Аналитикалық ультрацентрифугация: Макромолекулаларды зерттеу әдісі
Analytical ultracentrifugation
Аналитикалық ультрацентрифугалау – оптикалық жүйелермен біріктірілген талдау әдісі. Намысы мен шоғырлану профилін анықтап, заттарды зерттеуге көмектеседі.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Аналитикалық ультрацентрифугация – ультрацентрифуга мен оптикалық мониторинг жүйелерін біріктіретін аналитикалық әдіс. Аналитикалық ультрацентрифугада (әдетте AUC деп қысқартылады) үлгінің тұнбалану профилі оптикалық анықтау жүйесі арқылы нақты уақытта бақыланады. Үлгі ультракүлгін сәулелерді жұту және/немесе интерференциялық оптикалық сындыру индексіне сезімтал жүйе арқылы анықталады, бұл жарыққа сезімтал диодтар тізімімен немесе ескі машиналарда пленкамен бақыланады. Оператор осылайша айналу профилі осіне қатысты үлгі концентрациясының уақыт өте келе қолданылатын центробегтік өріс нәтижесінде қалай өзгеретінін бақылай алады. Қазіргі заманғы құралдармен бұл бақылаулар электрондық түрде цифрландырылып, математикалық талдау үшін сақталады. Аналитикалық ультрацентрифугадан алынатын ақпаратқа макромолекулалардың жалпы пішіні, макромолекулалардың конформациялық өзгерістері және макромолекулалардың мөлшері бойынша таралуы жатады. AUC көмегімен коваленттік емес кешендердің саны мен құрамдық бөліктерінің стехиометриясы, сондай-ақ ақуыздар, ДНК, нанобөлшектер немесе басқа да молекулалар кластарынан құралған макромолекулалардың тепе-теңдік константалары туралы мәліметтер алуға болады. Ең қарапайым өлшем – тұнбалану коэффициенті, ол тұнбаланатын молекулалардың мөлшеріне байланысты. Бұл – бөлшектің тұнбалану жылдамдығының тұнбалануға түрткіс беретін үдеуге қатынасы. Аналитикалық ультрацентрифугацияның қолданылуы соңғы кезде қазіргі заманғы компьютерлермен талдаудың жеңілдеуі және, атап айтқанда, Ұлттық денсаулық институты қолдауымен жасалған SedFit бағдарламалық қамтамасы сияқты бағдарламалық жасақтаманың дамуына байланысты артып келеді.
Analytical ultracentrifugation is an analytical technique which combines an ultracentrifuge with optical monitoring systems. In an analytical ultracentrifuge (commonly abbreviated as AUC), a sample’s sedimentation profile is monitored in real time by an optical detection system. The sample is detected via ultraviolet light absorption and/or interference optical refractive index sensitive system, monitored by light sensitive diode array or by film in the older machines. The operator can thus observe the change of sample concentration versus the axis of the rotation profile with time as a result of the applied centrifugal field. With modern instrumentation, these observations are electronically digitized and stored for further mathematical analysis. The information that can be obtained from an analytical ultracentrifuge includes the gross shape of macromolecules, conformational changes in macromolecules, and size distributions of macromolecules. With AUC it is possible to gain information on the number and subunit stoichiometry of non covalent complexes and equilibrium constants of macromolecules such as proteins, DNA, nanoparticles or other assemblies from different molecule classes. The simplest measurement to be obtained is the sedimentation coefficient, which depends upon the size of the molecules being sedimented. This is the ratio of a particle's sedimentation velocity to the applied acceleration causing the sedimentation. Analytical ultracentrifugation has recently seen a rise in use because of increased ease of analysis with modern computers and the development of software, including a National Institutes of Health supported software package, SedFit.
Аспаптар
Аналитикалық ультрацентрифугада жарық көзі және оптикалық детекторлар болады. Ультрацентрифуга жұмыс істеу кезінде жарық анализге өтуі үшін, арнайы жасушалар қажет, олар жоғары оптикалық стандарттарға сай болуымен қатар центрифугалық күштерге төтеп бере алуы тиіс. Әрбір жасуша корпустан, оптикалық таза кварц шыныдан жасалған екі терезеден және бір немесе екі сектордан, сондай-ақ сектор(лар)ды толтыруға арналған тесіктерден және корпуста бұрандалы тығынмен жабылатын орталық бөліктен тұрады. Бұл жасушалар үздіксіз тесігі бар ротор қуысына орналастырылады, жасушаны ұстап тұру үшін төменгі жағында сыртқы жиегі болады.
An analytical ultracentrifuge has a light source and optical detectors. To allow the light to pass through the analyte during the ultracentrifuge run, specialized cells are required which have to meet high optical standards as well as to resist the centrifugal forces. Each cell consists of a housing, two windows made from optically pure quartz glass, and a centrepiece with one or two sectors and filling holes for the sector(s), closed with a screw plug in the housing. These cell are placed into a rotor cavity with a continuous bore, with a collar at the bottom to retain the cell.
Эксперименттердің түрлері
Арнайы жабдықтарды қолданып және өлшеу параметрлерін өзгерту арқылы түрлі тәжірибелер жүргізуге болады. Ең көп қолданылатын AUC тәжірибелері – тұнбалану жылдамдығы және тұнбалану тепе-теңдігі тәжірибелері.
By applying specific equipment and adapting measurement parameters several types of experiments can be performed. Most common AUC experiments are sedimentation velocity and sedimentation equilibrium experiments.
Седименттеу жылдамдығы
Седиментация жылдамдығы эксперименттері аналиттердің пішіні мен молярлық массасын, сондай-ақ олардың мөлшерінің үлестірілімін анықтайды. Бұл әдістің мөлшерлік ажыратымдылығы бөлшектер радиусының квадратына пропорционалды, ал ротор жылдамдығын реттеу арқылы 100 Да-тан 10 ГДа-ға дейінгі мөлшерлік диапазонды қамтуға болады. Седиментация жылдамдығы эксперименттері макромолекулалық түрлер арасындағы қайтымды химиялық тепе-теңдіктерді зерттеу үшін де қолданылуы мүмкін: макромолекулалық кешендердің саны мен молярлық массасын бақылау, әр компоненттің спектроскопиялық сигналдарындағы айырмашылықтарды пайдаланып көп сигналды талдау арқылы кешеннің құрамын анықтау, немесе Гилберт Дженкинс теориясында сипатталғандай, макромолекулалық жүйенің тұнбалану жылдамдығының құрамға тәуелділігін қадағалау арқылы. Эксперименттің мақсаты – тұрақты бұрыштық жылдамдықпен тұнбалану процесін бақылау.
Sedimentation velocity experiments render the shape and molar mass of the analytes, as well as their size distribution. The size resolution of this method scales approximately with the square of the particle radii, and by adjusting the rotor speed of the experiment size ranges from 100 Da to 10 GDa can be covered. Sedimentation velocity experiments can also be used to study reversible chemical equilibria between macromolecular species, by either monitoring the number and molar mass of macromolecular complexes, by gaining information about the complex composition from multi signal analysis exploiting differences in each components spectroscopic signal, or by following the composition dependence of the sedimentation rates of the macromolecular system, as described in Gilbert Jenkins theory. The experiment aims to monitor the sedimentation behavior at a fixed angular speed.
Седиментациялық тепе-теңдік
Седименттік тепе-теңдік эксперименттері аналиттердің молярлық массасын және олардың химиялық тепе-теңдік тұрақтыларын анықтайды. Ротордың айналу жылдамдығы жасушадағы c(r) үлгісінің тұрақты концентрация профилі қалыптасатындай реттеледі, онда тұну және диффузия өзара теңеседі.
Sedimentation equilibrium experiments reports the molar mass of analytes and their chemical equilibrium constants. The rotor speed is adjusted such that a steady state concentration profile c(r) of the sample in the cell is formed, where sedimentation and diffusion cancel out each other.