Метод сукрозного разрыва для изучения нервных волокон.
Sucrose gap
Метод сукрозного зазора: блокировка нервных импульсов для изучения и измерения свойств ионных каналов. Разработан для электрофизиологии и фармакологии.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Техника сахарозового разрыва используется для создания блока проведения в нервных или мышечных волокнах. Высокая концентрация сахарозы наносится во внеклеточное пространство, что предотвращает нормальное открытие и закрытие натриевых и калиевых каналов, увеличивая сопротивление между двумя группами клеток. Изначально она была разработана Робертом Стемпфли для регистрации потенциалов действия в нервных волокнах и особенно полезна для измерения необратимых или сильно варьирующихся фармакологических модификаций свойств каналов, поскольку нетронутые участки мембраны могут быть подтянуты к узлу между сахарозными областями.
The sucrose gap technique is used to create a conduction block in nerve or muscle fibers. A high concentration of sucrose is applied to the extracellular space, which prevents the correct opening and closing of sodium and potassium channels, increasing resistance between two groups of cells. It was originally developed by Robert Stämpfli for recording action potentials in nerve fibers, and is particularly useful for measuring irreversible or highly variable pharmacological modifications of channel properties since untreated regions of membrane can be pulled into the node between the sucrose regions.
История
Техника сахарозного разрыва была впервые предложена де в 1954 году, который работал с Аланом Ходжкином и Эндрю Хаксли в период с 1947 по 1949 год. На основании своих исследований, Штемпфли установил, что токи, протекающие вдоль нервных волокон, легче измерить при наличии разрыва с высоким сопротивлением, который уменьшает количество проводящей среды вне клетки. Штемпфли выявил множество проблем с методами, использовавшимися в то время для измерения мембранного потенциала. Он экспериментировал с новым методом, который назвал сахарозным разрывом. Этот метод использовался для изучения потенциалов действия в нервных волокнах. С момента его введения в технику было внесено множество улучшений и изменений. Одну из модификаций метода с однократным сахарозным разрывом предложил К. Х. В. Хойл в 1987 году. Технику двойного сахарозного разрыва, впервые примененную Ружие, Вассором и Штемпфли для изучения клеток сердечной мышцы в 1968 году, усовершенствовали К. Леоти и Ж. Аликс, разработав улучшенную камеру для двойного сахарозного разрыва с использованием техники фиксации напряжения, которая устранила внешнее сопротивление в области узла.
The sucrose gap technique was first introduced by de in 1954 who worked with Alan Hodgkin and Andrew Huxley between 1947 and 1949. From his research, Stämpfli determined that currents moving along nerve fibers can be measured more easily when there is a gap of high resistance that reduces the amount of conducting medium outside of the cell. Stämpfli observed many problems with the ways that were being used to measure membrane potential at the time. He experimented with a new method that he called the sucrose gap. The method was used to study action potentials in nerve fibers. Since its introduction, many improvements and alterations have been made to the technique. One modification of the single sucrose gap method was introduced by C. H. V. Hoyle in 1987. The double sucrose gap technique, which was first used by Rougier, Vassort, and Stämpfli to study cardiac cells in 1968, was improved by C. Leoty and J. Alix who introduced an improved chamber for the double sucrose gap with voltage clamp technique which eliminated external resistance from the node.
Метод
Классический метод сахарозного разрыва обычно состоит из трех камер, каждая из которых содержит сегмент нейрона или клеток, изучаемых в эксперименте. В тестовой камере содержится физиологический раствор, такой как раствор Кребса или Рингера, имитирующий концентрацию ионов и осмотическое давление естественной среды клетки. В эту камеру также можно добавлять тестируемые препараты для изучения их влияния на клеточную функцию. Для стимуляции клеток в тестовом растворе обычно используются электроды из платинового провода или Ag AgCl. Сахарозная камера (или разрыв) – это средняя камера, разделяющая две другие камеры или секции нервного волокна или клеток. Эта камера содержит изотонический раствор сахарозы с высоким удельным сопротивлением. Удельное сопротивление описывает способность материала или раствора оказывать сопротивление электрическому току, поэтому раствор сахарозы с высоким удельным сопротивлением эффективно электрически изолирует три камеры. Третья камера обычно содержит раствор KCl, имитирующий внутриклеточный раствор. Высокая концентрация калия в этой камере деполяризует погруженный сегмент ткани, позволяя измерять разность потенциалов между двумя сегментами, разделенными сахарозным разрывом. Вазелин, силиконовая смазка или смесь силиконового вазелина используются для фиксации нерва или ткани в положении и предотвращения диффузии раствора между камерами. Пара электродов Ag AgCl с агарным мостиком помещается в тестовую и KCl камеры для регистрации изменений мембранного потенциала. Это позволяет всему току, возникающему с одной стороны разрыва, протекать на другую сторону только через внутреннюю часть нерва или ткани. Изменения электрического потенциала между двумя сегментами относительно друг друга могут быть измерены и зарегистрированы. При использовании с соответствующей электроникой двойной сахарозный разрыв может быть использован для фиксации мембранного потенциала сегмента нерва или ткани, находящегося в тестовой камере.
A classic sucrose gap technique is typically set up with three chambers that each contain a segment of the neuron or cells that are being studied. The test chamber contains a physiological solution, such as Krebs or Ringer's solution, which mimics the ion concentration and osmotic pressure of the cell's natural environment. Test drugs can also be added to this chamber to study the effect that they have on cellular function. Ag AgCl or platinum wire electrodes are generally used for stimulating the cells in the test solution. The sucrose chamber (or gap) is the middle chamber that separates the two other chambers, or sections of the nerve fiber or cells. This chamber contains an isotonic sucrose solution of a high specific resistance. Specific resistance describes the ability of a material or solution to oppose electric current, so a sucrose solution of a high specific resistance is effective in electrically isolating the three chambers. The third chamber usually contains a KCl solution that mimics the intracellular solution. The high potassium concentration in this chamber depolarizes the immersed segment of the tissue, allowing potential differences to be measured between the two segments separated by the sucrose gap. Vaseline, silicon grease, or a silicon vaseline mixture is used to seal the nerve or tissue in position and prevent diffusion of solution between the chambers. A pair of agar bridged Ag AgCl electrodes are placed in the test and KCl chambers to record the changes in membrane potential. This allows all of the current originating on one side of the gap to flow to the other side only through the interior of the nerve or tissue. Changes in electrical potential between the two groups relative to each other can be measured and recorded. When used with proper electronics, the double sucrose gap can be used to voltage clamp the membrane potential of the nerve or tissue segment contained in the test chamber.
Ограничения
Основным ограничением метода односахарозного разрыва является то, что он не позволяет определить истинные значения мембранного потенциала и амплитуды потенциала действия. Он может измерять только относительные изменения потенциала между областями, разделенными раствором сахарозы, из-за шунтирующего эффекта. Метод двойного сахарозного разрыва, напротив, позволяет измерять мембранный потенциал и сопротивление. Другим ограничением является то, что мембранные потенциалы нельзя получить из тканей, в которых отсутствует электрическая связь между клетками (то есть когда пространственная константа λ близка к нулю). Метод сахарозного разрыва использовался для определения взаимосвязи между внешней концентрацией калия и мембранным потенциалом клеток гладкой мускулатуры мочеточников морских свиней. Он также применяется для коррекции неточных измерений мембранного потенциала, возникающих из-за утечки токов через мембрану и внеклеточного сопротивления. Коррекция неточных показаний мембранного тока также возможна с использованием метода сахарозного разрыва. Совершенствование метода сахарозного разрыва привело к разработке методов двойного сахарозного разрыва. Двойной сахарозный разрыв обычно предпочтительнее, когда требуется электрически изолировать более короткие участки нервных волокон, чем это возможно при использовании односахарозного разрыва. Метод двойного сахарозного разрыва также используется вместо односахарозного разрыва для изучения сердечной мышцы, поскольку он обеспечивает более четкое разрешение ранних токов, возникающих в течение первых 10–100 миллисекунд деполяризации.
A major limitation of the single sucrose gap is that it cannot determine the real values of the membrane potential and action potential amplitudes. It can only measure the relative changes in the potential between the regions separated by the sucrose solution because of the shunting effect. Double sucrose gap, however, can measure the membrane potential and resistance. Another limitation is that membrane potentials cannot be obtained from tissues where there is no electrical coupling between the cells (i. e. when the spatial constant, λ, is close to zero). The sucrose gap technique has been applied to determine the relation between external potassium concentration and the membrane potential of smooth muscle cells using guinea pig ureters. It has also been used to rectify inaccurate membrane potential measurements resulting from leakage currents through the membrane and extracellular resistance. Correction of an inaccurate membrane current reading is also possible through utilization of the sucrose gap method. Developments in the sucrose gap method have led to double sucrose gap techniques. A double sucrose gap is generally advantageous when used to electrically isolate smaller segments of nerve fibers than would be possible with a single sucrose gap, The double sucrose gap technique is also utilized over the single sucrose gap to study cardiac muscle, where it allows for clearer resolution of early currents, those occurring within the first 10 100 milliseconds of depolarization.