Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия: принципы и применение.

Введение

Аналитическая химическая методика

Жидкостная хроматография – масс-спектрометрия (ЖХ–МС) – это аналитическая химическая методика, объединяющая физические возможности разделения, присущие жидкостной хроматографии (или ВЭЖХ), с возможностями масс-анализа масс-спектрометрии (МС). Комбинированные хроматографические – МС системы широко используются в химическом анализе, поскольку индивидуальные возможности каждой методики синергически усиливают друг друга. В то время как жидкостная хроматография разделяет смеси, содержащие несколько компонентов, масс-спектрометрия предоставляет спектральную информацию, которая может помочь идентифицировать (или подтвердить предполагаемую идентичность) каждого разделенного компонента. МС не только обладает высокой чувствительностью, но и обеспечивает селективное детектирование, устраняя необходимость в полном хроматографическом разделении. ЖХ–МС также подходит для метаболомики благодаря широкому охвату различных химических веществ. Эта тандемная методика может использоваться для анализа биохимических, органических и неорганических соединений, обычно встречающихся в сложных образцах экологического и биологического происхождения. Таким образом, ЖХ–МС может применяться в широком спектре отраслей, включая биотехнологии, мониторинг окружающей среды, пищевую промышленность, фармацевтическую, агрохимическую и косметическую промышленность. С начала 2000-х годов ЖХ–МС (или, точнее, ЖХ–МС/МС) также начала применяться в клинической практике. Помимо приборов для жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, система ЖХ–МС содержит интерфейс, который эффективно передает разделенные компоненты из колонки ЖХ в источник ионов МС. Интерфейс необходим, поскольку приборы ЖХ и МС принципиально несовместимы. В то время как подвижная фаза в системе ЖХ представляет собой жидкость под давлением, анализаторы МС обычно работают в условиях высокого вакуума. Следовательно, невозможно напрямую подавать элюат из колонки ЖХ в источник МС. В целом, интерфейс является механически простой частью системы ЖХ–МС, которая передает максимальное количество аналита, удаляет значительную часть подвижной фазы, используемой в ЖХ, и сохраняет химическую идентичность продуктов хроматографии (химически инертен). В качестве требования, интерфейс не должен влиять на эффективность ионизации и вакуумные условия системы МС. В газовой хроматографии (ГХ) аналиты элюируются из разделительной колонки в виде газа, и соединение с источниками ионов электронной ионизации (ЭИ) или химической ионизации (ХИ) в системе МС представляло собой технически более простую задачу. Благодаря этому разработка систем ГХ–МС проходила быстрее, чем ЖХ–МС, и такие системы были впервые коммерциализированы в 1970-х годах, когда впервые стали использовать капилляры для соединения колонн ЖХ с источником ЭИ, что позволило увеличить поток жидкости в источник. Это был первый и наиболее очевидный способ соединения ЖХ с МС, известный как капиллярный входной интерфейс. Этот пионерский интерфейс для ЖХ–МС обладал теми же аналитическими возможностями, что и ГХ–МС, и был ограничен достаточно летучими аналитами и неполярными соединениями с низкой молекулярной массой (ниже 400 Да). В капиллярном входном интерфейсе испарение подвижной фазы внутри капилляра было одной из основных проблем. В первые годы разработки ЖХ–МС в качестве альтернативных вариантов соединения предлагались онлайн и офлайн подходы. В общем случае, офлайн соединение включало сбор фракций, испарение растворителя и перенос аналитов в МС с использованием зондов. Процесс обработки аналита вне линии был трудоемким и сопряжен с риском загрязнения образца. Вскоре стало ясно, что анализ сложных смесей потребует разработки полностью автоматизированного онлайн решения для соединения в ЖХ–МС. Ключ к успеху и широкому распространению ЖХ–МС в качестве стандартного аналитического инструмента заключается в интерфейсе и источнике ионов между ЖХ, работающей в жидкой фазе, и МС, работающей в вакууме. Следующие интерфейсы стали ступеньками на пути к современным интерфейсам ионизации при атмосферном давлении и описываются в целях исторической справки.

Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) is an analytical chemistry technique that combines the physical separation capabilities of liquid chromatography (or HPLC) with the mass analysis capabilities of mass spectrometry (MS). Coupled chromatography – MS systems are popular in chemical analysis because the individual capabilities of each technique are enhanced synergistically. While liquid chromatography separates mixtures with multiple components, mass spectrometry provides spectral information that may help to identify (or confirm the suspected identity of) each separated component. MS is not only sensitive, but provides selective detection, relieving the need for complete chromatographic separation. LC–MS is also appropriate for metabolomics because of its good coverage of a wide range of chemicals. This tandem technique can be used to analyze biochemical, organic, and inorganic compounds commonly found in complex samples of environmental and biological origin. Therefore, LC–MS may be applied in a wide range of sectors including biotechnology, environment monitoring, food processing, and pharmaceutical, agrochemical, and cosmetic industries. Since the early 2000s, LC–MS (or more specifically LC–MS–MS) has also begun to be used in clinical applications. In addition to the liquid chromatography and mass spectrometry devices, an LC–MS system contains an interface that efficiently transfers the separated components from the LC column into the MS ion source. The interface is necessary because the LC and MS devices are fundamentally incompatible. While the mobile phase in a LC system is a pressurized liquid, the MS analyzers commonly operate under high vacuum. Thus, it is not possible to directly pump the eluate from the LC column into the MS source. Overall, the interface is a mechanically simple part of the LC–MS system that transfers the maximum amount of analyte, removes a significant portion of the mobile phase used in LC and preserves the chemical identity of the chromatography products (chemically inert). As a requirement, the interface should not interfere with the ionizing efficiency and vacuum conditions of the MS system. In GC, the analytes are eluted from the separation column as a gas and the connection with electron ionization (EI) or chemical ionization (CI) ion sources in the MS system was a technically simpler challenge. Because of this, the development of GC MS systems was faster than LC–MS and such systems were first commercialized in the 1970s. when they first used capillaries to connect an LC columns to an EI source. which allowed a higher liquid flow into the source. This was the first and most obvious way of coupling LC with MS, and was known as the capillary inlet interface. This pioneer interface for LC–MS had the same analysis capabilities of GC MS and was limited to rather volatile analytes and non polar compounds with low molecular mass (below 400 Da). In the capillary inlet interface, the evaporation of the mobile phase inside the capillary was one of the main issues. Within the first years of development of LC–MS, on line and off line alternatives were proposed as coupling alternatives. In general, off line coupling involved fraction collection, evaporation of solvent, and transfer of analytes to the MS using probes. Off line analyte treatment process was time consuming and there was an inherent risk of sample contamination. Rapidly, it was realized that the analysis of complex mixtures would require the development of a fully automated on line coupling solution in LC–MS. The key to the success and widespread adoption of LC–MS as a routine analytical tool lies in the interface and ion source between the liquid based LC and the vacuum base MS. The following interfaces were stepping stones on the way to the modern atmospheric pressure ionization interfaces, and are described for historical interest.

Интерфейс с подвижным ремнем

Интерфейс подвижного ремня (MBI) был разработан McFadden et al. в 1977 году, а компания Finnigan начала его коммерческое производство. Этот интерфейс состоял из бесконечно движущегося ремня, на который элюат из LC-колонны наносился в виде полосы. На ремне растворитель испарялся путем мягкого нагрева и эффективного отвода паров растворителя под пониженным давлением в двух вакуумных камерах. После удаления жидкой фазы ремень проходил над нагревателем, который быстро десорбировал аналиты в источник ионов MS. Одним из значительных преимуществ MBI была его совместимость с широким диапазоном хроматографических условий. В 1988 году интерфейсы пучкового типа вытеснили MBI в большинстве применений LC–MS. Интерфейс пучкового типа (PBI) работал с использованием гелиевого газового распылителя для введения элюата в вакуум, сушки капель и откачки паров растворителя (с помощью струйного сепаратора), при этом поток монодисперсных сухих частиц, содержащих аналит, поступал в источник. Он был коммерциализирован компанией Vestec и несколькими крупными производителями масс-спектрометров. Этот интерфейс был результатом долгосрочного исследовательского проекта, направленного на создание интерфейса LC–MS, способного обрабатывать высокие скорости потока (1 мл/мин) и избегать разделения потока, характерного для интерфейсов DLI. Интерфейс TSP состоял из нагретого зонда, камеры десольватации и скиммера для фокусировки ионов. Элюат из LC-колонны проходил через нагретый зонд и выходил в виде струи пара и мелких капель, поступающих в камеру десольватации при низком давлении. Первоначально он работал с нитью накаливания или разрядом в качестве источника ионов (действуя таким образом как источник CI для испаренного аналита), но вскоре было обнаружено, что ионы наблюдаются и при выключенной нити накаливания или разряде. Это могло быть связано либо с прямым излучением ионов из жидких капель при их испарении в процессе, аналогичном ионизации электрораспылением или испарению ионов, либо с химической ионизацией испаренных молекул аналита буферными ионами (например, ацетатом аммония). Наблюдение многозарядных ионов у некоторых крупных аналитов указывает на то, что в определенных условиях происходило прямое излучение ионов аналита. Основными компонентами масс-спектрометра являются источник ионов, анализатор масс, детектор, а также системы сбора и обработки данных и вакуумирования. Источник ионов – это место, где компоненты пробы, введенные в MS-систему, ионизируются с помощью электронных лучей, фотонных лучей (УФ-излучения), лазерных лучей или коронного разряда. В случае ионизации электрораспылением источник ионов переводит ионы, находящиеся в жидком растворе, в газовую фазу. Источник ионов преобразует и фрагментирует нейтральные молекулы пробы в газофазные ионы, которые направляются в анализатор масс. Анализатор масс применяет электрические и магнитные поля для разделения ионов по их массам, а детектор измеряет и усиливает ионный ток для определения концентрации каждого иона с определенной массой. Для создания масс-спектра, который легко воспринимается человеком, система сбора данных записывает, обрабатывает, хранит и отображает данные на компьютере. MS широко используется в аналитических лабораториях, изучающих физические, химические или биологические свойства широкого спектра соединений. Среди множества различных типов анализаторов масс, применяемых в системах LC–MS, наиболее распространены квадрупольные, с временем пролета (TOF), ионные ловушки и гибридные квадрупольно-TOF (QTOF) анализаторы. Новый подход, находящийся в стадии разработки, под названием прямой интерфейс EI LC–MS, объединяет систему нано-HPLC и масс-спектрометр с электронным источником ионизации.

The moving belt interface (MBI) was developed by McFadden et al. in 1977 and commercialized by Finnigan. This interface consisted of an endless moving belt onto which the LC column effluent was deposited in a band. On the belt, the solvent was evaporated by gently heating and efficiently exhausting the solvent vapours under reduced pressure in two vacuum chambers. After the liquid phase was removed, the belt passed over a heater which flash desorbed the analytes into the MS ion source. One of the significant advantages of the MBI was its compatibility with a wide range of chromatographic conditions. Particle beam interfaces took over the wide applications of MBI for LC–MS in 1988. The PBI operated by using a helium gas nebulizer to spray the eluant into the vacuum, drying the droplets and pumping away the solvent vapour (using a jet separator) while the stream of monodisperse dried particles containing the analyte entered the source. It was commercialized by Vestec and several of the major mass spectrometer manufacturers. The interface resulted from a long term research project intended to find a LC–MS interface capable of handling high flow rates (1 ml/min) and avoiding the flow split in DLI interfaces. The TSP interface was composed of a heated probe, a desolvation chamber, and an ion focusing skimmer. The LC effluent passed through the heated probe and emerged as a jet of vapor and small droplets flowing into the desolvation chamber at low pressure. Initially operated with a filament or discharge as the source of ions (thereby acting as a CI source for vapourized analyte), it was soon discovered that ions were also observed when the filament or discharge was off. This could be attributed to either direct emission of ions from the liquid droplets as they evaporated in a process related to electrospray ionization or ion evaporation, or to chemical ionization of vapourized analyte molecules from buffer ions (such as ammonium acetate). The fact that multiply charged ions were observed from some larger analytes suggests that direct analyte ion emission was occurring under at least some conditions. The basic components of a mass spectrometer are the ion source, the mass analyzer, the detector, and the data and vacuum systems. The ion source is where the components of a sample introduced in a MS system are ionized by means of electron beams, photon beams (UV lights), laser beams or corona discharge. In the case of electrospray ionization, the ion source moves ions that exist in liquid solution into the gas phase. The ion source converts and fragments the neutral sample molecules into gas phase ions that are sent to the mass analyzer. While the mass analyzer applies the electric and magnetic fields to sort the ions by their masses, the detector measures and amplifies the ion current to calculate the abundances of each mass resolved ion. In order to generate a mass spectrum that a human eye can easily recognize, the data system records, processes, stores, and displays data in a computer. MS is now in very common use in analytical laboratories that study physical, chemical, or biological properties of a great variety of compounds. Among the many different kinds of mass analyzers, the ones that find application in LC–MS systems are the quadrupole, time of flight (TOF), ion traps, and hybrid quadrupole TOF (QTOF) analyzers. A new approach still under development called direct EI LC–MS interface, couples a nano HPLC system and an electron ionization equipped mass spectrometer.

Электропряжевая ионизация (ESI)

Интерфейс ESI для систем LC–MS был разработан Фенном и его коллегами в 1988 году. Этот источник ионов/интерфейс может использоваться для анализа умеренно полярных и даже очень полярных молекул (например, метаболитов, ксенобиотиков, пептидов, нуклеотидов, полисахаридов). Жидкий элюат, выходящий из колонны LC, направляется в металлический капилляр, поддерживаемый при 3–5 кВ, и распыляется высокоскоростным коаксиальным потоком газа на кончике капилляра, создавая тонкий спрей заряженных капель перед входом в вакуумную камеру. Для предотвращения загрязнения вакуумной системы буферами и солями, этот капилляр обычно располагается перпендикулярно входу в систему MS, в некоторых случаях с встречным потоком сухого азота перед входом, через который ионы направляются электрическим полем. В некоторых источниках быстрое испарение капель и, следовательно, максимальная эмиссия ионов достигается путем смешивания дополнительного потока горячего газа с распылительной струей перед вакуумным входом. В других источниках капли проходят через нагретую капиллярную трубку при входе в вакуум, что способствует испарению капель и эмиссии ионов. Эти методы увеличения испарения капель теперь позволяют использовать скорости потока жидкости 1–2 мл/мин, сохраняя при этом эффективную ионизацию и высокую чувствительность. Таким образом, хотя использование микроколонн с внутренним диаметром 1–3 мм и более низкими скоростями потока 50–200 мкл/мин обычно считалось необходимым для оптимальной работы, это ограничение больше не является столь важным, и более высокую емкость колонн с большим внутренним диаметром теперь можно выгодно использовать с системами ESI LC–MS. Положительно и отрицательно заряженные ионы могут быть созданы путем переключения полярности, и можно быстро получать попеременные спектры в положительном и отрицательном режимах в течение одного LC-прогона. В то время как большинство крупных молекул (с молекулярной массой более 1500–2000) производят многозарядные ионы в источнике ESI, большинство меньших молекул производят однозарядные ионы. Однако его коммерческое применение началось в начале 1990-х годов после того, как Henion и его коллеги усовершенствовали интерфейс LC–APCI–MS в 1986 году. В настоящее время LC–MS стал одним из наиболее широко используемых методов химического анализа, поскольку более 85% природных химических соединений являются полярными и термически нестабильными, и GC–MS не может анализировать эти образцы.

ESI interface for LC–MS systems was developed by Fenn and collaborators in 1988. This ion source/ interface can be used for the analysis of moderately polar and even very polar molecules (e. g., metabolites, xenobiotics, peptides, nucleotides, polysaccharides). The liquid eluate coming out of the LC column is directed into a metal capillary kept at 3 to 5 kV and is nebulized by a high velocity coaxial flow of gas at the tip of the capillary, creating a fine spray of charged droplets in front of the entrance to the vacuum chamber. To avoid contamination of the vacuum system by buffers and salts, this capillary is usually perpendicularly located at the inlet of the MS system, in some cases with a counter current of dry nitrogen in front of the entrance through which ions are directed by the electric field. In some sources, rapid droplet evaporation and thus maximum ion emission is achieved by mixing an additional stream of hot gas with the spray plume in front of the vacuum entrance. In other sources, the droplets are drawn through a heated capillary tube as they enter the vacuum, promoting droplet evaporation and ion emission. These methods of increasing droplet evaporation now allow the use of liquid flow rates of 1 2 mL/min to be used while still achieving efficient ionisation and high sensitivity. Thus while the use of 1 – 3 mm microbore columns and lower flow rates of 50 200 μl/min was commonly considered necessary for optimum operation, this limitation is no longer as important, and the higher column capacity of larger bore columns can now be advantageously employed with ESI LC–MS systems. Positively and negatively charged ions can be created by switching polarities, and it is possible to acquire alternate positive and negative mode spectra rapidly within the same LC run While most large molecules (greater than MW 1500–2000) produce multiply charged ions in the ESI source, the majority of smaller molecules produce singly charged ions. However, its commercial application was introduced at the beginning of the 1990s after Henion and collaborators improved the LC–APCI–MS interface in 1986. Nowadays, LC–MS has become one of the most widely used chemical analysis techniques because more than 85% of natural chemical compounds are polar and thermally labile and GC MS cannot process these samples.

Протеомика/метаболистика

LC–MS используется в протеомике как метод для обнаружения и идентификации компонентов сложной смеси. Подход LC–MS, основанный на протеомике "снизу вверх", обычно включает протеолитическое расщепление и денатурацию с использованием трипсина в качестве протеазы, мочевины для денатурации третичной структуры и йодоацетамида для модификации цистеиновых остатков. После расщепления LC–MS используется для получения пептидного массового отпечатка, или LC–MS/MS (тандемная масс-спектрометрия) для определения последовательностей отдельных пептидов. LC–MS/MS наиболее часто используется для протеомического анализа сложных образцов, где массы пептидов могут перекрываться даже при масс-спектрометрии высокого разрешения. Образцы сложных биологических сред (например, человеческой сыворотки) могут быть проанализированы в современных системах LC–MS/MS, способных идентифицировать более 1000 белков. Однако такой высокий уровень идентификации белков возможен только после разделения образца с помощью SDS-PAGE геля или HPLC SCX. LC–MS стал одним из наиболее часто используемых методов глобального профилирования метаболитов биологических тканей (например, плазмы крови, сыворотки, мочи). LC–MS также используется для анализа природных продуктов и профилирования вторичных метаболитов в растениях. В связи с этим, системы на основе масс-спектрометрии полезны для получения более детальной информации о широком спектре соединений в сложных биологических образцах. LC–ЯМР (ядерный магнитный резонанс) также используется в метаболитомике растений, но этот метод может обнаруживать и количественно определять только наиболее распространенные метаболиты. LC–MS способствовал развитию метаболитомики растений, целью которой является изучение растительных систем на молекулярном уровне, обеспечивая непредвзятую характеристику метаболома растений в ответ на окружающую среду. Первым применением LC–MS в метаболитомике растений было обнаружение широкого спектра высокополярных метаболитов, олигосахаридов, аминокислот, аминосахаров и сахаронуклеотидов из тканей флоэмы Cucurbita maxima. Другим примером использования LC–MS в метаболитомике растений является эффективное разделение и идентификация глюкозы, сахарозы, рафинозы, стахиозы и вербаскозы из экстрактов листьев Arabidopsis thaliana.

LC–MS is used in proteomics as a method to detect and identify the components of a complex mixture. The bottom up proteomics LC–MS approach generally involves protease digestion and denaturation using trypsin as a protease, urea to denature the tertiary structure, and iodoacetamide to modify the cysteine residues. After digestion, LC–MS is used for peptide mass fingerprinting, or LC–MS/MS (tandem MS) is used to derive the sequences of individual peptides. LC–MS/MS is most commonly used for proteomic analysis of complex samples where peptide masses may overlap even with a high resolution mass spectrometry. Samples of complex biological (e. g., human serum) may be analyzed in modern LC–MS/MS systems, which can identify over 1000 proteins. However, this high level of protein identification is possible only after separating the sample by means of SDS PAGE gel or HPLC SCX. LC–MS has emerged as one of the most commonly used techniques in global metabolite profiling of biological tissue (e. g., blood plasma, serum, urine). LC–MS is also used for the analysis of natural products and the profiling of secondary metabolites in plants. In this regard, MS based systems are useful to acquire more detailed information about the wide spectrum of compounds from a complex biological samples. LC–nuclear magnetic resonance (NMR) is also used in plant metabolomics, but this technique can only detect and quantify the most abundant metabolites. LC–MS has been useful to advance the field of plant metabolomics, which aims to study the plant system at molecular level providing a non biased characterization of the plant metabolome in response to its environment. The first application of LC–MS in plant metabolomics was the detection of a wide range of highly polar metabolites, oligosaccharides, amino acids, amino sugars, and sugar nucleotides from Cucurbita maxima phloem tissues. Another example of LC–MS in plant metabolomics is the efficient separation and identification of glucose, sucrose, raffinose, stachyose, and verbascose from leaf extracts of Arabidopsis thaliana.

Разработка лекарственных средств

ЖХ-МС часто используется в разработке лекарственных препаратов, поскольку позволяет быстро подтверждать молекулярную массу и определять структуру соединений. Эти возможности ускоряют процесс создания, тестирования и валидации новых лекарственных средств, начиная с широкого спектра потенциальных кандидатов. Применение ЖХ-МС в разработке лекарств включает в себя высокоавтоматизированные методы, используемые для картирования пептидов, картирования гликопротеинов, липодомики, дерепликации природных соединений, биоаффинного скрининга, скрининга лекарственных средств *in vivo*, скрининга метаболической стабильности, идентификации метаболитов, идентификации примесей, количественного биоанализа и контроля качества.