Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Класс ферментов
Class of enzymes
Фермент трехалаза является гликозидной гидролазой, продуцируемой клетками в краевой зоне тонкого кишечника, которая катализирует превращение трехалозы в глюкозу. Он встречается у большинства животных. Нередуцирующий дисахарид трехалоза (α-D-глюкопиранозил-1,1-α-D-глюкопиранозид) является одним из важнейших запасающих углеводов и продуцируется почти всеми формами жизни, за исключением млекопитающих. Дисахарид гидролизуется ферментом трехалазой до двух молекул глюкозы. В Saccharomyces cerevisiae обнаружены два типа трехалаз, а именно нейтральная трехалаза (NT) и кислая трехалаза (AT), классифицированные в соответствии с их оптимальным pH [4]. Оптимальный pH для NT составляет 7,0, а для AT – 4,5. Недавно было установлено, что более 90% общей активности AT в S. cerevisiae является внеклеточной и расщепляет внеклеточную трехалозу на глюкозу в периплазматическом пространстве.
The enzyme Trehalase is a glycoside hydrolase, produced by cells in the brush border of the small intestine, which catalyzes the conversion of trehalose to glucose. It is found in most animals. The non reducing disaccharide trehalose (α D glucopyranosyl 1,1 α D glucopyranoside) is one of the most important storage carbohydrates, and is produced by almost all forms of life except mammals. The disaccharide is hydrolyzed into two molecules of glucose by the enzyme trehalase. There are two types of trehalases found in Saccharomyces cerevisiae, viz. neutral trehalase (NT) and acid trehalase (AT) classified according to their pH optima [4]. NT has an optimum pH of 7.0, while that of AT is 4.5. Recently it has been reported that more than 90% of total AT activity in S. cerevisiae is extracellular and cleaves extracellular trehalose into glucose in the periplasmic space.
Гидролиз трехалозы
Одна молекула трехалозы гидролизуется до двух молекул глюкозы ферментом трехалазой. Ферментативный гидролиз трехалозы был впервые обнаружен в Aspergillus niger Буркело в 1893 году. Фишер сообщил об этой реакции в S. cerevisiae в 1895 году. С тех пор о трехалозо-гидролизующем ферменте, трехалазе (α, α-трехалоза 1-C глюкогидролаза, EC 3.2.1.28), сообщалось из многих других организмов, включая растения и животных. Хотя трехалоза не синтезируется млекопитающими, фермент трехалаза обнаруживается в мембране щеточного края почки и мембранах кишечных ворсинок. В кишечнике функция этого фермента заключается в гидролизе потребляемой трехалозы. У людей с дефектом кишечной трехалазы возникает диарея при употреблении продуктов с высоким содержанием трехалозы, таких как грибы, что может потребовать ограничения её потребления. Предполагается, что трехалазы могут играть роль в защитных механизмах, либо фермент может участвовать в деградации трехалозы, происходящей от микроорганизмов, связанных с растениями.
One molecule of trehalose is hydrolyzed to two molecules of glucose by the enzyme trehalase. Enzymatic hydrolysis of trehalose was first observed in Aspergillus niger by Bourquelot in 1893. Fischer reported this reaction in S. cerevisiae in 1895. Since then the trehalose hydrolyzing enzyme, trehalase (α, α trehalose 1 C glucohydrolase, EC 3.2.1.28) has been reported from many other organisms including plants and animals. Though trehalose is not known to be produced by mammals, trehalase enzyme is found to be present in the kidney brush border membrane and the intestinal villi membranes. In the intestine the function of this enzyme is to hydrolyze ingested trehalose. Individuals with a defect in their intestinal trehalase have diarrhea when they eat foods with high trehalose content, such as mushrooms. hence, its removal may be required. It has been suggested that trehalases could play a role in defense mechanisms or the enzyme could play a role in the degradation of trehalose derived from plant associated microorganisms.
Грибная трехалаза
Из S. cerevisiae выделено два различных трехалазы. Одна регулируется cAMP-зависимым фосфорилированием и локализована в цитозоле. Вторая трехалазная активность обнаружена в вакуолях. Оптимальный pH для цитозольной трехалазы был определен как приблизительно 7,0, поэтому ее называют «нейтральной трехалазой» (NT); тогда как вакуолярная трехалаза наиболее активна при pH 4,5 и, соответственно, называется «кислотной трехалазой» (AT). Эти ферменты кодируются двумя различными генами – NTH1 и ATH1, соответственно.
Two distinct trehalases have been reported from S. cerevisiae. One is regulated by cAMP dependent phosphorylation and localized to the cytosol. The second trehalase activity is found in the vacuoles. The pH optimum of cytosolic trehalse was determined to be approximately 7.0 and is thus referred to as 'neutral trehalase' (NT); whereas the vacuolar trehalase is most active at pH 4.5 and consequently termed 'acid trehalase' (AT). These enzymes are encoded by two different genes – NTH1 and ATH1 respectively.
Нейтральная трехалаза
Цитозольный фермент трехалазы, NT, был очищен и всесторонне изучен на примере S. cerevisiae. В не денатурирующих гелях этот белок-фермент демонстрировал молекулярную массу 160 кДа, а в SDS-PAGE (электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) – 80 кДа. Этот гидролазный фермент специфичен к трегалозе. Сообщалось, что Km для NT составляет 5,7 мМ. Ген, ответственный за активность трехалазы в S. cerevisiae, – NTH1. Этот ген содержит открытую рамку считывания из 2079 пар оснований (bp), кодирующую белок из 693 аминокислот, что соответствует молекулярной массе 79569 Да. Активность NT регулируется фосфорилированием и дефосфорилированием белка. Фосфорилирование с помощью cAMP-зависимой протеинкиназы активирует NT. Дефосфорилирование очищенного фосфорилированного фермента щелочной фосфатазой приводило к почти полной инактивации ферментативной активности; однако восстановление активности наблюдалось при повторном фосфорилировании в присутствии АТФ и протеинкиназы. Активность NT в грубых экстрактах усиливается поликатионами, в то время как активность очищенного фосфорилированного NT ими ингибируется. Установлено, что активация грубых экстрактов обусловлена удалением полифосфатов, которые оба ингибируют активность NT.
The cytosolic trehalase enzyme, NT, has been purified and characterized extensively from S. cerevisiae. In non denaturing gels this enzyme protein exhibited a molecular mass of 160 kDa, while in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) it showed a mass of 80 kDa. This hydrolase enzyme is specific for trehalose. The Km of NT has been reported to be 5.7mM. The gene responsible for trehalase activity in S. cerevisiae is NTH1. This gene is with an open reading frame of 2079 base pairs (bp), encoding a protein of 693 amino acids, corresponding to a molecular mass of 79569 Da. NT activity is regulated by protein phosphorylation dephosphorylation. Phosphorylation with cAMP dependent protein kinase activates NT. Dephosphorylation of the purified phosphorylated enzyme by alkaline phosphatase caused an almost complete inactivation of the enzyme activity; but a recovery of the enzyme activity could be observed by rephosphorylation while incubating with ATP and protein kinase. The activity of NT in crude extracts is enhanced by polycations, while the activity of purified phosphorylated NT is inhibited by them. The activation of crude extracts was found to be due to the removal of polyphosphates, both of which inhibit NT activity.
Кислотная трехалеза
Молекулярная масса АТ была определена в 218 кДа методом гель-фильтрационной хроматографии. АТ является гликопротеином и содержит 86% углеводов. Сообщается, что созревание АТ – это ступенчатый процесс, начинающийся с белка массой 41 кДа, не содержащего углеводов. Эта форма затем подвергается гликозилированию в эндоплазматическом ретикулуме, формируя гликопротеин массой 76 кДа. В аппарате Гольджи белок дополнительно гликозилируется, образуя форму массой 180 кДа, которая в конечном итоге достигает зрелости в вакуолях, где его молекулярная масса составляет около 220 кДа. Белковый компонент фермента массой 41 кДа, не содержащий углеводов, был получен путем обработки очищенного АТ эндогликозидазой H после электрофореза в SDS-геле27. АТ демонстрирует кажущуюся Km для трегалозы около 4,7 мМ при pH 4,5. Ген, ответственный за активность АТ в S. cerevisiae, – ATH1. Сообщается, что Ath1p, то есть АТ, необходим для утилизации внеклеточной трегалозы в качестве источника углерода S. cerevisiae16. Делеционный мутант ATH1 дрожжей не мог расти на среде с трегалозой в качестве источника углерода. Исследователи предположили, что АТ перемещается из места своего синтеза в периплазматическое пространство, где связывается с экзогенной трегалозой для ее интернализации и гидролиза в вакуолях. Недавно было показано, что более 90% активности АТ в S. cerevisiae является внеклеточной, а гидролиз трегалозы до глюкозы происходит в периплазматическом пространстве. Ранее было сообщено, что высокогликозилированный белок gp37, продукт гена YGP1, коочищается с активностью АТ. Также сообщалось о коочистке активности инвертазы с активностью АТ. Считалось, что физическое взаимодействие АТ с этими двумя белками достаточно для секреции АТ по путям секреции инвертазы и gp37 в отсутствие какого-либо известного сигнала секреции для Ath1p. В штамме Candida utilis также были обнаружены один регуляторный и один нерегуляторный трегалазы. Эти два фермента отличались по молекулярной массе, поведению в ионообменной хроматографии и кинетическим свойствам. Регуляторная трегалаза, по-видимому, является цитоплазматическим ферментом, а нерегуляторная трегалаза в основном обнаруживалась в вакуолях. Однако в более позднем отчете было показано, что штамм C. utilis не содержит обнаруживаемой активности АТ, а только активность НТ. Активность АТ не была обнаружена в этом штамме, хотя было показано, что он использует внеклеточную трегалозу в качестве источника углерода.
The molecular weight of AT was found to be 218 kDa by gel filtration chromatography. AT is a glycoprotein. It has 86% carbohydrate content. It has been reported that the maturation of AT is a stepwise process beginning with a carbohydrate free 41 kDa protein; this form is then core glycosylated in the endoplasmic reticulum to form a 76 kDa glycol protein. In Golgi bodies, the protein is further glycosylated yielding a 180 kDa form, which ultimately attains a maturity in vacuoles, where its molecular weight becomes around 220 kDa. The 41 kDa carbohydrate free protein moiety of the enzyme was obtained by Endoglycosidase H treatment of purified AT, resulted after sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis27. AT exhibited an apparent Km for trehalose of about 4.7 mM at pH 4.5. The gene responsible for AT activity in S. cerevisiae is ATH1. Ath1p, i. e. AT, has been reported to be necessary for S. cerevisiae to utilize extracellular trehalose as carbon source16. ATH1 deletion mutant of the yeast could not grow in the medium with trehalose as the carbon source. Researchers have suggested that AT moves from its site of synthesis to the periplasmic space, where it binds exogenous trehalose to internalize it and hydrolyze it in the vacuoles. Recently it has been shown that more than 90% of AT activity in S. cerevisiae is extracellular and the hydrolysis of trehalose into glucose takes place at the periplasmic space. Previously, a highly glycosylated protein, gp37, which is the product of YGP1 gene, was reported to be co purified with AT activity. Invertase activity was also reported to be co purified with AT activity. The physical association of AT with these two proteins was thought to suffice for the AT to be secreted by invertase and gp37 secretion pathways in absence of any known secretion signal for Ath1p. In a Candida utils strain, one regulatory a one non regulatory trehalase were also reported. These two enzymes were reported to be distinguishable by their molecular weight, behavior in ion exchange chromatography and kinetic properties. The regulatory trehalase appeared to be a cytoplasmic enzyme and the nonregulatory enzyme was mostly detected in vacuoles. But, in a more recent report, a C. utils strain was demonstrated to lack any detectable AT activity but contain only NT activity. AT activity was not detectable in this strain, though the strain was shown to utilize extracellular trehalose as carbon source.