Картирование генов: методы и применение

Введение

Процесс определения местоположения конкретных генов.

Картирование генов или картирование генома описывает методы, используемые для определения местоположения гена на хромосоме и расстояний между генами. Картографирование генов также может описывать расстояния между различными участками внутри гена. Суть всего картирования генома заключается в определении положения коллекции молекулярных маркеров на соответствующих участках генома. Молекулярные маркеры бывают самых разных видов. Гены можно рассматривать как особый тип генетических маркеров при построении карт генома и наносить на карту так же, как и любые другие маркеры. В некоторых областях исследований картирование генов способствует созданию новых рекомбинантов в организме. Карты генов помогают описать пространственное расположение генов на хромосоме. Генам присваивается конкретное местоположение на хромосоме, известное как локус, и они могут использоваться в качестве молекулярных маркеров для определения расстояния между другими генами на хромосоме. Карты предоставляют исследователям возможность прогнозировать закономерности наследования определенных признаков, что в конечном итоге может привести к лучшему пониманию признаков, связанных с заболеваниями. Генетическая основа карт генов заключается в создании схемы, которая потенциально может помочь исследователям проводить секвенирование ДНК. Карта генов помогает определить относительное положение генов и позволяет исследователям находить интересующие области в геноме. Затем гены можно быстро идентифицировать и секвенировать. Два подхода к созданию карт генов (картированию генов) включают физическое картирование и генетическое картирование. Физическое картирование использует методы молекулярной биологии для изучения хромосом. Эти методы позволяют исследователям непосредственно наблюдать хромосомы, чтобы можно было построить карту с относительным положением генов. Генетическое картирование, напротив, использует генетические методы для косвенного определения связи между генами. Методы могут включать эксперименты по скрещиванию (гибридизации) и изучение родословных. Эти методы позволяют создавать карты для анализа относительного положения генов и других важных последовательностей, а также физические карты. Расстояния на генетических картах основаны на информации о генетической сцепленности, в то время как физические карты используют фактические физические расстояния, обычно измеряемые в количестве пар оснований. Хотя физическая карта может быть более точным представлением генома, генетические карты часто дают представление о природе различных областей хромосомы; например, отношение генетического расстояния к физическому расстоянию сильно варьируется в разных геномных областях, что отражает различные скорости рекомбинации, и такая скорость часто указывает на эухроматические (обычно богатые генами) и гетерохроматические (обычно бедные генами) области генома.

Gene mapping or genome mapping describes the methods used to identify the location of a gene on a chromosome and the distances between genes. Gene mapping can also describe the distances between different sites within a gene. The essence of all genome mapping is to place a collection of molecular markers onto their respective positions on the genome. Molecular markers come in all forms. Genes can be viewed as one special type of genetic markers in the construction of genome maps, and mapped the same way as any other markers. In some areas of study, gene mapping contributes to the creation of new recombinants within an organism. Gene maps help describe the spatial arrangement of genes on a chromosome. Genes are designated to a specific location on a chromosome known as the locus and can be used as molecular markers to find the distance between other genes on a chromosome. Maps provide researchers with the opportunity to predict the inheritance patterns of specific traits, which can eventually lead to a better understanding of disease linked traits. The genetic basis to gene maps is to provide an outline that can potentially help researchers carry out DNA sequencing. A gene map helps point out the relative positions of genes and allows researchers to locate regions of interest in the genome. Genes can then be identified quickly and sequenced quickly. Two approaches to generating gene maps (gene mapping) include physical mapping and genetic mapping. Physical mapping utilizes molecular biology techniques to inspect chromosomes. These techniques consequently allow researchers to observe chromosomes directly so that a map may be constructed with relative gene positions. Genetic mapping on the other hand uses genetic techniques to indirectly find association between genes. Techniques can include cross breeding (hybrid) experiments and examining pedigrees. These technique allow for maps to be constructed so that relative positions of genes and other important sequences can be analyzed. and physical maps. genetic maps' distances are based on the genetic linkage information, while physical maps use actual physical distances usually measured in number of base pairs. While the physical map could be a more accurate representation of the genome, genetic maps often offer insights into the nature of different regions of the chromosome, for example the genetic distance to physical distance ratio varies greatly at different genomic regions which reflects different recombination rates, and such rate is often indicative of euchromatic (usually gene rich) vs heterochromatic (usually gene poor) regions of the genome.

Генетическое отображение

Исследователи начинают построение генетической карты со сбора образцов крови, слюны или тканей у членов семьи, несущих выраженное заболевание или признак, и у членов семьи, которые не являются носителями. Наиболее часто используемым образцом при генетическом картировании, особенно в персональных геномных тестах, является слюна. Затем ученые выделяют ДНК из образцов и тщательно изучают ее, выявляя уникальные паттерны в ДНК членов семьи, которые действительно несут заболевание, и в ДНК тех, кто не является носителем. Эти уникальные молекулярные паттерны в ДНК называются полиморфизмами или маркерами. Первыми шагами в создании генетической карты являются разработка генетических маркеров и создание картографической популяции. Чем ближе расположены два маркера на хромосоме, тем выше вероятность, что они будут переданы следующему поколению вместе. Следовательно, паттерны "косегрегации" всех маркеров можно использовать для восстановления их порядка. С учетом этого, генотипы каждого генетического маркера регистрируются как для родителей, так и для каждого индивидуума в последующих поколениях. Качество генетических карт во многом зависит от следующих факторов: количества генетических маркеров на карте и размера картографируемой популяции. Эти два фактора взаимосвязаны, поскольку большая картографирующая популяция может повысить "разрешение" карты и предотвратить ее "насыщение". В генетическом картировании любой признак последовательности, который можно достоверно отличить у двух родителей, может быть использован в качестве генетического маркера. Гены, в этом отношении, представлены "признаками", которые можно достоверно различить у двух родителей. Их связь с другими генетическими маркерами рассчитывается так же, как если бы это были обычные маркеры, а фактические локусы генов затем локализуются в области между двумя ближайшими соседними маркерами. Затем весь процесс повторяется с использованием дополнительных маркеров, нацеленных на эту область, для более точного картирования окрестностей гена, пока не будет идентифицирован конкретный причинный локус. Этот процесс часто называют "позиционным клонированием", и он широко используется в изучении видов растений. В частности, позиционное клонирование активно применяется в изучении кукурузы. Главное преимущество генетического картирования заключается в том, что оно позволяет определить относительное положение генов, основываясь исключительно на их фенотипическом эффекте. Генетическое картирование – это способ точно установить, на какой хромосоме находится какой ген и точно определить его местоположение на этой хромосоме. Картографирование также служит методом определения того, какой ген с наибольшей вероятностью подвергнется рекомбинации, исходя из расстояния между двумя генами. Расстояние между двумя генами измеряется в единицах, известных как центиморган или картографические единицы, эти термины взаимозаменяемы. Центиморган – это расстояние между генами, при котором один из ста продуктов мейоза является рекомбинантным.

Researchers begin a genetic map by collecting samples of blood, saliva, or tissue from family members that carry a prominent disease or trait and family members that do not. The most common sample used in gene mapping, especially in personal genomic tests is saliva. Scientists then isolate DNA from the samples and closely examine it, looking for unique patterns in the DNA of the family members who do carry the disease and the DNA of those who do not carry the disease do not have. These unique molecular patterns in the DNA are referred to as polymorphisms, or markers. The first steps of building a genetic map are the development of genetic markers and a mapping population. The closer two markers are on the chromosome, the more likely they are to be passed on to the next generation together. Therefore, the "co segregation" patterns of all markers can be used to reconstruct their order. With this in mind, the genotypes of each genetic marker are recorded for both parents and each individual in the following generations. The quality of the genetic maps is largely dependent upon these factors: the number of genetic markers on the map and the size of the mapping population. The two factors are interlinked, as a larger mapping population could increase the "resolution" of the map and prevent the map from being "saturated". In gene mapping, any sequence feature that can be faithfully distinguished from the two parents can be used as a genetic marker. Genes, in this regard, are represented by "traits" that can be faithfully distinguished between two parents. Their linkage with other genetic markers is calculated in the same way as if they are common markers and the actual gene loci are then bracketed in a region between the two nearest neighboring markers. The entire process is then repeated by looking at more markers that target that region to map the gene neighborhood to a higher resolution until a specific causative locus can be identified. This process is often referred to as "positional cloning", and it is used extensively in the study of plant species. One plant species, in particular in which positional cloning is utilized is in maize. The great advantage of genetic mapping is that it can identify the relative position of genes based solely on their phenotypic effect. Genetic mapping is a way to identify exactly which chromosome has which gene and exactly pinpointing where that gene lies on that particular chromosome. Mapping also acts as a method in determining which gene is most likely to recombine based on the distance between two genes. The distance between two genes is measured in units known as centimorgan or map units, these terms are interchangeable. A centimorgan is a distance between genes for which one product of meiosis in one hundred is recombinant.

Анализ связей

Основой анализа сцепления является понимание хромосомной локализации и идентификация генов, вызывающих заболевание. Определенные гены, генетически сцепленные или ассоциированные друг с другом, расположены близко друг к другу на одной и той же хромосоме. Во время мейоза эти гены способны наследоваться совместно и могут использоваться в качестве генетического маркера для определения фенотипа заболеваний. Поскольку анализ сцепления позволяет выявить закономерности наследования, такие исследования обычно проводятся на основе анализа родословных.

Анализ генной ассоциации

Анализ ассоциации генов основан на изучении популяций; он не фокусируется на закономерностях наследования, а опирается на всю историю популяции. Анализ ассоциации генов рассматривает конкретную популяцию и пытается установить, отличается ли частота аллеля у пациентов с заболеванием от частоты в контрольной группе здоровых людей из той же популяции. Этот метод особенно полезен для выявления сложных заболеваний, не имеющих менделевского типа наследования. Получаемый рисунок миграции ДНК – ее генетический отпечаток – используется для определения участка ДНК, содержащегося в клоне. Анализируя эти отпечатки, контиги собираются автоматизированными (FPC) или ручными (pathfinders) методами в перекрывающиеся участки ДНК. После этого можно выбрать подходящие клоны для эффективного секвенирования и определения последовательности ДНК исследуемого организма. В физическом картировании нет прямого способа маркировки конкретного гена, поскольку при картировании не учитываются признаки и функции. Генетические маркеры могут быть сопоставлены с физической картой с помощью таких методов, как in situ гибридизация. Таким образом, контиги физической карты можно "закрепить" на генетической карте. Клоны, используемые в контигах физической карты, затем можно секвенировать локально, чтобы помочь в разработке новых генетических маркеров и идентификации причинных локусов. Макрорестрикция – это тип физического картирования, при котором ДНК с высокой молекулярной массой подвергается воздействию рестрикционного фермента с небольшим количеством участков рестрикции. Существуют альтернативные способы определения перекрытий ДНК в группе клонов без полного секвенирования этих клонов. После определения карты клоны могут быть использованы как ресурс для эффективного представления больших участков генома. Этот тип картирования более точен, чем генетические карты.

Картографирование ограничений

Картирование участками рестрикции – это метод, с помощью которого получают структурную информацию о фрагменте ДНК, используя рестрикционные ферменты. Рестрикционные ферменты – это ферменты, которые разрезают фрагменты ДНК в определенных последовательностях распознавания. В основе картирования участками рестрикции лежит переваривание (или разрезание) ДНК рестрикционными ферментами. Полученные фрагменты ДНК затем разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, что позволяет получить информацию об их размере. Размеры этих фрагментов помогают определить расстояние между участками рестрикционных ферментов на анализируемой ДНК и предоставляют исследователям информацию о структуре анализируемой ДНК. ДНК-зонды, специфичные для хромосомных областей или интересующих генов, маркируют фторхромами. Присоединяя фторхромы к зондам, исследователи могут одновременно визуализировать несколько последовательностей ДНК. Когда зонд контактирует с ДНК на определенной хромосоме, происходит гибридизация. В результате получается информация о местоположении этой последовательности ДНК. FISH анализирует одноцепочечную ДНК (ssDNA). Когда ДНК находится в одноцепочечном состоянии, она может связываться со своим специфическим зондом. Этот результат подтвердил ключевую идею о том, что ген имеет линейную структуру, эквивалентную длине ДНК, с множеством участков, которые могут независимо мутировать. В 1961 году Фрэнсис Крик, Лесли Барнетт, Сидни Бреннер и Ричард Уоттс Тобин провели генетические эксперименты, которые продемонстрировали фундаментальную природу генетического кода для белков. Эти эксперименты, включавшие картирование участков мутаций в гене rIIB бактериофага T4, показали, что три последовательные нуклеотидные основы ДНК гена определяют каждую последующую аминокислоту кодируемого им белка. Таким образом, было показано, что генетический код является триплетным, где каждый триплет (называемый кодоном) определяет определенную аминокислоту. Они также получили доказательства того, что кодоны не перекрываются в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что эта последовательность считывается с фиксированной начальной точки. Эдгар и др. провели эксперименты по картированию с r-мутантами бактериофага T4, показавшие, что частоты рекомбинации между rII-мутантами не являются строго аддитивными. Частота рекомбинации при скрещивании двух rII-мутантов (a x d) обычно меньше суммы частот рекомбинации для смежных внутренних подинтервалов (a x b) + (b x c) + (c x d). Хотя они и не являются строго аддитивными, была продемонстрирована систематическая зависимость, которая, вероятно, отражает лежащий в основе молекулярный механизм генетической рекомбинации.

Restriction mapping is a method in which structural information regarding a segment of DNA is obtained using restriction enzymes. Restriction enzymes are enzymes that help cut segments of DNA at specific recognition sequences. The basis to restriction mapping involves digesting (or cutting) DNA with restriction enzymes. The digested DNA fragments are then run on an agarose gel using electrophoresis, which provides one with information regarding the size of these digested fragments. The sizes of these fragments help indicate the distance between restriction enzyme sites on the DNA analyzed, and provides researchers with information regarding the structure of DNA analyzed. DNA probes that are specific for chromosomal regions or genes of interest are labeled with fluorochromes. By attaching fluorochromes to probes, researchers are able to visualize multiple DNA sequences simultaneously. When a probe comes into contact with DNA on a specific chromosome, hybridization will occur. Consequently, information regarding the location of that sequence of DNA will be attained. FISH analyzes single stranded DNA (ssDNA). Once the DNA is in its single stranded state, the DNA can bind to its specific probe. This result provided evidence for the key idea that the gene has a linear structure equivalent to a length of DNA with many sites that can independently mutate. In 1961, Francis Crick, Leslie Barnett, Sydney Brenner and Richard Watts Tobin performed genetic experiments that demonstrated the basic nature of the genetic code for proteins. These experiments, involving mapping of mutational sites within the rIIB gene of bacteriophage T4, demonstrated that three sequential nucleobases of the gene's DNA specify each successive amino acid of its encoded protein. Thus the genetic code was shown to be a triplet code, where each triplet (called a codon) specifies a particular amino acid. They also obtained evidence that the codons do not overlap with each other in the DNA sequence encoding a protein, and that such a sequence is read from a fixed starting point. Edgar et al. performed mapping experiments with r mutants of bacteriophage T4 showing that recombination frequencies between rII mutants are not strictly additive. The recombination frequency from a cross of two rII mutants (a x d) is usually less than the sum of recombination frequencies for adjacent internal sub intervals (a x b) + (b x c) + (c x d). Although not strictly additive, a systematic relationship was demonstrated that likely reflects the underlying molecular mechanism of genetic recombination.

Секвенирование генома

Секвенирование генома иногда ошибочно именуется "картографированием генома" людьми, не являющимися биологами. Процесс секвенирования случайными фрагментами похож на процесс физического картирования: он разбивает геном на небольшие фрагменты, определяет характеристики каждого фрагмента, а затем собирает их воедино (современные технологии секвенирования существенно отличаются). Несмотря на то, что масштаб, цель и процесс совершенно различны, сборка генома можно рассматривать как "высшую" форму физической карты, поскольку она гораздо более полно предоставляет всю информацию, которую может предложить традиционная физическая карта.

Использование

Идентификация генов обычно является первым шагом к пониманию генома вида, а картирование генов – первым шагом в идентификации гена. Картирование генов часто служит отправной точкой для многих важных последующих исследований.

Связь заболеваний

Процесс выявления генетического элемента, ответственного за заболевание, также называют "картированием". Если область поиска уже значительно сужена, то поиск называется точным картированием гена. Эта информация получается в результате изучения проявлений заболевания в крупных семьях (генетическая линкaж-анализ) или популяционных исследований генетической ассоциации. Используя вышеупомянутые методы, исследователи способны картировать гены, вызывающие заболевания. Создание генетической карты – критически важный первый шаг к идентификации генов заболевания. Генетические карты позволяют выявлять варианты аллелей и дают исследователям возможность делать прогнозы о генах, которые, по их мнению, вызывают мутантный фенотип. Примером заболевания, идентифицированного с помощью линкaж-анализа, является кистозный фиброз. Например, при кистозном фиброзе (КФ) были проанализированы образцы ДНК из пятидесяти семей, затронутых КФ, с использованием линкaж-анализа. Были проанализированы сотни маркеров, связанных с КФ, по всему геному, пока КФ не был локализован на длинном плече хромосомы 7. Затем исследователи провели линкaж-анализ на дополнительных маркерах ДНК в хромосоме 7, чтобы определить еще более точное местоположение гена КФ. Они обнаружили, что ген КФ расположен в области 7q31-q32 (см. хромосомную номенклатуру).