Введение
Класс органических соединений
Термины "гликаны" и "полисахариды" определены IUPAC как синонимы, обозначающие "соединения, состоящие из большого числа моносахаридов, связанных гликозидными связями". Однако на практике термин "гликан" также может использоваться для обозначения углеводной части гликоконъюгата, такого как гликопротеин, гликолипид или протеогликан, даже если углевод представляет собой только олигосахарид. Гликаны обычно состоят исключительно из O-гликозидных связей моносахаридов. Например, целлюлоза является гликаном (или, точнее, глюканом), состоящим из D-глюкозы, соединенной β-1,4-связями, а хитин – гликан, состоящим из N-ацетил-D-глюкозамина, соединенного β-1,4-связями. Гликаны могут быть гомо- или гетерополимерами моносахаридных остатков и могут иметь линейную или разветвленную структуру.
Гликоны и белки
Гликоны могут быть обнаружены, присоединенными к белкам, как в гликопротеинах и протеогликанах. В общем случае, они располагаются на внешней поверхности клеток. O- и N-гликозильные связи очень распространены у эукариот, но также могут встречаться, хотя и реже, у прокариот.
Введение
N-гликаны присоединяются в эндоплазматическом ретикулуме к азоту (N) в боковой цепи аспарагина (Asn) в секвенции. Секвенция представляет собой Asn X Ser или Asn X Thr, где X – любая аминокислота, кроме пролина, а гликан может состоять из N-ацетилгалактозамина, галактозы, нейрамининовой кислоты, N-ацетилглюкозамина, фукозы, маннозы и других моносахаридов.
Сборка
У эукариот N-связанные гликаны происходят из основного 14-сахарного фрагмента, собираемого в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме. Сначала два остатка N-ацетилглюкозамина присоединяются к долихолмонофосфату, липиду, на внешней стороне мембраны эндоплазматического ретикулума. Затем к этой структуре добавляется пять остатков маннозы. В этот момент частично собранный гликан переворачивается через мембрану эндоплазматического ретикулума, так что теперь он находится внутри просвета ретикулума. Сборка затем продолжается в эндоплазматическом ретикулуме с добавлением еще четырех остатков маннозы. Наконец, к этой структуре добавляются три остатка глюкозы. После полной сборки гликан переносится целиком гликозилтрансферазой олигосахарилтрансферазой на формирующуюся пептидную цепь в просвете ретикулума. Таким образом, эта основная структура N-связанных гликанов состоит из 14 остатков (3 глюкозы, 9 маннозы и 2 N-ацетилглюкозамина). Изображение: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glyco.figgrp.469
Темные квадраты – N-ацетилглюкозамин; светлые круги – манноза; темные треугольники – глюкоза.
Обработка, модификация и разнообразие
После переноса в формирующуюся пептидную цепь, N-связанные гликаны, как правило, подвергаются обширной обработке, в ходе которой удаляются три остатка глюкозы, а также несколько остатков маннозы, в зависимости от конкретного N-связанного гликана. Удаление остатков глюкозы зависит от правильного сворачивания белка. Эти реакции обработки происходят в аппарате Гольджи. Реакции модификации могут включать присоединение фосфатной или ацетильной группы к сахарам, либо добавление новых сахаров, таких как нейраминовая кислота. Обработка и модификация N-связанных гликанов в аппарате Гольджи не происходит по линейному пути. В результате, возможно множество различных вариантов структуры N-связанных гликанов, зависящих от активности ферментов в аппарате Гольджи.
Функции и значение
N-связанные гликаны чрезвычайно важны для правильного сворачивания белков в эукариотических клетках. Белки-шапероны в эндоплазматическом ретикулуме, такие как кальнексин и калретикулин, связываются с тремя остатками глюкозы, присутствующими на основном N-связанном гликане. Эти белки-шапероны затем помогают в сворачивании белка, к которому прикреплен гликан. После правильного сворачивания три остатка глюкозы удаляются, и гликан переходит к дальнейшим реакциям процессинга. Если белок не сворачивается должным образом, три остатка глюкозы вновь присоединяются, позволяя белку снова связаться с шаперонами. Этот цикл может повторяться несколько раз, пока белок не достигнет своей правильной конформации. Если белок неоднократно не сворачивается должным образом, он выводится из эндоплазматического ретикулума и деградируется цитоплазматическими протеазами. N-связанные гликаны также способствуют сворачиванию белка стерическими эффектами. Например, остатки цистеина в пептиде могут быть временно заблокированы от образования дисульфидных связей с другими остатками цистеина из-за размера находящегося поблизости гликана. Таким образом, наличие N-связанного гликана позволяет клетке контролировать, какие остатки цистеина будут формировать дисульфидные связи. N-связанные гликоны также играют важную роль во взаимодействиях между клетками. Например, опухолевые клетки синтезируют аномальные N-связанные гликоны. Они распознаются рецептором CD337 на клетках-натуральных киллерах как признак того, что данная клетка является раковой. В иммунной системе N-связанные гликоны на поверхности иммунной клетки помогают определять модель миграции клетки, например, иммунные клетки, мигрирующие к коже, имеют специфические гликозилирования, которые способствуют гомоингу к этому месту, а также при диабете 1 типа. Таргетирование деградативных лизосомных ферментов также осуществляется с помощью N-связанных гликонов. Модификация N-связанного гликана остатком маннозы-6-фосфата служит сигналом о том, что белок, к которому прикреплен этот гликан, должен быть перемещен в лизосому. Это распознавание и транспорт лизосомных ферментов в присутствии маннозы-6-фосфата осуществляется двумя белками: CI MPR (катионно-независимый маннозо-6-фосфатный рецептор) и CD MPR (катионно-зависимый маннозо-6-фосфатный рецептор).
Введение
В эукариотах O-связанные гликаны собираются по одному сахару на сериновом или треониновом остатке пептидной цепи в аппарате Гольджи. В отличие от N-связанных гликанов, на данный момент консенсусной последовательности не выявлено. Однако, расположение остатка пролина в позиции 1 или +3 относительно серина или треонина благоприятствует O-связанному гликозилированию.
Гликозаминогликаны
Другим типом клеточных гликонов являются гликозаминогликаны (GAG). Они состоят из двух аминосахаров, соединенных попеременно с уроновыми кислотами, и включают в себя полимеры, такие как гепарин, гепарансульфат, хондроитин, кератан и дерматан. Некоторые гликозаминогликаны, например гепарансульфат, обнаруживаются, прикрепленными к поверхности клетки, где они связаны через тетрасахаридный линкер посредством ксилозил-остатка с белком (формируя гликопротеин или протеогликан).
Гликонаука
В докладе Национального исследовательского совета США за 2012 год содержится призыв к новому фокусу на гликонауке – области, изучающей структуру и функции гликанов и сулящей значительные достижения в таких разнообразных сферах, как медицина, энергетическая отрасль и материаловедение. До настоящего времени гликан не получали должного внимания со стороны научного сообщества из-за недостатка инструментов для изучения их часто сложного строения и свойств. В докладе представлена дорожная карта по превращению гликонауки из области, где преобладают узкие специалисты, в широко изучаемую и интегрированную дисциплину.
Массовая спектрометрия высокого разрешения (MS) и высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC)
Наиболее часто применяемые методы – это МС и ВЭЖХ, при которых гликанная часть отщепляется от целевой молекулы либо ферментативно, либо химически и подвергается анализу. В случае гликолипидов, их можно анализировать непосредственно, без отделения липидного компонента. N-гликаны из гликопротеинов обычно анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ с обращенной фазой, нормальной фазой и ионообменной ВЭЖХ) после мечения восстанавливающего конца сахаров флуоресцентным соединением (редуктивное мечение). За последние годы было разработано большое разнообразие различных меток, среди которых 2-аминобензамид (AB), антраниловая кислота (AA), 2-аминопиридин (PA), 2-аминоакридон (AMAC) и 3-(ацетиламино)-6-аминоакридин (AA Ac) – лишь некоторые из них. Для различных режимов ESI и используемых МС-систем необходимо использовать разные метки. O-гликаны обычно анализируют без меток, поскольку условия химического высвобождения не позволяют их метить. Фракционированные гликоны, полученные с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), могут быть дополнительно проанализированы с помощью MALDI TOF MS(MS) для получения более подробной информации о структуре и чистоте. Иногда пулы гликонов анализируют непосредственно методом масс-спектрометрии без предварительного фракционирования, хотя различение изобарических структур гликонов может быть затруднено или даже невозможно. В любом случае, прямой анализ MALDI TOF MS позволяет быстро и наглядно оценить состав пула гликонов. В последние годы широкое распространение получила высокоэффективная жидкостная хроматография, соединенная онлайн с масс-спектрометрией. Использование пористого графитового углерода в качестве стационарной фазы для жидкостной хроматографии позволяет анализировать даже непроизводные гликоны. Детектирование в этом случае осуществляется с помощью масс-спектрометрии, при этом электроспрей-ионизация (ESI) используется чаще, чем MALDI MS.
Массивы
Массивы лектинов и антител обеспечивают высокопроизводительный скрининг большого количества образцов, содержащих гликан. Этот метод использует как природные лектины, так и искусственные моноклональные антитела, которые иммобилизуются на определенной матрице (чипе) и инкубируются с флуоресцентным образцом гликопротеина. Гликанные массивы, такие как предлагаемые Консорциумом функциональной гликомики и Z Biotech LLC, содержат углеводные соединения, которые можно исследовать с помощью лектинов или антител для определения специфичности к углеводам и выявления лигандов.
Метаболическая и ковалентная маркировка гликанов
Метаболическая метка гликов может быть использована для обнаружения структур гликов. Хорошо известная стратегия включает использование сахаров, меченных азидом, которые могут вступать в реакцию с помощью лигации Штаудингера. Этот метод применялся для визуализации гликов in vitro и in vivo.
Инструменты для гликопротеинов
Рентгеновская кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для полного структурного анализа сложных гликанов – трудная и сложная область. Однако структура участков связывания многочисленных лектинов, ферментов и других белков, связывающих углеводы, позволила выявить широкое разнообразие структурных основ функционирования гликома. Чистота исследуемых образцов достигалась с помощью хроматографии (например, аффинной хроматографии) и аналитического электрофореза (PAGE (полиакриламидный электрофорез), капиллярного электрофореза, аффинного электрофореза и т.д.).