Лазерная микродиссекция: методы и применение.

Введение

Микродиссекция с лазерным захватом (LCM), также известная как микродиссекция, лазерная микродиссекция (LMD) или лазерно-ассистированная микродиссекция (LMD или LAM), – это метод изоляции конкретных интересующих клеток из микроскопических участков ткани, клеток или организмов (диссекция в микроскопическом масштабе с использованием лазера).

Принцип

Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) – это метод получения субпопуляций клеток ткани под непосредственным микроскопическим контролем. Технология LCM позволяет непосредственно выделять интересующие клетки или изолировать специфические клетки, удаляя нежелательные, для получения гистологически чистых и обогащенных клеточных популяций. Существует широкий спектр последующих применений: генотипирование ДНК и анализ потери гетерозиготности (LOH), профилирование РНК-транскриптов, создание библиотек кДНК, протеомные исследования и профилирование сигнальных путей. Общее время, необходимое для выполнения данного протокола, обычно составляет 1–1,5 часа.

Экстракция

Лазер соединяется с микроскопом и фокусируется на ткани на предметном стекле. При перемещении лазера с помощью оптики или стола фокус следует по траектории, заданной пользователем. Эта траектория, также называемая элементом, затем вырезается и отделяется от прилегающей ткани. После процесса вырезания, при необходимости, следует процесс извлечения. Более современные технологии используют бесконтактную микродиссекцию. Существует несколько способов извлечь ткань с микроскопического предметного стекла, содержащего гистопатологический образец. Прижмите липкую поверхность к образцу и оторвите. Это извлекает нужный участок, но может также удалять частицы или нежелательную ткань с поверхности, поскольку поверхность не является селективной. Расплавьте пластиковую мембрану на образце и оторвите. Тепло подается, например, красным или инфракрасным (ИК) лазером на мембрану, окрашенную поглощающим красителем. Поскольку это прикрепляет нужный образец к мембране, как и в случае с любой мембраной, поднесенной близко к поверхности гистопатологического образца, может быть извлечено некоторое количество мусора. Другая опасность – это воздействие тепла: некоторые молекулы, такие как ДНК, РНК или белки, не допускают сильного нагрева или нагрева вообще, чтобы обеспечить максимально чистую изоляцию. Для бесконтактной транспортировки существует три различных подхода. Транспортировка под действием силы тяжести с использованием прямостоящего микроскопа (называемая GAM, микродиссекция с использованием гравитационной помощи) или транспортировка с помощью лазерной катапульты; последнее поколение использует технологию, основанную на лазерном индуцированном прямом переносе (LIFT). В методе «вырезание и захват» колпачок, покрытый адгезивом, помещается непосредственно на тонкий срез ткани (5–8 мкм), который опирается на тонкую мембрану (полиэтиленнафталат). ИК-лазер мягко нагревает адгезив на колпачке, сплавляя его с подлежащей тканью, а УФ-лазер разрезает ткань и подлежащую мембрану. Теперь тканевый блок, прикрепленный к мембране, прилипает к колпачку, и клетки на колпачке могут быть использованы в последующих анализах (анализ ДНК, РНК, белков).

A laser is coupled into a microscope and focuses onto the tissue on the slide. By movement of the laser by optics or the stage the focus follows a trajectory which is predefined by the user. This trajectory, also called element, is then cut out and separated from the adjacent tissue. After the cutting process, an extraction process has to follow if an extraction process is desired. More recent technologies utilize non contact microdissection. There are several ways to extract tissue from a microscope slide with a histopathology sample on it. Press a sticky surface onto the sample and tear out. This extracts the desired region, but can also remove particles or unwanted tissue on the surface, because the surface is not selective. Melt a plastic membrane onto the sample and tear out. The heat is introduced, for example, by a red or infrared (IR) laser onto a membrane stained with an absorbing dye. As this adheres the desired sample onto the membrane, as with any membrane that is put close to the histopathology sample surface, there might be some debris extracted. Another danger is the introduced heat: Some molecules like DNA, RNA, or protein don't allow to be heated too much or at all for the goal of being isolated as purely as possible. For transport without contact. There are three different approaches. Transport by gravity using an upright microscope (called GAM, gravity assisted microdissection) or transport by laser pressure catapult; the most recent generation utilizes a technology based on laser induced forward transfer (LIFT). With cut and capture, a cap coated with an adhesive is positioned directly on the thinly cut (5 8 μm) tissue section, the section itself resting on a thin membrane (polyethylene naphthalene). An IR laser gently heats the adhesive on the cap fusing it to the underlying tissue and an UV laser cuts through tissue and underlying membrane. The membrane tissue entity now adheres to the cap and the cells on the cap can be used in downstream applications (DNA, RNA, protein analysis).

Процедура

Под микроскопом с использованием программного интерфейса рассматривается гистологический срез (обычно толщиной 5–50 микрометров), и отдельные клетки или группы клеток идентифицируются вручную, полуавтоматически или полностью автоматизированными способами, позволяющими визуализировать и затем автоматически выбирать цели для изоляции. В настоящее время существует шесть основных технологий изоляции/сбора, использующих микроскоп и устройство для изоляции клеток. Четыре из них обычно используют ультрафиолетовый импульсный лазер (355 нм) для разрезания ткани непосредственно или мембраны/пленки, а иногда в сочетании с инфракрасным лазером, отвечающим за нагрев/плавление липкого полимера для клеточной адгезии и изоляции. ИК-лазер обеспечивает более бережный подход к микродиссекции. Пятая технология, основанная на ультрафиолетовом лазере, использует специальные предметные стекла, покрытые слоем для передачи энергии, который при активации лазерным импульсом выталкивает ткань или клетки в коллекторную крышку. Ширина лазерного разреза обычно менее 1 мкм, поэтому на целевые клетки лазерный луч не влияет. Даже живые клетки не повреждаются при лазерном разрезании и сохраняют жизнеспособность после разрезания для клонирования и рекультивирования, при необходимости. Различные технологии отличаются процессом сбора, возможными методами визуализации (флуоресцентная микроскопия, фазово-контрастная микроскопия, дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия, микроскопия в светлом поле и т.д.), а также типами держателей и необходимой подготовки ткани перед визуализацией и изоляцией. Большинство из них – специализированные микродисекционные системы, некоторые могут использоваться и как исследовательские микроскопы; только одна технология (#2, Leica) использует перевернутый микроскоп, что несколько ограничивает возможности манипулирования образцом, особенно при работе с живыми клетками. Первая технология (используемая Carl Zeiss PALM) вырезает вокруг образца, а затем собирает его с помощью технологии «катапультирования». Образец может быть катапультирован со стекла или специальной чашки Петри с помощью дефокусированного ультрафиолетового лазерного импульса, который создает фотонную силу для отталкивания материала от стекла/чашки Петри – метод, иногда называемый лазерной микродиссекцией с применением давления катапультирования (LMPC). Выделенный материал направляется вверх (до нескольких миллиметров) в крышку микроцентрифужной пробирки или другой коллектор, содержащий либо буфер, либо специализированный липкий материал в крышке пробирки, к которому ткань будет прилипать. Этот активный процесс катапультирования позволяет избежать некоторых статических проблем при использовании стекол с мембранным покрытием. Другой процесс основан на методе микродиссекции с использованием гравитации, который использует гравитацию для сбора образцов в крышку пробирки под используемым стеклом (используется в системе ION LMD, Jungwoo F&B). В этом случае система перемещает моторизованную сцену для разрезания интересующих клеток, удерживая лазерный луч неподвижным. Система использует твердотельный лазер 355 нм (УФ-А), который является самым безопасным способом разрезания ткани без повреждения РНК или ДНК. Другая тесно связанная технология LCM (используемая Leica) вырезает образец сверху, и образец падает вниз под действием гравитации (микродиссекция с использованием гравитации) в устройство захвата, расположенное ниже образца. Отличие от предыдущей заключается в том, что лазерный луч здесь перемещается для разрезания ткани, перемещая дихроическое зеркало. Когда выбранные клетки (на стекле или специальной чашке Петри) находятся в центре поля зрения, оператор выбирает интересующие клетки с помощью программного обеспечения прибора. Область, которую необходимо изолировать, активируется либо с помощью ближнего инфракрасного лазера для активации передающей пленки на крышке, помещенной на образец ткани, расплавления клея, который затем сливается с пленкой и лежащими под ней выбранными клетками (см. системы Arcturus), либо с помощью ультрафиолетового лазера для вырезания интересующей клетки. Затем клетки отделяются от тонкого среза ткани, оставляя все нежелательные клетки позади. Интересующие клетки просматриваются и документируются перед извлечением. Четвертая технология, основанная на УФ-излучении (используемая Molecular Machines and Industries AG), немного отличается от третьей, по сути создавая «сэндвич» из стекла > образца > и мембраны, покрывающей образец, с помощью рамкового стекла, мембранная поверхность которого разрезается лазером и затем собирается сверху с помощью специальной адгезивной крышки. Пятая технология, основанная на УФ-излучении, использует стандартные стеклянные предметные стекла, покрытые инертным слоем для передачи энергии, и систему УФ-лазерной микродиссекции (обычно Leica LMD или PALM Zeiss). Гистологические срезы монтируются на слой для передачи энергии. Энергия УФ-лазера преобразуется в кинетическую энергию при воздействии на слой, испаряя его и мгновенно выталкивая выбранные элементы ткани в коллекторную пробирку. Предметные стекла с покрытием для передачи энергии, продаваемые под торговой маркой DIRECTOR slides компанией Expression Pathology Inc. (Rockville, MD), обладают несколькими преимуществами для протеомных исследований. Они также не проявляют автофлуоресценцию, поэтому могут использоваться для приложений с использованием флуоресцентных красителей, дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии или поляризованного света. Помимо гистологических срезов, LCM можно проводить на живых клетках/организмах, мазках клеток, препаратах хромосом и растительной ткани.

Under a microscope using a software interface, a tissue section (typically 5 50 micrometres thick) is viewed and individual cells or clusters of cells are identified either manually or in semi automated or more fully automated ways allowing the imaging and then automatic selection of targets for isolation. Currently six primary isolation/collection technologies exist using a microscope and device for cell isolation. Four of these typically use an ultraviolet pulsed laser (355 nm) for the cutting of the tissues directly or the membranes/film, and sometimes in combination with an IR laser responsible for heating/melting a sticky polymer for cellular adhesion and isolation. IR laser provides a more gentle approach to microdissection. A fifth ultraviolet laser based technology uses special slides coated with an energy transfer coating which, when activated by the laser pulse, propels the tissue or cells into a collection cap. The laser cutting width is usually less than 1 μm, thus the target cells are not affected by the laser beam. Even live cells are not damaged by the laser cutting and are viable after cutting for cloning and reculturing as appropriate. The various technologies differ in the collection process, possible imaging methods (fluorescence microscopy/bright field microscopy/differential interference contrast microscopy/phase contrast microscopy/ etc.) and the types of holders and tissue preparation needed before the imaging and isolation. Most are primarily dedicated micro dissection systems, and some can be used as research microscopes as well, only one technology (#2 here, Leica) uses an upright microscope, limiting some of the sample handling capabilities somewhat, especially for live cell work. The first technology (used by Carl Zeiss PALM) cuts around the sample then collects it by a "catapulting" technology. The sample can be catapulted from a slide or special culture dish by a defocused U. V laser pulse which generates a photonic force to propel the material off the slide/dish, a technique sometimes called Laser Micro dissection Pressure Catapulting (LMPC). The dissected material is sent upward (up to several millimetres) to a microfuge tube cap or other collector which contains either a buffer or a specialized tacky material in the tube cap that the tissue will adhere to. This active catapulting process avoids some of the static problems when using membrane coated slides. Another process follows gravity assisted microdissection method that turns on gravity to collect samples in tube cap under the slide used (used by ION LMD system, Jungwoo F&B). In case of this system, it moves the motorized stage to cut the cells of interests, keeping the laser beam fixed. And the system uses a 355 nm Solid state laser(UV A) which is the safest way to cut the tissues without RNA or DNA damage. Another closely related LCM process (used by Leica) cuts the sample from above and the sample drops via gravity (gravity assisted microdissection) into a capture device below the sample. The different point with upper one is, the laser beam here is moving to cut tissue by moving dichroic mirror. When the cells (on a slide or special culture dish) of choice are in the center of the field of view, the operator selects the cells of interest using instrument software. The area to be isolated when a near IR laser to activate transfer film on a cap placed on the tissue sample, melting the adhesive which then fuses the film with the underlying cells of choice (see Arcturus systems); and/or by activating a UV laser to cut out the cell of interest. The cells are then lifted off the thin tissue section, leaving all unwanted cells behind. The cells of interest are then viewed and documented prior to extraction. The fourth UV based technology (used by Molecular Machines and Industries AG) offers a slight difference to the 3rd technology here by essentially creating a sandwich of sorts with slide>sample>and membrane overlying the sample by the use of a frame slide whose membrane surface is cut by the laser and ultimately picked up from above by a special adhesive cap. A fifth UV based technology uses standard glass slides coated with an inert energy transfer coating and a UV based laser microdissection system (typically a Leica LMD or PALM Zeiss machine). Tissue sections are mounted on top of the energy transfer coating. The energy from a UV laser is converted to kinetic energy upon striking the coating, vaporizing it, instantly propelling selected tissue features into the collection tube. The energy transfer coated slides, commercialized under the trade name DIRECTOR slides by Expression Pathology Inc. (Rockville, MD), offer several advantages for proteomic work. They also do not autofluoresce, so they can be used for applications using fluorescent stains, DIC or polarized light. In addition to tissue sections, LCM can be performed on living cells/organisms, cell smears, chromosome preparations, and plant tissue.

Приложения

Процесс лазерного захвата при микродиссекции не изменяет и не повреждает морфологию и химический состав собранного образца, равно как и окружающих клеток. По этой причине лазерная микродиссекция (LCM) является эффективным методом сбора отдельных клеток для анализа ДНК, РНК и/или белков. Лазерная микродиссекция (LCM) также применяется для выделения ацеллюлярных структур, таких как амилоидные бляшки. Метод может использоваться с различными типами образцов тканей, включая мазки крови, цитологические препараты, клеточные культуры и пробы твердых тканей. Допустимо использование как замороженных, так и залитых в парафин архивных тканей.