно участвует в межстержневой передаче энергии в комплексе фикобилизомы. Помимо кофакторов, существует множество предсказуемых нековалентных взаимодействий с окружающим растворителем (водой), которые, как предполагается, способствуют структурной стабильности. R-фикоцианин II (R PC II) обнаружен у некоторых видов Synechococcus. Считается, что R PC II является первым фикоцианином, содержащим PEB, происходящим от цианобактерий.

Спектральные характеристики

Фикоцианин C имеет единственный пик поглощения при ~621 нм, незначительно варьирующийся в зависимости от организма и условий, таких как температура, pH и концентрация белка in vitro. Максимум его эмиссии составляет ~642 нм. Даже при высокой концентрации фикоцианина в цианобактериях, продуктивность в океане все равно ограничена условиями освещения. Например, в исследовании в Балтийском море фикоцианин использовался в качестве маркера для нитевидных цианобактерий во время токсичных летних вспышек. Существуют различные методы производства фикоцианина, включая фотоавтотрофный, миксотрофный, гетеротрофный и рекомбинантный. Гетеротрофное производство фикоцианина не ограничено светом, согласно определению.

Биосинтез

Два гена cpcA и cpcB, расположенные в опероне cpc и транслируемые из одного мРНК-транскрипта, кодируют α и β цепи CPC соответственно. Дополнительные элементы, такие как линкерные белки и ферменты, участвующие в синтезе фикобилинов и фикобилипротеинов, часто кодируются генами в соседних кластерах генов, а оперон cpc Arthrospira platensis также кодирует линкерный белок, способствующий сборке комплексов CPC. У красных водорослей гены фикобилипротеинов и линкерных белков расположены на геноме пластид. Фикоцианобилин синтезируется из гема и встраивается в апопротеин CPC в три этапа, катализируемые ферментами. Циклический гем окисляется гемооксигеназой до линейного биливердина IXα, который затем превращается в 3Z-фикоцианобилин, основной изомер фикоцианобилина, под действием 3Z-фикоцианобилин:ферредоксин-оксидоредуктазы. Встраивание 3Z-фикоцианобилина в апопротеин CPC посредством образования тиоэфирной связи катализируется фикоцианобилин-лиазой. Промотор оперона cpc расположен в области длиной 427 п.н. выше по течению гена cpcB. У A. platensis в этой области было идентифицировано шесть потенциальных промоторных последовательностей, четыре из которых проявляют экспрессию зеленого флуоресцентного белка при трансформации в E. coli. Также продемонстрировано наличие других положительных элементов, таких как светочувствительные элементы, в той же области. Множественные промоторные и ответные последовательности в опероне cpc позволяют цианобактериям и красным водорослям регулировать свою экспрессию в ответ на различные факторы окружающей среды. Экспрессия генов cpcA и cpcB регулируется светом. Низкая интенсивность света стимулирует синтез CPC и других пигментов, в то время как синтез пигментов подавляется при высокой интенсивности света. Температура также влияет на синтез: у Arthronema africanum, цианобактерии с особенно высоким содержанием CPC и APC, наблюдается четкий максимум концентрации пигментов при 36 °C. Ограничение азота и железа индуцирует деградацию фикобилипротеинов. Органические источники углерода стимулируют синтез CPC у видов Anabaena, но, по-видимому, почти не оказывают негативного влияния у A. platensis. У родофитов Cyanidium caldarium и Galdieria sulphuraria производство CPC подавляется глюкозой, но стимулируется гемом.

The two genes cpcA and cpcB, located in the cpc operon and translated from the same mRNA transcript, encode for the C PC α and β chains respectively. Additional elements such as linker proteins, and enzymes involved in phycobilin synthesis and the phycobiliproteins are often encoded by genes in adjacent gene clusters, and the cpc operon of Arthrospira platensis also encodes a linker protein assisting in the assembly of C PC complexes. In red algae, the phycobiliprotein and linker protein genes are located on the plastid genome. Phycocyanobilin is synthesized from heme and inserted into the C PC apo protein by three enzymatic steps. Cyclic heme is oxidised to linear biliverdin IXα by heme oxygenase and further converted to 3Z phycocyanobilin, the dominant phycocyanobilin isomer, by 3Z phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase. Insertion of 3Z phycocyanobilin into the C PC apo protein via thioether bond formation is catalysed by phycocyanobilin lyase. The promoter for the cpc operon is located within the 427 bp upstream region of the cpcB gene. In A. platensis, six putative promoter sequences have been identified in the region, with four of them showing expression of green fluorescent protein when transformed into E. coli. The presence of other positive elements such as light response elements in the same region have also been demonstrated. The multiple promoter and response element sequences in the cpc operon enable cyanobacteria and red algae to adjust its expression in response to multiple environmental conditions. Expression of the cpcA and cpcB genes is regulated by light. Low light intensities stimulate synthesis of CPC and other pigments, while pigment synthesis is repressed at high light intensities. Temperature has also been shown to affect synthesis, with specific pigment concentrations showing a clear maximum at 36 °C in Arthronema africanum, a cyanobacterium with particular high C PC and APC contents. Nitrogen and also iron limitation induce phycobiliprotein degradation. Organic carbon sources stimulate C PC synthesis in Anabaena spp., but seem to have almost no effector negative effect in A. platensis. In the rhodophytes Cyanidium caldarium and Galdieria sulphuraria, C PC production is repressed by glucose but stimulated by heme.

Биотехнология

Чистые экстракты фикоцианина могут быть выделены из водорослей. Основной порядок разделения следующий. Разрушение клеточной стенки механическими воздействиями (замораживание-оттаивание) или химическими агентами (ферментами). Затем фикоцианин (C PC) выделяют центрифугированием и очищают осаждением сульфатом аммония или хроматографией – ионообменной или гель-фильтрацией. После этого образец замораживают и высушивают.

Приложения

Фикоцианин может применяться в различных областях, особенно в медицине и пищевой промышленности. Он также находит применение в генетике, где используется в качестве трейсера благодаря своей естественной флуоресценции.

Антиоксидационный и противовоспалительный

Фикоцианин обладает как антиоксидантными, так и противовоспалительными свойствами. Пероксильные, гидроксильные и алкоксильные радикалы – все окислители, нейтрализуемые фикоцианином (C PC). Однако C PC оказывает более выраженное действие на пероксильные радикалы. C PC является антиоксидантом, связывающим металлы, поскольку предотвращает перекисное окисление липидов. Нейтрализация гидроксильных радикалов эффективна при низкой освещенности и высокой концентрации C PC. Гидроксильные радикалы обнаруживаются в воспаленных участках тела. C PC, являясь антиоксидантом, нейтрализует эти вызывающие повреждения радикалы, и, таким образом, обладает противовоспалительным действием.

Нейрозащита

Избыток кислорода в мозге приводит к образованию реактивных видов кислорода (РОС). РОС повреждают нейроны мозга, вызывая снижение неврологической функции. C-фикоцианин нейтрализует перекись водорода, один из видов РОС, внутри астроцитов, тем самым снижая окислительный стресс. Астроциты также увеличивают продукцию факторов роста, таких как BDNF и NDF, что способствует регенерации нервов. C-фикоцианин также предотвращает астроглиоз и воспаление глии.

Гепатопротекция

Фикоцианин С обладает гепатопротекторными свойствами. Вадирайя и др. (1998) обнаружили повышение уровня сывороточной глутаминовой пируватной трансаминазы (SGPT) при обработке CPC гептатоксинами, такими как тетрахлорид углерода (CCl4) или R (+) пулегон. CPC защищает печень посредством системы цитохрома P450. CPC останавливает формирование опухоли до S-фазы. Синтез ДНК не происходит, поскольку опухолевые клетки переходят в G0 фазу, что предотвращает пролиферацию опухоли. Кроме того, CPC индуцирует апоптоз. При обработке клеток CPC образуются ROS (реактивные формы кислорода). Эти молекулы снижают продукцию BCl2 (регулятор апоптоза). BCl2 ингибирует белки, называемые каспазами, которые являются частью пути апоптоза. При снижении уровня BCl2 увеличивается экспрессия каспаз, что приводит к апоптозу. Этот пищевой краситель может использоваться только в продуктах, приготовленных при низких температурах, так как он не сохраняет свой синий цвет при нагревании без добавления консервантов или сахара. Тип сахара не имеет значения, CPC стабилен при высоком содержании сахара. Благодаря этому CPC может применяться в различных пищевых продуктах, в том числе в сиропах. CPC позволяет получать сиропы от зеленого до синего цвета, а добавление желтых пищевых красителей позволяет создавать различные оттенки зеленого.