Аналитическая ультрацентрифугация: принципы и применение.
Analytical ultracentrifugation
Аналитическая ультрацентрифугация (AUC): метод анализа образцов в ультрацентрифуге с оптическим мониторингом. Определение профиля седиментации в реальном времени.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Аналитическая ультрацентрифугация – это аналитический метод, сочетающий в себе ультрацентрифугу и системы оптического мониторинга. В аналитической ультрацентрифуге (обычно обозначаемой как AUC) профиль седиментации образца контролируется в реальном времени с помощью оптической системы детектирования. Обнаружение образца осуществляется посредством поглощения ультрафиолетового света и/или интерференционной оптической системы, чувствительной к показателю преломления, контролируемой светочувствительным диодным массивом или, в старых приборах, фотопленкой. Таким образом, оператор может наблюдать изменение концентрации образца относительно оси профиля вращения во времени под воздействием центробежного поля. В современных приборах эти наблюдения оцифровываются и сохраняются для последующего математического анализа. Информация, получаемая с помощью аналитической ультрацентрифуги, включает в себя общую форму макромолекул, изменения их конформации и распределение макромолекул по размерам. С помощью AUC можно получить информацию о количестве и стехиометрии субъединиц нековалентных комплексов, а также константы равновесия макромолекул, таких как белки, ДНК, наночастицы или другие структуры, состоящие из различных классов молекул. Наиболее простым измеряемым параметром является коэффициент седиментации, который зависит от размера седиментируемых молекул. Это отношение скорости седиментации частицы к приложенному ускорению, вызывающему седиментацию. Аналитическая ультрацентрифугация в последнее время получила более широкое распространение благодаря упрощению анализа с использованием современных компьютеров и разработке программного обеспечения, включая программный пакет SedFit, поддерживаемый Национальными институтами здоровья.
Analytical ultracentrifugation is an analytical technique which combines an ultracentrifuge with optical monitoring systems. In an analytical ultracentrifuge (commonly abbreviated as AUC), a sample’s sedimentation profile is monitored in real time by an optical detection system. The sample is detected via ultraviolet light absorption and/or interference optical refractive index sensitive system, monitored by light sensitive diode array or by film in the older machines. The operator can thus observe the change of sample concentration versus the axis of the rotation profile with time as a result of the applied centrifugal field. With modern instrumentation, these observations are electronically digitized and stored for further mathematical analysis. The information that can be obtained from an analytical ultracentrifuge includes the gross shape of macromolecules, conformational changes in macromolecules, and size distributions of macromolecules. With AUC it is possible to gain information on the number and subunit stoichiometry of non covalent complexes and equilibrium constants of macromolecules such as proteins, DNA, nanoparticles or other assemblies from different molecule classes. The simplest measurement to be obtained is the sedimentation coefficient, which depends upon the size of the molecules being sedimented. This is the ratio of a particle's sedimentation velocity to the applied acceleration causing the sedimentation. Analytical ultracentrifugation has recently seen a rise in use because of increased ease of analysis with modern computers and the development of software, including a National Institutes of Health supported software package, SedFit.
Инструментовка
Аналитическая ультрацентрифуга оснащена источником света и оптическими детекторами. Для прохождения света через аналит во время работы ультрацентрифуги необходимы специализированные ячейки, которые должны соответствовать высоким оптическим требованиям и выдерживать центробежные силы. Каждая ячейка состоит из корпуса, двух окон из оптически чистого кварцевого стекла и центральной части с одним или двумя секторами и отверстиями для их заполнения, закрытыми винтовой пробкой в корпусе. Эти ячейки помещаются в полость ротора с сквозным отверстием, с удерживающим воротником в нижней части.
An analytical ultracentrifuge has a light source and optical detectors. To allow the light to pass through the analyte during the ultracentrifuge run, specialized cells are required which have to meet high optical standards as well as to resist the centrifugal forces. Each cell consists of a housing, two windows made from optically pure quartz glass, and a centrepiece with one or two sectors and filling holes for the sector(s), closed with a screw plug in the housing. These cell are placed into a rotor cavity with a continuous bore, with a collar at the bottom to retain the cell.
Виды экспериментов
Применение специализированного оборудования и настройка параметров измерений позволяют проводить различные типы экспериментов. Наиболее часто используемые эксперименты с помощью АСК – это эксперименты по скорости седиментации и седиментационному равновесию.
By applying specific equipment and adapting measurement parameters several types of experiments can be performed. Most common AUC experiments are sedimentation velocity and sedimentation equilibrium experiments.
Скорость осаждения
Эксперименты по определению скорости осаждения позволяют установить форму и молярную массу аналитов, а также их распределение по размерам. Разрешающая способность этого метода приблизительно пропорциональна квадрату радиуса частиц, и путем регулирования скорости вращения ротора эксперимента можно исследовать объекты в диапазоне размеров от 100 Да до 10 ГДа. Эксперименты по определению скорости осаждения также могут быть использованы для изучения обратимых химических равновесий между макромолекулярными видами, посредством мониторинга числа и молярной массы макромолекулярных комплексов, получения информации о составе комплексов с помощью многосигнального анализа, использующего различия в спектроскопических сигналах компонентов, или отслеживания зависимости скорости осаждения макромолекулярной системы от ее состава, как описано в теории Гилберта Дженкинса. Цель эксперимента – наблюдение за поведением при осаждении при постоянной угловой скорости.
Sedimentation velocity experiments render the shape and molar mass of the analytes, as well as their size distribution. The size resolution of this method scales approximately with the square of the particle radii, and by adjusting the rotor speed of the experiment size ranges from 100 Da to 10 GDa can be covered. Sedimentation velocity experiments can also be used to study reversible chemical equilibria between macromolecular species, by either monitoring the number and molar mass of macromolecular complexes, by gaining information about the complex composition from multi signal analysis exploiting differences in each components spectroscopic signal, or by following the composition dependence of the sedimentation rates of the macromolecular system, as described in Gilbert Jenkins theory. The experiment aims to monitor the sedimentation behavior at a fixed angular speed.
Равновесие осаждения
Эксперименты по достижению равновесия осаждения определяют молярную массу аналитов и их константы химического равновесия. Скорость вращения ротора настраивается таким образом, чтобы в ячейке сформировался стационарный профиль концентрации c(r) образца, при котором скорости осаждения и диффузии компенсируют друг друга.
Sedimentation equilibrium experiments reports the molar mass of analytes and their chemical equilibrium constants. The rotor speed is adjusted such that a steady state concentration profile c(r) of the sample in the cell is formed, where sedimentation and diffusion cancel out each other.