Апоптосом: структура, формирование и роль в апоптозе.

Введение

Белковый комплекс, участвующий в клеточном процессе апоптоза. Апоптосома – это крупная четвертичная белковая структура, формирующаяся в процессе апоптоза. Ее образование запускается высвобождением цитохрома c из митохондрий в ответ на внутренний (интринсивный) или внешний (экстринсивный) стимул клеточной гибели. Стимулы могут варьироваться от повреждения ДНК и вирусной инфекции до сигналов развития, например, тех, что приводят к деградации хвоста головастика. В клетках млекопитающих, после высвобождения цитохрома c, он связывается с цитозольным белком Apaf-1, способствуя образованию апоптосомы. Раннее биохимическое исследование предполагало соотношение цитохрома c к Apaf-1 как 2:1 для формирования апоптосомы. Однако, недавние структурные исследования указывают на соотношение цитохрома c к Apaf-1 как 1:1. Также было показано, что нуклеотид dATP в качестве третьего компонента связывается с Apaf-1, однако его точная роль все еще остается предметом дискуссий. Апоптосома млекопитающих никогда не была кристаллизована, но человеческая апоптосома APAF-1/цитохром c была визуализирована при более низком (2 нм) разрешении с помощью криогенной трансмиссионной электронной микроскопии в 2002 году.

После формирования, апоптосома способна рекрутировать и активировать неактивную про-каспазу 9. После активации, эта инициаторская каспаза может активировать эффекторные каспазы и запускать каскад событий, ведущих к апоптозу.

История

Термин «апоптосома» впервые был введен в статье Йосихиде Цухимото 1998 года «Роль белков семейства Bcl-2 в апоптозе: апоптосомы или митохондрии?». Однако до этого времени апоптосома была известна как троичный комплекс. В этот комплекс входили каспаза-9 и Bcl-XL, каждая из которых связывалась с определенным доменом Apaf-1. Считалось, что образование этого комплекса играет регуляторную роль в гибели клеток млекопитающих. В декабре того же года в журнале *The Journal of Biological Chemistry* была опубликована еще одна статья, утверждающая, что Apaf-1 является регулятором апоптоза посредством активации про-каспазы-9. Критерии для определения апоптосомы были сформулированы в 1999 году. Во-первых, это должен быть крупный комплекс (более 1,3 миллиона дальтон). Во-вторых, для его формирования требуется гидролиз высокоэнергетической связи АТФ или dATP. И, в-третьих, он должен активировать про-каспазу-9 в ее функциональной форме. Формирование этого комплекса – это точка невозврата, после которой наступит апоптоз. Стабильный мультимерный комплекс APAF-1 и цитохрома соответствует этому описанию и теперь называется апоптосомой. Апоптосома рассматривалась как мультимерный комплекс по двум причинам. Во-первых, для сближения нескольких молекул про-каспазы-9 с целью их расщепления. Во-вторых, для повышения порога апоптоза, чтобы неспецифическая утечка цитохрома c не приводила к апоптозу. Текущие направления исследований этого пути будут рассмотрены более подробно. Существуют также скрытые пути гибели клеток, независимые от APAF-1 и, следовательно, от апоптосомы. Эти пути также не зависят от каспаз-3 и -9. Эти скрытые пути апоптоза протекают медленнее, но могут оказаться полезными при дальнейших исследованиях. [[Файл:Apop atomic model.jpg|thumb|alt=Псевдоатомная структура человеческой апоптосомы.|Псевдоатомная структура человеческой апоптосомы (Yuan et al. 2010, Structure of an apoptosome procaspase 9 CARD complex). Стрессовый стимул может вызвать высвобождение цитохрома c в цитоплазму, который затем связывается с C-концевым участком Apaf-1 в области, содержащей несколько WD-40 повторов. Стехиометрия цитохрома c и Apaf-1 в комплексе установлена как 1:1. Кроме того, сообщалось, что несколько других молекул, в частности каспаза-3, ко-очищаются с апоптосомой. CARD-домен Apaf-1 взаимодействует с про-каспазой-9 и участвует в ее рекрутировании в апоптосому.

The term Apoptosome was first introduced in Yoshihide Tsujimoto's 1998 paper "Role of Bcl 2 family proteins in apoptosis: apoptosomes or mitochondria?". However, the Apoptosome was known before this time as a ternary complex. This complex involved caspase 9 and Bcl XL which each bound a specific Apaf 1 domain. The formation of this complex was then believed to play a regulatory role in mammalian cell death. In December of the same year, a further article was released in The Journal of Biological Chemistry stating that Apaf 1 is the regulator of apoptosis, through activation of procaspase 9. The criteria for an apoptosome were laid out in 1999. Firstly, it must be a large complex (greater than 1.3 million daltons). Secondly its formation requires the hydrolysis of a high energy bond of ATP or dATP. And lastly it must activate procaspase 9 in its functional form. The formation of this complex is the point of no return, and apoptosis will occur. The stable APAF 1 and cytochrome multimeric complex fit this description, and is now called the apoptosome. The apoptosome was thought to be a multimeric complex for two reasons. Firstly, to bring multiple procaspase 9 molecules close together for cleavage. And secondly, to raise the threshold for apoptosis, therefore nonspecific leakage of cytochrome c would not result in apoptosis. Current research areas for this pathway will be discussed in further detail. There are hidden routes for cell death as well, which are independent of APAF 1 and therefore the apoptosome. These routes are also independent of caspase 3 and 9. These hidden pathways for apoptosis are slower, but may prove useful with further research. [[File:Apop atomic model. jpg|thumb|alt=Pseudo atomic structure of the human apoptosome.|Pseudo atomic structure of the human apoptosome (Yuan et al. 2010, Structure of an apoptosome procaspase 9 CARD complex
A stress stimulus can trigger the release of cytochrome c into the cytoplasm which will then bind to the C terminus of Apaf 1 within a region containing multiple WD 40 repeats. The stoichiometry of cytochrome c to Apaf 1 within the complex is proved to be 1:1. In addition, several other molecules, most notably caspase 3, have been reported to co purify with the apoptosome
The CARD domain of Apaf 1 interacts with procaspase 9 and involved with recruitment within the apoptosome.

Введение

Начало действия апоптосомы соответствует первым этапам пути запрограммированной гибели клеток (ПГК). У животных апоптоз может быть запущен двумя путями: экстринсикальный путь включает связывание внеклеточных лигандов с трансмембранными рецепторами, а интринсикальный путь происходит в митохондриях. Интринсикальный путь включает высвобождение цитохрома С из митохондрий и последующее связывание с цитозольным белком Apaf-1. Таким образом, высвобождение цитохрома С необходимо для инициации действия апоптосомы; это высвобождение регулируется различными факторами, наиболее важным из которых является определение уровня ионов кальция. Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, являются возрастными заболеваниями и характеризуются усиленным апоптозом, при котором погибают клетки, которые все еще способны функционировать или поддерживают функции тканей. Apaf-1 ALT – это мутант Apaf-1, обнаруженный при раке предстательной железы, которому не хватает аминокислотных остатков с 339 по 1248. Недавние структурные исследования апоптосомы показали, что Apaf-1 ALT не способен формировать апоптосому, поскольку ему не хватает ключевых структурных компонентов, необходимых для сборки.

Мутации P53 при апоптозе

P53 функционирует как супрессор опухолей, участвуя в предотвращении рака и естественным образом вовлеченный в апоптотические пути. P53 индуцирует апоптоз клеток и блокирует дальнейшее деление, тем самым предотвращая их злокачественное перерождение (16). В большинстве случаев рака именно p53-путь подвергается мутациям, что приводит к утрате способности элиминировать дисфункциональные клетки. Функция P53 также может быть связана с ограниченным сроком жизни, когда мутации гена p53 вызывают экспрессию доминантных негативных форм, приводя к увеличению продолжительности жизни организмов. Например, в эксперименте на C. elegans было показано, что повышенная продолжительность жизни мутантов p53 зависит от усиления аутофагии. Способность непосредственно вызывать активацию апоптосомы имеет ценность в терапии рака, поскольку пораженные раковые гены не могут быть уничтожены, что приводит к непрерывному росту опухоли. Активация апоптосомы внешним стимулом может вызвать апоптоз и устранить мутировавшие клетки. В настоящее время разрабатываются многочисленные подходы для достижения этого, включая рекомбинантные биомолекулы, антисмысловые стратегии, генную терапию и классическую органическую комбинаторную химию, направленные на специфические регуляторы апоптоза для коррекции избыточной или недостаточной гибели клеток при заболеваниях человека. В целом, повышение экспрессии антиапоптотических белков предотвращает апоптоз, что можно преодолеть с помощью ингибиторов, а снижение экспрессии антиапоптотических белков индуцирует апоптоз, который можно обратить вспять с помощью активаторов, способных связываться с ними и изменять их активность. Важной молекулой-мишенью в апоптоз-ориентированной терапии является Bcl-2 для разработки лекарственных препаратов. Bcl-2 был первым онкогеном, обнаруженным как ингибитор апоптоза, способный вызывать рак. Он сверхэкспрессируется в опухолях и устойчив к химиотерапии. Ученые выяснили, что связывание ингибиторов с антиапоптотическими белками Bcl-2 подавляет их активность, освобождая прямые активаторы для взаимодействия с Bax и Bak. Другой мишенью для терапии рака является семейство каспаз и их регуляторы. Ингибирование активности каспаз блокирует гибель клеток при заболеваниях человека, включая нейродегенеративные расстройства, инсульт, инфаркт миокарда и повреждение печени. Следовательно, ингибиторы каспаз являются перспективным фармакологическим инструментом для лечения инсульта и других заболеваний человека. В настоящее время несколько ингибиторов каспаз находятся на доклинической стадии и демонстрируют многообещающие результаты в отношении обратимости некоторых нейродегенеративных заболеваний. В недавнем исследовании ученые разработали обратимый ингибитор каспазы-3 под названием M 826 и протестировали его на мышах, где он блокировал повреждение тканей мозга. Кроме того, он был протестирован на мышах с болезнью Гентингтона, и ингибитор предотвратил гибель полосатых нейронов, что указывает на перспективность дальнейшего изучения этого ингибитора каспазы.

P53 functions as a tumor suppressor that is involved in preventing cancer and occurs naturally in apoptotic pathways. P53 causes cells to enter apoptosis and disrupt further cell division therefore preventing that cell from becoming cancerous (16). In the majority of cancers it is the p53 pathway that has become mutated resulting in lack of ability to terminate dysfunctional cells. P53 function can also be responsible for a limited life span where mutations of the p53 gene causes expression of dominant negative forms producing long lived animals. For example in an experiment using C. elegans, the increased life span of p53 mutants was found to depend on increased autophagy. The ability to directly cause apoptosome activation is valuable in cancer therapies because the infected cancerous genes are unable to be destroyed causing a continuation of the cancer to form. By activating the apoptosome by an outside stimulus apoptosis can occur and get rid of the mutated cells. Numerous approaches to achieve this are currently being pursued including recombinant biomolecules, antisense strategies, gene therapy and classic organic combinatorial chemistry to target specific apoptotic regulators in the approach to correct excessive or deficient cell death in human diseases. In general the up regulation of anti apoptotic proteins leads to the prevention of apoptosis which can be solved by inhibitors and the down regulation of anti apoptotic proteins leads to the induction of apoptosis which is reversed by activators that are able to bind and modify their activity. An important target molecule in apoptosis based therapies is Bcl 2 for drug design. Bcl 2 was the first oncogene found to cause cancer inhibiting apoptosis. It is over expressed in tumors and is resistant to chemotherapy. Scientists have found that binding depressors to Bcl 2 anti apoptotic proteins inhibits them and leaves direct activators free to interact with Bax and Bak. Another targeted molecule for cancer therapy involves the caspase family and their regulators. The inhibition of caspase activity blocks cell death in human disease including neurodegenerative disorders, stroke, heart attack and liver injury. Therefore, caspase inhibitors are a promising pharmacological tool providing treatments for stroke and other human diseases. There are several caspase inhibitors that are currently in the preclinical stage that have shown promising evidence of reversing effects of some neurodegenerative diseases. In a recent study researchers developed a reversible caspase 3 inhibitor called M 826 and tested it in a mouse model where it blocked brain tissue damage. Furthermore, it was tested on a mouse with Huntington's disease and the inhibitor prevented striated neuron death revealing promising effects for further study of this caspase inhibitor.

Комплекс апоптосом открыл новые потенциальные мишени для молекулярной терапии

Образование апоптосомы Apaf1/caspase 9 является ключевым событием в апоптотическом каскаде. Идентификация новых потенциальных лекарственных средств, предотвращающих или стабилизирующих формирование активного апоптосомного комплекса, представляет собой идеальную стратегию для лечения заболеваний, характеризующихся избыточным или недостаточным апоптозом. Недавно было установлено, что таурин предотвращает ишемически индуцированный апоптоз в кардиомиоцитах благодаря своей способности ингибировать образование апоптосомы Apaf1/caspase 9, не предотвращая при этом митохондриальную дисфункцию. Возможный механизм, посредством которого таурин ингибирует формирование апоптосомы, был определен как способность снижать экспрессию caspase 9 – фундаментального компонента апоптосомы. Однако существуют исследования, показывающие, что Apaf1 и caspase 9 выполняют независимые функции, помимо участия в апоптосоме, поэтому изменение их уровней может также повлиять на клеточную функцию. Таким образом, несмотря на обнадеживающие экспериментальные данные, ряд проблем остается нерешенным и ограничивает применение экспериментальных препаратов в клинической практике. Открытие ингибиторов апоптосомы предоставит новый терапевтический инструмент для лечения заболеваний, опосредованных апоптозом. Особый интерес представляют новые соединения, способные ингибировать стабильность и активность апоптосомы, воздействуя на внутриклеточные белок-белковые взаимодействия, не изменяя транскрипционные уровни компонентов апоптосомы. Недавние структурные исследования апоптосомы могут предоставить ценные инструменты для разработки терапевтических подходов, основанных на апоптосоме.