Буркхольдерия псевдомаллей: характеристика и особенности возбудителя мелиоидоза.

Введение

Вид бактерии Burkholderia pseudomallei (также известный как Pseudomonas pseudomallei) – это грамотрицательная, биполярная, аэробная, подвижная палочковидная бактерия. Это почвенная бактерия, эндемичная для тропических и субтропических регионов по всему миру, особенно в Таиланде и северной Австралии. В 2008 году было сообщено о расширении ареала распространения в связи со значительными стихийными бедствиями, и она была обнаружена в Южном Китае, Гонконге и странах Америки. B. pseudomallei, наряду с другими патогенами, была обнаружена у обезьян, импортированных в Соединенные Штаты из Азии для лабораторных исследований, что представляет риск занесения патогена в страну. Хотя это преимущественно почвенная бактерия, исследование, проведенное Apinya Pumpuang и другими, показало, что Burkholderia pseudomallei выживает в дистиллированной воде до 16 лет, что демонстрирует ее способность жить в воде при создании определенных условий. Она устойчива к различным неблагоприятным условиям, включая дефицит питательных веществ, экстремальные температуры или pH. Она заражает людей, вызывая заболевание мелиоидоз; смертность составляет 20–50%, даже при лечении. CDC классифицирует ее как "агент первого уровня" с потенциалом использования в качестве агента биологического терроризма. Она также способна заражать растения в лабораторных условиях. Burkholderia pseudomallei имеет длину 2–5 мкм и диаметр 0,4–0,8 мкм и способна к самодвижению с помощью жгутиков. Бактерии могут расти в различных искусственных питательных средах, особенно содержащих бетаин и аргинин. В лабораторных условиях оптимальная температура для пролиферации составляет около 40 °C в нейтральной или слабокислой среде (pH 6,8–7,0). Большинство штаммов способны к окислению, а не к ферментации сахаров без образования газа (особенно глюкозы и галактозы; в старых культурах также метаболизируется мальтоза и крахмал). Бактерии производят как экзотоксины, так и эндотоксины. Роль токсинов, идентифицированных в процессе развития симптомов мелиоидоза, до конца не выяснена.

Species of bacterium

Burkholderia pseudomallei (also known as Pseudomonas pseudomallei) is a Gram negative, bipolar, aerobic, motile rod shaped bacterium. It is a soil dwelling bacterium endemic in tropical and subtropical regions worldwide, particularly in Thailand and northern Australia. It was reported in 2008 that there had been an expansion of the affected regions due to significant natural disasters, and it could be found in Southern China, Hong Kong, and countries in America. B. pseudomallei, amongst other pathogens, has been found in monkeys imported into the United States from Asia for laboratory use, posing a risk that the pathogen could be introduced into the country. Although it is mainly a soil dwelling bacteria, a study performed by Apinya Pumpuang and others showed that Burkholderia pseudomallei survived in distilled water for 16 years, demonstrating that it is capable of living in water if a specific environment is provided. It is resistant to a variety of harsh conditions including nutrient deficiency, extreme temperature or pH. It infects humans, causing the disease melioidosis; mortality is 20–50% even with treatment. The CDC classifies it as a "Tier 1 select agent" with potential as a bioterrorism agent. It is also capable of infecting plants in a laboratory setting. Burkholderia pseudomallei measures 2–5 μm in length and 0.4–0.8 μm in diameter and is capable of self propulsion using flagella. The bacteria can grow in a number of artificial nutrient environments, especially betaine and arginine containing ones. In vitro, optimal proliferation temperature is reported around 40 °C in neutral or slightly acidic environments (pH 6.8–7.0). The majority of strains are capable of oxidation, not fermentation, of sugars without gas formation (most importantly, glucose and galactose; older cultures are reported to also metabolize maltose and starch). Bacteria produce both exo and endotoxins. The role of the toxins identified in the process of melioidosis symptom development has not been fully elucidated.

Идентификация

Burkholderia pseudomallei не требовательна к питательным средам и растет на широком разнообразии сред для культивирования (агар крови, агар МакКонки, EMB и т.д.). Среда Эшдауна (или среда Burkholderia cepacia) может быть использована для селективной изоляции. Культуры обычно становятся положительными через 24-48 часов (эта высокая скорость роста отличает данный микроорганизм от B. mallei, для роста которого обычно требуется минимум 72 часа). Колонии морщинистые, имеют металлический блеск и земляной запах. При окраске по Граму микроорганизм представляет собой грамотрицательную палочку с характерным видом "шпильки" (биполярное окрашивание). При определении чувствительности к антибиотикам микроорганизм проявляет высокую устойчивость (он изначально устойчив ко многим антибиотикам, включая колистин и гентамицин), что также отличает его от B. mallei, которая, напротив, очень чувствительна ко многим антибиотикам. Только для образцов окружающей среды необходима дифференциация от непатогенной B. thailandensis с использованием теста с арабинозой (B. thailandensis никогда не выделяется из клинических образцов). Лабораторная идентификация B. pseudomallei описана в литературе. Классическое учебное описание B. pseudomallei в клинических образцах – это внутриклеточная, биполярно окрашивающаяся грамотрицательная палочка, но это имеет небольшое значение для идентификации микроорганизма из клинических образцов. Предполагалось, что краситель Вейсона полезен для этой цели, но это не подтвердилось. Лабораторная идентификация B. pseudomallei может быть сложной, особенно в западных странах, где она встречается редко. Большие, морщинистые колонии могут напоминать контаминанты окружающей среды и часто отбрасываются как не имеющие клинического значения. Морфология колоний очень вариабельна, и один штамм может демонстрировать несколько типов колоний, поэтому неопытный персонал лаборатории может ошибочно полагать, что рост не является чистым. Микроорганизм растет медленнее, чем другие бактерии, которые могут присутствовать в клинических образцах, и в образцах из нестерильных участков легко перерастает. Поэтому нестерильные образцы следует культивировать в селективных средах (например, среде Эшдауна или среде B. cepacia). В культурах крови система BacT/ALERT MB (обычно используемая для культивирования микобактерий) производства bioMérieux показала более высокие выходы по сравнению с традиционными средами для культивирования крови. Даже если выделенный штамм признан значимым, обычно используемые системы идентификации могут ошибочно идентифицировать его как Chromobacterium violaceum или другие неферментирующие грамотрицательные палочки, такие как Burkholderia cepacia или Pseudomonas aeruginosa. Кроме того, поскольку заболевание редко встречается в западных странах, обнаружение B. pseudomallei в культурах может не вызывать настороженности у врачей, незнакомых с этим заболеванием. Рутинные биохимические методы идентификации бактерий значительно различаются в отношении идентификации этого микроорганизма: система API 20NE точно идентифицирует B. pseudomallei в 99% случаев, как и автоматизированная система Vitek 1, но автоматизированная система Vitek 2 идентифицирует только 19% изолятов. Однако чувствителен к ко-амоксиклаву: такая картина устойчивости почти никогда не встречается у P. aeruginosa и помогает в идентификации. К сожалению, большинство штаммов в Сараваке (Борнео) чувствительны к аминогликозидам и макролидам, что означает, что обычные рекомендации по изоляции и идентификации неприменимы в этом регионе. Молекулярные методы диагностики (ПЦР) возможны, но не routinely доступны для клинической диагностики. Флуоресцентная in situ гибридизация также описана, но не прошла клиническую валидацию и не доступна в продаже. В Таиланде широко используется латекс-агглютинационный тест.

Burkholderia pseudomallei is not fastidious and grows on a large variety of culture media (blood agar, MacConkey agar, EMB, etc.). Ashdown's medium (or Burkholderia cepacia medium) may be used for selective isolation. Cultures typically become positive in 24 to 48 hours (this rapid growth rate differentiates the organism from B. mallei, which typically takes a minimum of 72 hours to grow). Colonies are wrinkled, have a metallic appearance, and possess an earthy odor. On Gram staining, the organism is a Gram negative rod with a characteristic "safety pin" appearance (bipolar staining). On sensitivity testing, the organism appears highly resistant (it is innately resistant to many antibiotics including colistin and gentamicin) and that again differentiates it from B. mallei, which is in contrast, exquisitely sensitive to many antibiotics. For environmental specimens only, differentiation from the nonpathogenic B. thailandensis using an arabinose test is necessary (B. thailandensis is never isolated from clinical specimens). The laboratory identification of B. pseudomallei has been described in the literature. The classic textbook description of B. pseudomallei in clinical samples is of an intracellular, bipolar staining, Gram negative rod, but this is of little value in identifying the organism from clinical samples. suggest the Wayson stain is useful for this purpose, but this has been shown not to be the case. Laboratory identification of B. pseudomallei can be difficult, especially in Western countries where it is rarely seen. The large, wrinkled colonies look like environmental contaminants, so are often discarded as being of no clinical significance. Colony morphology is very variable and a single strain may display multiple colony types, so inexperienced laboratory staff may mistakenly believe the growth is not pure. The organism grows more slowly than other bacteria that may be present in clinical specimens, and in specimens from nonsterile sites, is easily overgrown. Nonsterile specimens should, therefore, be cultured in selective media (e. g., Ashdown's or B. cepacia medium). In blood culture, the BacT/ALERT MB system (normally used for culturing mycobacteria) by bioMérieux has been shown to have superior yields compared to conventional blood culture media. Even when the isolate is recognized to be significant, commonly used identification systems may misidentify the organism as Chromobacterium violaceum or other nonfermenting, Gram negative bacilli such as Burkholderia cepacia or Pseudomonas aeruginosa. Again, because the disease is rarely seen in Western countries, identification of B. pseudomallei in cultures may not actually trigger alarms in physicians unfamiliar with the disease. Routine biochemical methods for identification of bacteria vary widely in their identification of this organism: the API 20NE system accurately identifies B. pseudomallei in 99% of cases, as does the automated Vitek 1 system, but the automated Vitek 2 system only identifies 19% of isolates. but sensitive to co amoxiclav: this pattern of resistance almost never occurs in P. aeruginosa and is helpful in identification. Unfortunately, the majority of strains in Sarawak, Borneo, are susceptible to aminoglycosides and macrolides, which means the conventional recommendations for isolation and identification do not apply there. Molecular methods (PCR) of diagnosis are possible, but not routinely available for clinical diagnosis. Fluorescence in situ hybridisation has also been described, but has not been clinically validated, and it is not commercially available. In Thailand, a latex agglutination assay is widely used,

Дезинфекция

Burkholderia pseudomallei восприимчива ко многим дезинфицирующим средствам, включая хлорид бензалкония, йод, хлорид ртути, перманганат калия, 1% гипохлорит натрия, 70% этанол, 2% глутаральдегид и, в меньшей степени, фенольные препараты. B. pseudomallei эффективно уничтожается коммерческими дезинфицирующими средствами Perasafe и Virkon. Микроорганизм также может быть уничтожен нагреванием до температуры выше 74 °C в течение 10 минут или ультрафиолетовым облучением.

Медицинское значение

Инфекция Burkholderia pseudomallei у людей называется мелиоидозом или болезнью Уитмора. Она распространяется при прямом контакте с водой или почвой, содержащей бактерии. Зарегистрированы единичные случаи передачи бактерий перинатально. Смертность составляет от 20 до 50%, даже при лечении. Диффузионные тесты с дисками ненадёжны при определении устойчивости B. pseudomallei к ко-тримоксазолу (они значительно завышают уровень устойчивости), поэтому предпочтительнее использовать Etest или тесты с разведением на агаре. Действие ко-тримоксазола и доксициклина оказывает антагонистический эффект, что указывает на нежелательность их одновременного применения. Данный микроорганизм обладает врождённой устойчивостью к гентамицину и колистину, что помогает в его идентификации. Канамицин используется для уничтожения B. pseudomallei в лабораторных условиях, однако концентрации, необходимые для этого, значительно превышают те, которые можно достичь в организме человека.

Механизмы патогенности и факторы вирулентности

Burkholderia pseudomallei – оппортунистический патоген. Являясь обитателем окружающей среды, он не нуждается в прохождении через животного хозяина для репликации. С точки зрения бактерии, инфицирование человека – это тупик в развитии. Штаммы, вызывающие заболевание у людей, отличаются от вызывающих заболевание у других животных наличием определенных геномных островов. Способность вызывать заболевание у человека может быть обусловлена ДНК, приобретенной от других микроорганизмов. Burkholderia pseudomallei способна проникать в клетки (является внутриклеточным патогеном). Она способна полимеризовать актин и распространяться от клетки к клетке, вызывая слияние клеток и образование многоядерных гигантских клеток. Она обладает уникальной фузогенной системой секреции типа VI, которая необходима для распространения клеток и вирулентности у хозяев-млекопитающих. Бактерия также экспрессирует токсин, называемый летальным фактором 1. B. pseudomallei – одна из первых протеобактерий, у которой была выявлена активная система секреции типа VI. Это также единственный организм, у которого обнаружено до шести различных систем секреции типа VI. B. pseudomallei обладает врожденной устойчивостью ко многим антимикробным препаратам благодаря механизму эффлюксного насоса. Этот механизм обуславливает устойчивость к аминогликозидам (AmrAB OprA), тетрациклинам, фторхинолонам и макролидам (BpeAB OprB).

Кандидатские вакцины

К 2023 году ни одна вакцина не была лицензирована, хотя многие были оценены в ходе доклинических исследований. Предлагались кандидаты в вакцины. Мутанты с делецией гена аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназы (asd) являются ауксотрофами по диаминопимелату (DAP) в богатых средах и ауксотрофами по DAP, лизину, метионину и треонину в минимальных средах. Бактерия Δasd (бактерия с удаленным геном asd) обеспечивает защиту от ингаляционного мелиоидоза у мышей.

Преобразование

Burkholderia pseudomoallei может подвергаться трансформации. Бактерии способны поглощать свободную плазмиду посредством электропорации, и плазмидный материал интегрируется в ДНК хозяина при электрокомпетентности. Примером служит эксперимент, проведенный Маком К. и Титболлом Р. В., который показал, что Burkholderia pseudomallei 4845 способна к трансформации с использованием электропорации и плазмиды incQ pKT230.