Введение
Процесс восстановления ДНК
Восстановление ДНК путем иссечения оснований (BER) — это клеточный механизм, изучаемый в области биохимии и генетики, который восстанавливает поврежденную ДНК на протяжении всего клеточного цикла. Он в основном отвечает за удаление небольших повреждений оснований, не вызывающих искажений спирали, из генома. Связанный путь нуклеотидного иссечения восстанавливает более крупные повреждения, искажающие структуру спирали. BER важен для удаления поврежденных оснований, которые в противном случае могли бы вызвать мутации из-за неправильного спаривания или привести к разрывам ДНК во время репликации. BER инициируется ДНК-гликозилазами, которые распознают и удаляют специфические поврежденные или неподходящие основания, образуя AP-сайты. Затем эти сайты расщепляются AP-эндонуклеазой. Образующийся разрыв одной цепи может быть обработан либо с помощью короткого участка (при котором заменяется один нуклеотид), либо с помощью длинного участка BER (при котором синтезируется от 2 до 10 новых нуклеотидов).
Выбор между длинным и коротким ремонтом
Выбор между коротким и длинным восстановлением по принципу заплатки в настоящее время изучается. Считается, что на это решение влияют различные факторы, включая тип повреждения, стадию клеточного цикла и то, является ли клетка терминально дифференцированной или активно делится. Некоторые повреждения, такие как окисленные или восстановленные AP-сайты, устойчивы к лиазной активности pol β и, следовательно, должны обрабатываться с помощью длинного восстановления по принципу заплатки (BER). Предпочтение пути может различаться у разных организмов. В то время как клетки человека используют как короткое, так и длинное восстановление по принципу заплатки, долгое время считалось, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae лишены короткого пути восстановления, поскольку у них нет гомологов нескольких белков короткого пути восстановления млекопитающих, включая pol β, ДНК-лигазу III, XRCC1 и киназный домен PNKP. Недавнее открытие того, что поли(А)-полимераза Trf4 обладает 5'-dRP-лиазной активностью, ставит под сомнение эту точку зрения.
Гликозилазы ДНК
Гликозилазы ДНК отвечают за первоначальное распознавание повреждения. Они извлекают поврежденное основание из двойной спирали, как показано на рисунке, и разрывают N-гликозидную связь поврежденного основания, оставляя AP-сайт. Существует две категории гликозилаз: монофункциональные и бифункциональные. Монофункциональные гликозилазы обладают только гликозилазной активностью, в то время как бифункциональные гликозилазы также обладают AP-лиазной активностью. Следовательно, бифункциональные гликозилазы могут превратить повреждение основания в разрыв одной цепи без необходимости в AP-эндонуклеазе. β-элиминация AP-сайта гликозилазной лиазой приводит к образованию 3'-α,β-ненасыщенного альдегида, соседствующего с 5'-фосфатом, что отличается от продукта расщепления AP-эндонуклеазой. Некоторые гликозилазные лиазы могут дополнительно осуществлять δ-элиминацию, которая превращает 3'-альдегид в 3'-фосфат. Широкий спектр гликозилаз эволюционировал для распознавания различных поврежденных оснований. Примеры ДНК-гликозилаз включают Ogg1, который распознает 8-оксогуанин, MPG, который распознает 3-метиладенин, и UNG, который удаляет урацил из ДНК.
Эндонуклеазы АП
Эндонуклеазы AP расщепляют AP-сайт, образуя 3'-гидроксильную группу рядом с 5'-дезоксирибозофосфатом (dRP). Эндонуклеазы AP разделяют на два семейства в зависимости от их гомологии с предковыми бактериальными эндонуклеазами AP – эндонуклеазой IV и экзонуклеазой III. Многие эукариоты содержат представителей обоих семейств, включая дрожжи Saccharomyces cerevisiae, где Apn1 является гомологом EndoIV, а Apn2 – гомологом ExoIII. У человека идентифицированы две эндонуклеазы AP, APE1 и APE2. APE2 является членом семейства ExoIII.
Ферменты конечной переработки
Для того, чтобы произошла лигация, разрыв цепи ДНК должен иметь гидроксильную группу на 3'-конце и фосфатную группу на 5'-конце. У человека полинуклеотидная киназа-фосфатаза (PNKP) способствует формированию этих концов в процессе BER. Этот белок содержит киназный домен, который фосфорилирует 5'-гидроксильные концы, и фосфатазный домен, который удаляет фосфаты с 3'-концов. Совместно эти функции подготавливают одноцепочечные разрывы с поврежденными терминами к лигации. AP-эндонуклеазы также участвуют в обработке 3'-концов. Помимо вскрытия AP-сайтов, они обладают 3'-фосфодиэстеразой активностью и способны удалять различные 3'-повреждения, включая фосфаты, фосфогликолаты и альдегиды. Обработка 3'-концов должна произойти до начала синтеза ДНК, поскольку ДНК-полимеразы требуют 3'-гидроксильную группу для инициации удлинения цепи.
ДНК-полимеразы
Pol β является основной человеческой полимеразой, катализирующей короткофрагментный BER, при этом pol λ способна компенсировать её отсутствие. Эти полимеразы принадлежат к семейству Pol X и обычно вставляют только один нуклеотид. Помимо полимеразной активности, эти ферменты обладают лиазным доменом, который удаляет 5'-dRP, оставшийся после расщепления AP-эндонуклеазой. Считается, что во время длиннофрагментного BER синтез ДНК опосредован pol δ и pol ε совместно с фактором процессивности PCNA – теми же полимеразами, которые осуществляют репликацию ДНК. Эти полимеразы выполняют вытесняющий синтез, то есть нижестоящий 5'-конец ДНК "вытесняется", формируя выступ (см. схему выше). Pol β также может осуществлять вытесняющий синтез длинных фрагментов и, следовательно, может участвовать в любом из путей BER. Синтез длинных фрагментов обычно включает в себя 2-10 новых нуклеотидов.
Эндонуклеаза клапа
FEN1 удаляет 5'-завис, образующийся в ходе длинного патч-репарации оснований (BER). Эта эндонуклеаза проявляет выраженное предпочтение к длинному 5'-завису, соседствующему с 1-нуклеотидным 3'-зависом. Гомологом FEN1 у дрожжей является RAD27. Помимо своей роли в длинном патч-BER, FEN1 разрезает зависы с аналогичной структурой при обработке фрагментов Оказаки – важном этапе репликации ДНК на отстающей цепи.
ДНК лигаза
ДНК лигаза III вместе с кофактором XRCC1 катализирует стадию сшивания одноцепочечных разрывов при коротком участке восстановления оснований (BER) у человека. ДНК лигаза I осуществляет лигирование разрыва при длинном участке восстановления оснований (BER).
Связь с раком
Дефекты в различных путях репарации ДНК приводят к предрасположенности к раку, и BER, по-видимому, следует этой закономерности. Делеционные мутации в генах BER показали, что они приводят к увеличению частоты мутаций в различных организмах, что позволяет предположить, что потеря функции BER может способствовать развитию рака. Фактически, соматические мутации в Pol β были обнаружены в 30% случаев рака у человека, и некоторые из этих мутаций вызывают трансформацию при экспрессии в клетках мыши. Мутации в ДНК-гликозилазе MYH также известны как факторы, повышающие восприимчивость к раку толстой кишки.
Эпигенетические дефициты при раковых заболеваниях
Эпигенетические изменения (эпимутации) в генах эксцизионной репарации оснований только недавно начали изучаться в нескольких типах рака, в отличие от многочисленных предыдущих исследований эпимутаций в генах, действующих в других путях репарации ДНК (таких как MLH1 в репарации неспаренных оснований и MGMT в прямой репарации). Ниже приведены некоторые примеры эпимутаций в генах эксцизионной репарации оснований, наблюдаемые при раке.
MBD4
MBD4 (протеин с метил-CpG-связывающим доменом 4) — это гликозилаза, используемая на начальной стадии репарации вырезания основания. Белок MBD4 преимущественно связывается с полностью метилированными CpG-сайтами и с измененными основаниями ДНК в этих сайтах. Эти измененные основания образуются в результате частого гидролиза цитозина до урацила (см. рисунок) и гидролиза 5-метилцитозина до тимина, приводящего к образованию пар оснований G:U и G:T. Если эти ошибочные урацилы или тимины в этих парах оснований не удаляются до репликации ДНК, они вызывают транзиционные мутации. MBD4 специфически катализирует удаление T и U, спаренных с гуанином (G) в CpG-сайтах. Это важная функция репарации, поскольку около 1/3 всех внутригенных однонуклеотидных мутаций при раке человека возникают в CpG-динуклеотидах и являются результатом переходов G:C в A:T. Эти переходы составляют наиболее частые мутации при раке человека. Например, почти 50% соматических мутаций гена-супрессора опухолей p53 при колоректальном раке представляют собой переходы G:C в A:T в пределах CpG-сайтов. Кроме того, MBD4 дефицитен из-за мутаций примерно в 4% случаев колоректального рака. Большинство гистологически нормальных участков, окружающих новообразования (аденомы и рак толстой кишки) в толстой кишке, также демонстрируют снижение экспрессии мРНК MBD4 (полевой дефект) по сравнению с гистологически нормальной тканью у людей, у которых никогда не было новообразований толстой кишки.
Нейл1
NEIL1 распознает (является мишенью для) и удаляет определенные окислительно поврежденные основания, а затем вскрывает абезическое место посредством β,δ-элиминирования, оставляя 3′ и 5′ фосфатные концы. NEIL1 распознает окисленные пиримидины, формамидопиримидины, тиминовые остатки, окисленные в метильной группе, и оба стереоизомера тиминового гликоля. Лучшими субстратами для NEIL1 человека, по-видимому, являются поражения гидантоина, гуанидиногидантоин и спироиминодигидантоин, которые являются дальнейшими продуктами окисления 8-оксо-G. NEIL1 также способен удалять поражения из одноцепочечной ДНК, а также из структур ДНК типа «пузырь» и развилок. Дефицит NEIL1 вызывает повышенный мутагенез в месте пары 8-оксо-Gua:C, при этом большинство мутаций представляют собой G:C- в T:A-трансверсии. Исследование 2004 года показало, что у 46% первичных раков желудка наблюдалось снижение экспрессии мРНК NEIL1, хотя механизм этого снижения оставался неизвестным. В этом исследовании также было обнаружено, что у 4% раков желудка имеются мутации в гене NEIL1. Авторы предположили, что низкая активность NEIL1, обусловленная снижением экспрессии и/или мутацией в гене NEIL1, часто вовлечена в канцерогенез желудка. Был проведен скрининг 145 генов репарации ДНК на предмет аберрантного метилирования промотора в тканях плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC) от 20 пациентов и в образцах слизистой оболочки головы и шеи от 5 пациентов, не страдающих раком. Этот скрининг показал, что NEIL1, с существенно повышенной гиперметиляцией, имел наиболее значимую разницу в частоте метилирования. Более того, гиперметилирование соответствовало снижению экспрессии мРНК NEIL1. Дальнейшие исследования с использованием 135 опухолевых и 38 нормальных тканей также показали, что у 71% образцов тканей HNSCC наблюдалось повышенное метилирование промотора NEIL1. Это была наиболее частая аномалия репарации ДНК, обнаруженная среди 8 протестированных генов репарации ДНК. NEIL1 также был одним из шести генов репарации ДНК, которые были гиперметилированы в промоторных областях при колоректальном раке.
Связь с познанием
Активное метилирование и деметилирование ДНК необходимо для когнитивных процессов формирования и поддержания памяти. У крыс, контекстуальное обусловливание страха может вызвать пожизненную память о событии всего за одну попытку, и изменения метилирования, по-видимому, коррелируют с формированием особенно долговечных воспоминаний. Как показано в обзоре Фернандеса и др., у крыс физические упражнения усиливают экспрессию гена Bdnf в гиппокампе, который играет важную роль в формировании памяти. Повышенная экспрессия Bdnf происходит за счет деметилирования CpG-островного промотора в экзоне IV. Снижение вырезания метилированных оснований из ДНК указывает на возрастное снижение активности 3-метиладенин ДНК гликозилазы, фермента BER, ответственного за удаление алкилированных оснований.