Белки SNARE: структура, функции и классификация.

Введение

Семья белков SNARE – "SNAP-рецепторы" – представляет собой большое семейство белков, состоящее как минимум из 24 членов у дрожжей, более 60 членов в клетках млекопитающих и некоторое количество у растений. Основная роль белков SNARE заключается в опосредовании слияния везикул с мембраной-мишенью; это, в частности, опосредует экзоцитоз, но также может опосредовать слияние везикул с мембранными компартментами (такими как лизосома). Наиболее изученными SNARE являются те, которые опосредуют высвобождение синаптических везикул, содержащих нейротрансмиттеры, в нейронах. Эти нейронные SNARE являются мишенью для нейротоксинов, ответственных за ботулизм и столбняк, вырабатываемых определенными бактериями.

Типы

СНАРЭ можно разделить на две категории: везикулярные или v СНАРЭ, которые включаются в мембраны транспортных везикул в процессе почкования, и целевые или t СНАРЭ, которые ассоциированы с мембранами нервных окончаний. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что t SNARE образуют стабильные подкомплексы, служащие направляющими для v SNARE, встроенных в мембрану везикулы, покрытой белком, для связывания и завершения формирования комплекса SNARE. Поскольку некоторые белки SNARE локализованы как на везикулах, так и на мембранах-мишенях, более современная схема классификации учитывает структурные особенности SNARE, разделяя их на R SNARE и Q SNARE. Часто R SNARE функционируют как v SNARE, а Q SNARE – как t SNARE. R SNARE – это белки, которые вносят остаток аргинина (R) в формирование нулевого ионного слоя в собранном основном комплексе SNARE. Одним из таких R SNARE является синаптобревин, локализованный в синаптических везикулах. Q SNARE – это белки, которые вносят остаток глутамина (Q) в формирование нулевого ионного слоя в собранном основном комплексе SNARE. К Q SNARE относятся синтаксин и SNAP 25. Q SNARE далее классифицируются как Qa, Qb или Qc SNARE в зависимости от их положения в четырехспиральном пучке.

Структура

SNARE – это небольшие, многочисленные белки, иногда с хвостовым якорем, которые часто посттрансляционно встраиваются в мембраны через C-терминальный трансмембранный домен. Семь из 38 известных SNARE, включая SNAP 25, не имеют трансмембранного домена и вместо этого прикрепляются к мембране посредством липидных модификаций, таких как пальмитоилирование. Белки с хвостовым якорем могут встраиваться в плазменную мембрану, эндоплазматический ретикулум, митохондрии и пероксисомы, среди других мембран, хотя каждый конкретный SNARE нацелен на уникальную мембрану. Нацеливание SNARE достигается путем изменения состава C-терминальных фланкирующих аминокислотных остатков или длины трансмембранного домена. Замена трансмембранного домена липидными якорями приводит к промежуточной стадии слияния мембран, когда сливаются только два контактирующих листка, а не два дистальных листка двух мембранных бислоев. Хотя SNARE значительно различаются по структуре и размеру, все они содержат сегмент в своем цитозольном домене, называемый SNARE-мотивом, состоящий из 60–70 аминокислот и содержащий гептадные повторы, способные формировать структуры скрученных катушек. V- и t-SNARE способны к обратимой сборке в плотные пучки из четырех спиралей, называемые "транс"-SNARE-комплексами. В синаптических везикулах легко формируемые метастабильные "транс"-комплексы состоят из трех SNARE: синтаксина 1 и SNAP 25, находящихся в клеточной мембране, и синаптобревина (также называемого белком мембраны, связанным с везикулой, или VAMP), закрепленного в мембране везикулы. При нейронной экзоцитозе синтаксин и синаптобревин закрепляются в соответствующих мембранах своими C-терминальными доменами, в то время как SNAP 25 прикреплен к плазменной мембране посредством нескольких палмитоильных цепей, связанных с цистеином. Ядро "транс"-SNARE-комплекса представляет собой пучок из четырех спиралей, где одна спираль представлена синтаксином 1, одна – синаптобревином, а две – SNAP 25. Было показано, что SNARE, находящиеся в плазменной мембране, присутствуют в отдельных микродоменах или кластерах, целостность которых необходима для экзоцитотической компетентности клетки.

SNAREs are small, abundant, sometimes tail anchored proteins which are often post translationally inserted into membranes via a C terminal transmembrane domain. Seven of the 38 known SNAREs, including SNAP 25, do not have a transmembrane domain and are instead attached to the membrane via lipid modifications such as palmitoylation. Tail anchored proteins can be inserted into the plasma membrane, endoplasmic reticulum, mitochondria, and peroxisomes among other membranes, though any particular SNARE is targeted to a unique membrane. The targeting of SNAREs is accomplished by altering either the composition of the C terminal flanking amino acid residues or the length of the transmembrane domain. Replacement of the transmembrane domain with lipid anchors leads to an intermediate stage of membrane fusion where only the two contacting leaflets fuse and not the two distal leaflets of the two membrane bilayer. Although SNAREs vary considerably in structure and size, they all share a segment in their cytosolic domain called a SNARE motif that consists of 60 70 amino acids and contains heptad repeats that have the ability to form coiled coil structures. V and t SNAREs are capable of reversible assembly into tight, four helix bundles called "trans" SNARE complexes. In synaptic vesicles, the readily formed metastable "trans" complexes are composed of three SNAREs: syntaxin 1 and SNAP 25 resident in cell membrane and synaptobrevin (also referred to as vesicle associated membrane protein or VAMP) anchored in the vesicle membrane. In neuronal exocytosis, syntaxin and synaptobrevin are anchored in respective membranes by their C terminal domains, whereas SNAP 25 is tethered to the plasma membrane via several cysteine linked palmitoyl chains. The core trans SNARE complex is a four helix bundle, where one helix is contributed by syntaxin 1, one helix by synaptobrevin and two helices are contributed by SNAP 25. The plasma membrane resident SNAREs have been shown to be present in distinct microdomains or clusters, the integrity of which is essential for the exocytotic competence of the cell.

Мембранный синтез

Во время слияния мембран белки v SNARE и t SNARE на отдельных мембранах объединяются, образуя транс-SNARE-комплекс, также известный как "SNAREpin". В зависимости от стадии слияния мембран, эти комплексы могут называться по-разному. При слиянии транс-SNARE-комплексов мембраны сливаются, а белки SNARE, участвующие в образовании комплекса после слияния, затем называются "цис"-SNARE-комплексом, поскольку они теперь находятся в одной (или цис) результирующей мембране. После слияния цис-SNARE-комплекс связывается и разбирается адапторным белком альфа-SNAP. Затем гексамерная АТФаза (AAA-типа), называемая NSF, катализирует АТФ-зависимое раскладывание белков SNARE и высвобождает их в цитозоль для рециркуляции. Считается, что SNARE являются основными необходимыми компонентами механизма слияния и могут функционировать независимо от дополнительных цитозольных вспомогательных белков. Это было продемонстрировано путем создания "инвертированных" SNARE, у которых SNARE-домены обращены к внеклеточному пространству, а не к цитозолю. Когда клетки, содержащие v SNARE, контактируют с клетками, содержащими t SNARE, образуются транс-SNARE-комплексы и происходит слияние клеток.

Компоненты

Ядро комплекса SNARE представляет собой пучок из четырех спиралей. Синаптобревин и синтаксин вносят по одной спирали, а SNAP 25 – две спирали (обозначаются как Sn1 и Sn2). Взаимодействующие аминокислотные остатки, обеспечивающие «застегивание» комплекса SNARE, можно сгруппировать в слои. Каждый слой состоит из четырех аминокислотных остатков – по одному от каждой из четырех спиралей. В центре комплекса находится нулевой ионный слой, состоящий из одного остатка аргинина (R) и трех остатков глутамина (Q), окруженный лейциновыми «молниями». Слои «0», «+1» и «+2» в центре комплекса наиболее близко соответствуют идеальной геометрии и аминокислотному составу лейциновой «молнии». Нулевой ионный слой состоит из R56 из VAMP 2, Q226 из синтаксина 1A, Q53 из Sn1 и Q174 из Sn2 и полностью погребен внутри лейциновых слоев. Положительно заряженная гуанидиновая группа остатка аргинина (R) взаимодействует с карбоксильными группами каждого из трех остатков глутамина (Q). Фланкирующие лейциновые слои действуют как водонепроницаемый барьер, экранируя ионные взаимодействия от окружающего растворителя. Воздействие нулевого ионного слоя на водный растворитель вследствие разрушения фланкирующих лейциновых слоев приводит к нестабильности комплекса SNARE и является предполагаемым механизмом, посредством которого SNAP и NSF рециркулируют комплексы SNARE после завершения экзоцитоза синаптических везикул.

Сборка

Белки SNARE должны собираться в транс-SNARE комплексы, чтобы обеспечить силу, необходимую для слияния везикул. Четыре α-спиральных домена (по одному от синаптобревина и синтаксина и два от SNAP 25) объединяются, образуя мотив скрученной катушки. Лимитирующим этапом в процессе сборки является ассоциация SNARE домена синтаксина, поскольку он обычно находится в "закрытом" состоянии, не способном взаимодействовать с другими белками SNARE. Когда синтаксин находится в открытом состоянии, формирование транс-SNARE комплекса начинается с ассоциации четырех SNARE доменов на их N-концах. SNARE домены формируют мотив скрученной катушки в направлении C-концов соответствующих доменов. SNAP и NSF также ассоциируются с комплексом, образованным SNARE во время этого этапа, и участвуют в последующих событиях прайминга и дезассемблирования. Считается, что белок Munc18 играет роль в сборке SNARE комплекса, хотя точный механизм его действия все еще обсуждается. Известно, что "захват" Munc18 блокирует синтаксин в закрытой конформации, связываясь с его α-спиральными SNARE доменами, что препятствует включению синтаксина в SNARE комплексы (и, следовательно, препятствует слиянию). Этот возможный механизм диссоциации и последующей реассоциации с SNARE доменами может быть кальций-зависимым. Это подтверждает идею о том, что Munc18 играет ключевую регуляторную роль в слиянии везикул: при нормальных условиях Munc18 предотвращает образование SNARE комплекса, но при активации Munc18 фактически способствует сборке SNARE комплекса и тем самым действует как катализатор слияния. Когда транс-SNARE комплекс сформирован, белки SNARE все еще находятся на противоположных мембранах. По мере того как SNARE домены продолжают скручиваться в спонтанном процессе, они образуют гораздо более плотный и стабильный четырехспиральный пучок. Считается, что во время этого "застегивания" SNARE комплекса часть высвобождаемой энергии от связывания сохраняется в виде молекулярного напряжения изгиба в отдельных мотивах SNARE. Предполагается, что это механическое напряжение хранится в полужестких линкерных областях между трансмембранными доменами и спиральным пучком SNARE. Энергетически неблагоприятный изгиб минимизируется, когда комплекс перемещается периферически к месту слияния мембран. В результате, снятие напряжения преодолевает отталкивающие силы между везикулой и клеточной мембраной и прижимает две мембраны друг к другу. Было предложено несколько моделей, объясняющих последующий этап – формирование стебля и пор слияния. Однако точная природа этих процессов остается предметом дискуссий. В соответствии с гипотезой "застежки-молнии", по мере формирования SNARE комплекса, затягивающийся спиральный пучок оказывает торсионную силу на трансмембранные (TM) домены синаптобревина и синтаксина. Это заставляет TM домены наклоняться внутри отдельных мембран по мере более плотного скручивания белков. Нестабильная конфигурация TM доменов в конечном итоге приводит к слиянию двух мембран, и белки SNARE объединяются в одной мембране, которая называется "цис"-SNARE комплексом. В результате перестройки липидов открывается пор слияния, позволяющий химическому содержимому везикулы просачиваться во внешнюю среду. Континуальное объяснение формирования стебля предполагает, что слияние мембран начинается с бесконечно малого радиуса, пока оно не расширится радиально в стеблевидную структуру. Однако такое описание не учитывает молекулярную динамику мембранных липидов. Недавние молекулярные симуляции показывают, что близость мембран позволяет липидам распластываться, при этом популяция липидов вставляет свои гидрофобные хвосты в соседнюю мембрану, эффективно сохраняя "опору" в каждой мембране. Разрешение состояния распластанных липидов происходит спонтанно, образуя структуру стебля. В этом молекулярном представлении состояние распластанных липидов является лимитирующим барьером скорости, а не формирование стебля, которое теперь становится энергетическим минимумом. Энергетический барьер для установления конформации распластанных липидов прямо пропорционален межмембранному расстоянию. Таким образом, SNARE комплексы и их сближение двух мембран могут обеспечить свободную энергию, необходимую для преодоления этого барьера.

SNARE proteins must assemble into trans SNARE complexes to provide the force that is necessary for vesicle fusion. The four α helix domains (1 each from synaptobrevin and syntaxin, and 2 from SNAP 25) come together to form a coiled coil motif. The rate limiting step in the assembly process is the association of the syntaxin SNARE domain, since it is usually found in a "closed" state where it is incapable of interacting with other SNARE proteins. When syntaxin is in an open state, trans SNARE complex formation begins with the association of the four SNARE domains at their N termini. The SNARE domains proceed in forming a coiled coil motif in the direction of the C termini of their respective domains. SNAP and NSF also associate with the complex formed by SNAREs during this step and participate in the later events of priming and disassembly. The SM protein Munc18 is thought to play a role in assembly of the SNARE complex, although the exact mechanism by which it acts is still under debate. It is known that the clasp of Munc18 locks syntaxin in a closed conformation by binding to its α helical SNARE domains, which inhibits syntaxin from entering SNARE complexes (thereby inhibiting fusion). This possible mechanism of dissociation and subsequent re association with the SNARE domains could be calcium dependent. This supports the idea that Munc18 plays a key regulatory role in vesicle fusion; under normal conditions the SNARE complex will be prevented from forming by Munc18, but when triggered the Munc18 will actually assist in SNARE complex assembly and thereby act as a fusion catalyst. When the trans SNARE complex is formed, the SNARE proteins are still found on opposing membranes. As the SNARE domains continue coiling in a spontaneous process, they form a much tighter, more stable four helix bundle. During this "zippering" of the SNARE complex, a fraction of the released energy from binding is thought to be stored as molecular bending stress in the individual SNARE motifs. This mechanical stress is postulated to be stored in the semi rigid linker regions between the transmembrane domains and the SNARE helical bundle. The energetically unfavorable bending is minimized when the complex moves peripherally to the site of membrane fusion. As a result, relief of the stress overcomes the repulsive forces between the vesicle and the cell membrane and presses the two membranes together. Several models to explain the subsequent step – the formation of stalk and fusion pore – have been proposed. However, the exact nature of these processes remains debated. In accordance with the "zipper" hypothesis, as the SNARE complex forms, the tightening helix bundle puts torsional force on the transmembrane (TM) domains of synaptobrevin and syntaxin. This causes the TM domains to tilt within the separate membranes as the proteins coil more tightly. The unstable configuration of the TM domains eventually causes the two membranes to fuse and the SNARE proteins come together within the same membrane, which is referred to as a "cis" SNARE complex. As a result of the lipid rearrangement, a fusion pore opens and allows the chemical contents of the vesicle to leak into the outside environment. The continuum explanation of stalk formation suggests that membrane fusion begins with an infinitesimal radius until it radially expands into a stalk like structure. However, such a description fails to take into account the molecular dynamics of membrane lipids. Recent molecular simulations show that the close proximity of the membranes allows the lipids to splay, where a population of lipids insert their hydrophobic tails into the neighboring membrane – effectively keeping a "foot" in each membrane. The resolution of the splayed lipid state proceeds spontaneously to form the stalk structure. In this molecular view, the splayed lipid intermediate state is the rate determining barrier rather than the formation of the stalk, which now becomes the free energy minimum. The energetic barrier for establishment of the splayed lipid conformation is directly proportional to the intermembrane distance. The SNARE complexes and their pressing of the two membranes together, therefore, could provide the free energy required to overcome the barrier.

Разборка

Энергия, необходимая для слияния, опосредованного SNARE-белками, высвобождается при разборке комплекса SNARE. Предполагаемым источником энергии является N-этилмалеимид-чувствительный фактор (NSF) – АТФаза, участвующая в слиянии мембран. Гомогексамеры NSF, совместно с кофактором α SNAP, связываются с комплексом SNARE и разрывают его, сопрягая этот процесс с гидролизом АТФ. Это позволяет повторно захватывать синаптобревин для дальнейшего использования в везикулах, в то время как остальные SNARE-белки остаются связанными с клеточной мембраной. Диссоциированные SNARE-белки находятся в более высоком энергетическом состоянии, чем более стабильный цис-SNARE комплекс. Считается, что энергия, движущая слияние, возникает в результате перехода к более низкоэнергетическому цис-SNARE комплексу. Гидролиз АТФ, сопряженный с диссоциацией комплексов SNARE, представляет собой энергетическую затрату, которую можно сравнить с "взведением курка", чтобы, после запуска слияния везикул, процесс происходил спонтанно и с оптимальной скоростью. Аналогичный процесс происходит в мышцах, где головки миозина должны сначала гидролизовать АТФ, чтобы принять необходимую конформацию для взаимодействия с актином и последующего осуществления рабочего хода.

Регулирование с помощью пальмитоиляции SNAP-25

Q SNARE белок, ассоциированный с синаптосомами 25 (SNAP 25), состоит из двух α-спиральных доменов, соединенных линкером с произвольной конформацией. Область линкера с произвольной конформацией наиболее заметна своими четырьмя остатками цистеина. α-спиральные домены объединяются с доменами синтаксина и синаптобревина (также известного как белок мембраны, связанный с везикулами, или VAMP) для формирования 4 α-спирального спирального SNARE-комплекса, критически важного для эффективного экзоцитоза. В то время как синтаксин и синаптобревин содержат трансмембранные домены, обеспечивающие докинг с мембранами мишени и везикул соответственно, SNAP 25 полагается на пальмитоилирование остатков цистеина, находящихся в его области с произвольной конформацией, для докинга к мембране мишени. Некоторые исследования показали, что взаимодействие с синтаксином посредством SNARE-взаимодействий исключает необходимость в таких механизмах докинга. Однако исследования с нокдауном синтаксина не показали снижения количества SNAP 25, связанного с мембраной, что указывает на существование альтернативных механизмов докинга. Следовательно, ковалентное присоединение цепей жирных кислот к SNAP 25 посредством тиоэфирных связей с одним или несколькими остатками цистеина обеспечивает регуляцию докинга и, в конечном итоге, экзоцитоза, опосредованного SNARE. Этот процесс опосредован специализированным ферментом, называемым DHHC пальмитоилтрансферазой. Было также показано, что богатый цистеином домен SNAP 25 слабо ассоциируется с плазматической мембраной, что, возможно, позволяет ему локализоваться вблизи фермента для последующего пальмитоилирования. Обратный процесс катализируется другим ферментом, называемым пальмитоилбелковой тиоэстеразой (см. рисунок). Также предполагается, что доступность SNAP 25 в SNARE-комплексе может пространственно регулироваться посредством локализации липидных микродоменов в мембране мишени. Пальмитоилированные остатки цистеина могут быть локализованы в желаемой области мембраны мишени посредством благоприятной липидной среды (возможно, богатой холестерином), комплементарной цепям жирных кислот, связанным с остатками цистеина SNAP 25. Дальнейшие исследования выявили возможные связи между сверхэкспрессией/подэкспрессией SNAP 25 и различными заболеваниями мозга. При синдроме дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) полиморфизмы в локусе гена SNAP 25 у людей были связаны с этим заболеванием, что указывает на потенциальную роль в его проявлении. Это подтверждается гетерогенными исследованиями нокаута SNAP 25 на мышах с мутацией колобома, которые привели к фенотипическим характеристикам, наблюдаемым при СДВГ. Исследования также показали корреляцию между сверхэкспрессией/подэкспрессией SNAP 25 и развитием шизофрении.

The Q SNARE protein Synaptosomal associated protein 25 (SNAP 25) is composed of two α helical domains connected by a random coil linker. The random coil linker region is most notable for its four cysteine residues. The α helical domains combine with those of both syntaxin and synaptobrevin (also known as vesicle associated membrane protein or VAMP) to form the 4 α helix coiled coil SNARE complex critical to efficient exocytosis. While syntaxin and synaptobrevin both contain transmembrane domains which allow for docking with target and vesicle membranes respectively, SNAP 25 relies on the palmitoylation of cysteine residues found in its random coil region for docking to the target membrane. Some studies have suggested that association with syntaxin via SNARE interactions precludes the need for such docking mechanisms. Syntaxin knockdown studies however, failed to show a decrease in membrane bound SNAP 25 suggesting alternate docking means exist. The covalent bonding of fatty acid chains to SNAP 25 via thioester linkages with one or more cysteine residues therefore, provides for regulation of docking and ultimately SNARE mediated exocytosis. This process is mediated by a specialized enzyme called DHHC palmitoyl transferase. The cysteine rich domain of SNAP 25 has also been shown to weakly associate with the plasma membrane possibly allowing it to be localized near the enzyme for subsequent palmitoylation. The reverse of this process is carried out by another enzyme called palmitoyl protein thioesterase (see figure). The availability of SNAP 25 in the SNARE complex is also theorized to possibly be spatially regulated via localization of lipid microdomains in the target membrane. Palmitoylated cysteine residues could be localized to the desired target membrane region via a favorable lipid environment (possibly cholesterol rich) complementary to the fatty acid chains bonded to the cysteine residues of SNAP 25. Further investigation has suggested possible relationships between SNAP 25 over/underexpression and a variety of brain diseases. In attention deficit/hyperactivity disorder or ADHD, polymorphisms at the SNAP 25 gene locus in humans have been linked to the disease suggesting a potential role in its manifestation. This is further suggested by heterogeneous SNAP 25 knockout studies performed on coloboma mutant mice, which led to phenotypic characteristics of ADHD. Studies have also shown a correlation of SNAP 25 over/underexpression and the onset of schizophrenia.

Синтаксин и домен Habc

Синтаксин состоит из трансмембранного домена (ТМД), альфа-спирального SNARE-домена, короткой линкерной области и Habc-домена, который состоит из трех альфа-спиральных областей. SNARE-домен синтаксина служит местом прикрепления SNAP 25 и синаптобревина для формирования четырехспирального пучка, необходимого для образования SNARE-комплекса и последующего слияния. Однако Habc-домен выполняет функцию автоингибирующего домена в синтаксине. Показано, что он складывается и взаимодействует с SNARE-доменом синтаксина, индуцируя "закрытое" состояние и создавая физический барьер для формирования SNARE-мотива. В то же время, Habc-домен может диссоциировать от SNARE-домена, освобождая синтаксин для взаимодействия как с SNAP 25, так и с синаптобревином.

Синтаксин 1B и легко высвобождающийся пуль везикулов

Существует огромное разнообразие подтипов синтаксинов, в геноме человека их насчитывается 15 разновидностей. Предполагается, что синтаксин 1B участвует в регуляции числа синаптических везикул, готовых к экзоцитозу в аксонном окончании. Это также называют пулом везикул, готовых к высвобождению (RRP). Исследование с использованием нокаута, проведенное в 2014 году, показало, что отсутствие синтаксина 1B привело к значительному уменьшению размера RRP.

Токсины

Многие нейротоксины напрямую влияют на SNARE-комплексы. Такие токсины, как ботулинический и столбнячный, действуют, воздействуя на компоненты SNARE. Эти токсины нарушают нормальную рециркуляцию везикул и приводят к ухудшению контроля мышц, спазмам, параличу и даже смерти.

Ботулиновый нейротоксин

Ботулинический токсин (BoNT) – один из самых мощных токсинов, когда-либо обнаруженных. Это протеолитический фермент, который расщепляет белки SNARE в нейронах. Его белковая структура состоит из двух пептидных субъединиц: тяжелой цепи (100 кДа) и легкой цепи (50 кДа), соединенных дисульфидной связью. Механизм действия BoNT включает 4 этапа: связывание с нейронной мембраной, эндоцитоз, мембранную транслокацию и протеолиз белков SNARE. В своем механизме действия тяжелая цепь BoNT первоначально используется для поиска нейронных мишеней и связывания с ганглиозидами и мембранными белками пресинаптических нейронов. Затем токсин эндоцитозируется в клеточную мембрану. Тяжелая цепь претерпевает конформационные изменения, необходимые для транслокации легкой цепи в цитозоль нейрона. Наконец, после доставки легкой цепи BoNT в цитозоль целевого нейрона, она высвобождается из тяжелой цепи, чтобы достичь активных участков расщепления на белках SNARE. Легкая цепь BoNT действует как металлопротеаза на белках SNARE, зависимая от ионов Zn(II), расщепляя их и блокируя их функцию в экзоцитозе. Существует 8 известных изотипов BoNT – от BoNT/A до BoNT/H, каждый из которых имеет различные специфические участки расщепления на белках SNARE. SNAP25, член семейства белков SNARE, расположенный в мембране клеток, расщепляется изотипами BoNT A, C и E. Расщепление SNAP25 этими изотипами BoNT значительно ингибирует их функцию в формировании SNARE-комплекса для слияния везикул с синаптической мембраной. BoNT/C также воздействует на синтаксин 1, другой белок SNARE, расположенный в синаптической мембране, вызывая его деградацию с аналогичным результатом, как и в случае с SNAP25. Третий белок SNARE, синаптобревин (VAMP), находится на клеточных везикулах. VAMP2 является мишенью и расщепляется изотипами BoNT B, D и F в синаптических нейронах.

Нейротоксин от столбняка

Токсин столбнячной палочки, или TeNT, состоит из тяжелой цепи (100 кДа) и легкой цепи (50 кДа), соединенных дисульфидной связью. Тяжелая цепь отвечает за нейроспецифическое связывание TeNT с мембраной нервного окончания, эндоцитоз токсина и транслокацию легкой цепи в цитозоль. Легкая цепь обладает активностью цинкзависимой эндопептидазы, а точнее – матричной металлопротеиназы (ММП), посредством которой осуществляется расщепление синаптобревина или VAMP. Для активации легкой цепи TeNT к каждой молекуле токсина должен быть присоединен один атом цинка. После связывания цинка происходит восстановление дисульфидной связи главным образом посредством системы редокс тиоредоксин-редуктазы NADPH. Затем легкая цепь становится свободной для расщепления пептидной связи Gln76-Phe77 синаптобревина. Это расщепление синаптобревина является конечной мишенью TeNT, и даже в низких дозах нейротоксин ингибирует экзоцитоз нейротрансмиттера.

Роль в высвобождении нейротрансмиттеров

Нейротрансмиттеры хранятся в легко высвобождаемых пулах везикул, заключенных в пресинаптическом окончании. Во время нейросекреции/экзоцитоза SNARE играют ключевую роль в стыковке, подготовке, слиянии и синхронизации высвобождения нейротрансмиттеров в синаптическую щель. Первым этапом слияния синаптических везикул является прикрепление, когда везикулы перемещаются из резервного пула в физический контакт с мембраной. На мембране Munc 18 изначально связан с синтаксином 1A в закрытой конформации. Предполагается, что диссоциация Munc 18 от комплекса освобождает синтаксин 1A для связывания с v-SNARE белками. Следующим этапом высвобождения является стыковка везикул, при которой v- и t-SNARE белки транзиторно ассоциируют друг с другом независимо от кальция. Затем везикулы подготавливаются, при этом SNARE мотивы формируют стабильное взаимодействие между везикулой и мембраной. Комплексины стабилизируют подготовленный SNARE комплекс, делая везикулы готовыми к быстрой экзоцитозе. Участок пресинаптической мембраны, содержащий подготовленные везикулы и плотное скопление SNARE белков, называется активной зоной. Кальциевые каналы, активируемые потенциалом, высоко сконцентрированы вокруг активных зон и открываются в ответ на деполяризацию мембраны в синапсе. Приток кальция воспринимается синаптотагмином 1, который, в свою очередь, высвобождает белок комплексин и позволяет везикуле слиться с пресинаптической мембраной для высвобождения нейротрансмиттера. Также было показано, что кальциевые каналы, активируемые потенциалом, напрямую взаимодействуют с t-SNARE белками синтаксином 1A и SNAP 25, а также с синаптотагмином 1. Эти взаимодействия способны ингибировать активность кальциевых каналов, а также плотно агрегировать молекулы вокруг места высвобождения. Существует множество клинических случаев, связывающих гены SNARE с неврологическими расстройствами. Дефицит SNAP 25 мРНК наблюдается в гиппокампальной ткани некоторых пациентов с шизофренией, однонуклеотидный полиморфизм SNAP 25 связан с гиперактивностью при расстройствах аутистического спектра, а сверхэкспрессия SNAP 25B приводит к раннему началу биполярного расстройства. SNARE играют важную роль в опосредовании слияния везикул во время инициации и расширения фагофоров, а также в слиянии аутофагосом с лизосомами на поздних стадиях аутофагии. Хотя механизм инициации фагофора у млекопитающих неизвестен, SNARE были вовлечены в формирование фагофора посредством гомотипического слияния небольших, покрытых клатрином, одномембранных везикул, содержащих Atg16L, v-SNARE VAMP7 и его партнерские t-SNARE: Syntaxin 7, Syntaxin 8 и VTI1B. У дрожжей t-SNARE Sec9p и Sso2p необходимы для экзоцитоза и способствуют тубуловезикулярному почкованию везикул, положительных по Atg9, которые также необходимы для биогенеза аутофагосом. Выключение любого из этих SNARE приводит к накоплению небольших везикул, содержащих Atg9, которые не сливаются, тем самым предотвращая образование преавтофагосомной структуры. Недавно синтаксин 17 (STX17) был идентифицирован как SNARE, ассоциированный с аутофагосомами, который взаимодействует с VAMP8 и SNAP29 и необходим для слияния с лизосомой. STX17 локализуется на внешней мембране аутофагосом, но не фагофоров или других предшественников аутофагосом, что предотвращает их преждевременное слияние с лизосомой. У дрожжей для слияния аутофагосом с вакуолями (эквивалент лизосом у дрожжей) требуются SNARE и связанные с ними белки, такие как гомолог синтаксина Vam3, гомолог SNAP 25 Vam7, Ras-подобный GTPase Ypt7 и ортолог NSF, Sec18.

Neurotransmitters are stored in readily releasable pools of vesicles confined within the presynaptic terminal. During neurosecretion/exocytosis, SNAREs play a crucial role in vesicle docking, priming, fusion, and synchronization of neurotransmitter release into the synaptic cleft. The first step in synaptic vesicle fusion is tethering, where the vesicles are translocated from the reserve pool into physical contact with the membrane. At the membrane, Munc 18 is initially bound to syntaxin 1A in a closed structure. It is postulated that the dissociation of Munc 18 from the complex frees syntaxin 1A to bind with the v SNARE proteins. The next step in release is the docking of vesicles, where the v and t SNARE proteins transiently associate in a calcium independent manner. The vesicles are then primed, wherein the SNARE motifs form a stable interaction between the vesicle and membrane. Complexins stabilize the primed SNARE complex rendering the vesicles ready for rapid exocytosis. The span of presynaptic membrane containing the primed vesicles and dense collection of SNARE proteins is referred to as the active zone. Voltage gated calcium channels are highly concentrated around active zones and open in response to membrane depolarization at the synapse. The influx of calcium is sensed by synaptotagmin 1, which in turn dislodges complexin protein and allows the vesicle to fuse with the presynaptic membrane to release neurotransmitter. It has also been shown that the voltage gated calcium channels directly interact with the t SNAREs syntaxin 1A and SNAP 25, as well as with synaptotagmin 1. The interactions are able to inhibit calcium channel activity as well as tightly aggregate the molecules around the release site. There have been many clinical cases that link SNARE genes with neural disorders. Deficiency in SNAP 25 mRNA has been observed in hippocampal tissue of some schizophrenic patients, a SNAP 25 single nucleotide polymorphism is linked to hyperactivity in autism spectrum disorders, and overexpression of SNAP 25B leads to the early onset of bipolar disorder. SNAREs play important roles in mediating vesicle fusion during phagophore initiation and expansion as well as autophagosome lysosome fusion in the later stages of autophagy. Though the mechanism of phagophore initiation in mammals is unknown, SNAREs have been implicated in phagophore formation through homotypic fusion of small, clathrin coated, single membrane vesicles containing Atg16L, the v SNARE VAMP7, and its partner t SNAREs: Syntaxin 7, Syntaxin 8, and VTI1B. In yeast, the t SNAREs Sec9p and Sso2p are required for exocytosis and promote tubulovesicular budding of Atg9 positive vesicles, which are also required for autophagosome biogenesis. Knocking out either of these SNAREs leads to accumulation of small Atg9 containing vesicles that do not fuse, therefore preventing the formation of the pre autophagosomal structure. Recently, syntaxin 17 (STX17) was identified as an autophagosome associated SNARE that interacts with VAMP8 and SNAP29 and is required for fusion with the lysosome. STX17 is localized on the outer membrane of autophagosomes, but not phagophores or other autophagosome precursors, which prevents them from prematurely fusing with the lysosome. In yeast, the fusion of autophagosomes with vacuoles (the yeast equivalent of lysosomes) requires SNAREs and related proteins such as the syntaxin homolog Vam3, SNAP 25 homolog Vam7, Ras like GTPase Ypt7, and the NSF ortholog, Sec18.

Гибкая замена компонентов

Известно несколько комплексов, способных гибко заменять один белок другим: два Qa SNARE у дрожжей могут в определенной степени замещать друг друга. Дрожжи, потерявшие R SNARE Sec22p, автоматически повышают уровень гомолога Ykt6p и используют его аналогичным образом. Хотя дрозофилы не могут выжить при потере компонента SNAP 25, SNAP 24 может полностью его заменить. Кроме того, у дрозофил R SNARE, обычно не встречающийся в синапсах, способен замещать синаптбровин.

В растениях

СНАРЭ также встречаются у растений, и получено некоторое понимание их распространения и роли. Часто было установлено, что они необходимы для транспорта везикул, в том числе, как показано в работе Zheng et al. (1999) в отношении траффика между аппаратом Гольджи и вакуолью. Большинство этих исследований проводились на Arabidopsis.