Введение

Метод индукционной экспрессии генов

Тетрациклин-контролируемая транскрипционная активация – это метод индукционной экспрессии генов, при котором транскрипция обратимо включается или выключается в присутствии антибиотика тетрациклина или одного из его производных (например, доксициклина). Экспрессия генов, контролируемая тетрациклином, основана на механизме устойчивости к тетрациклиновым антибиотикам, обнаруженном у грамотрицательных бактерий. В природе промотор Ptet экспрессирует TetR (репрессор) и TetA – белок, который выкачивает тетрациклин из клетки. Разница между системами Tet On и Tet Off заключается не в том, включает или выключает трансактиватор ген, как можно предположить по названию; оба белка активируют экспрессию. Различие связано с их реакцией на тетрациклин или доксициклин (Dox, более стабильный аналог тетрациклина): Tet Off активирует экспрессию в отсутствие Dox, а Tet On – в его присутствии.

Отключение и включение

Две наиболее часто используемые системы индукционной экспрессии для исследований биологии эукариотических клеток называются Tet Off и Tet On. Система Tet Off для контроля экспрессии интересующих генов в клетках млекопитающих была разработана профессорами Германном Буярдом [de] и Манфредом Госсеном в Гейдельбергском университете и впервые опубликована в 1992 году. Система Tet Off использует белок-трансактиватор тетрациклина (tTA), который создается путем слияния одного белка, TetR (репрессор тетрациклина), обнаруженного в бактериях Escherichia coli, с доменом активации другого белка, VP16, обнаруженного в вирусе простого герпеса. Полученный в результате белок tTA способен связываться с ДНК в определенных последовательностях операторов TetO. В большинстве систем Tet Off несколько повторений таких последовательностей TetO размещаются выше по течению от минимального промотора, такого как промотор CMV. Совокупность нескольких последовательностей TetO с минимальным промотором называется элементом тетрациклиновой реакции (TRE), поскольку она реагирует на связывание белка-трансактиватора тетрациклина tTA путем повышения экспрессии гена или генов, расположенных ниже по течению от его промотора. В системе Tet Off экспрессия генов, контролируемых TRE, может быть подавлена тетрациклином и его производными. Они связывают tTA и делают его неспособным связываться с последовательностями TRE, тем самым предотвращая трансактивацию генов, контролируемых TRE. Система Tet On работает аналогично, но в противоположном направлении. В то время как в системе Tet Off tTA способен связывать оператор только в том случае, если он не связан с тетрациклином или одним из его производных, таких как доксициклин, в системе Tet On белок rtTA способен связывать оператор только в том случае, если он связан с тетрациклином. Таким образом, введение доксициклина в систему инициирует транскрипцию генетического продукта. Система Tet On иногда предпочтительнее, чем Tet Off, из-за более быстрой скорости отклика. Системы экспрессии Tet Off также используются для создания трансгенных мышей, условно экспрессирующих интересующий ген.

Tet-On Advanced и Tet-On 3G

Трансактиватор Tet On Advanced (также известный как rtTA2S M2) является альтернативной версией Tet On, демонстрирующей сниженную базальную экспрессию и функционирующей при десятикратно меньшей концентрации доксициклина (Dox), чем Tet Off. Кроме того, его экспрессия считается более стабильной в эукариотических клетках благодаря оптимизации кодонов для человека и использованию трех минимальных доменов транскрипционной активации. Он был обнаружен в 2000 году Х. Буярдом и его коллегами как один из двух улучшенных мутантов, полученных в результате случайного мутагенеза репрессорной части гена трансактиватора. Tet On 3G (также известный как rtTA V10) аналогичен Tet On Advanced, но был получен из rtTA2S S2, а не rtTA2S M2. Он также оптимизирован для кодонов человека и состоит из трех минимальных доменов активации VP16. Однако белок Tet On 3G имеет пять аминокислотных различий по сравнению с Tet On Advanced, которые, по-видимому, еще больше повышают его чувствительность к доксициклину. Tet On 3G чувствителен к доксициклину в 100 раз меньшей концентрации и в семь раз активнее оригинального Tet On.

Другие системы

Другие системы, такие как система T REx от Life Technologies, работают иначе. Ген, представляющий интерес, фланкирован вышерасположенным CMV промотором и двумя сайтами TetO2. Экспрессия гена, представляющего интерес, подавляется высокоаффинным связыванием гомодимеров TetR с каждой последовательностью TetO2 в отсутствие тетрациклина. Добавление тетрациклина приводит к связыванию одной молекулы тетрациклина с каждым гомодимером TetR, за которым следует высвобождение сайтов TetO2 гомодимерами TetR. Отсоединение гомодимеров TetR от TetO2 приводит к дерепрессии гена, представляющего интерес. Модифицированной версией T REx является синтетическая биологическая схема Linearizer, оптимизированная для точной настройки экспрессии генов в эукариотических клетках (будущих дрожжах, клетках человека и т.д.). Встраивание сайтов TetO2 в промотор, управляющий экспрессией TetR, создает отрицательную обратную связь, обеспечивающую однородную экспрессию (низкий уровень шума) и линейную зависимость от дозы аналогов тетрациклина.

Элемент ответа на тетрациклин (TRE)

В наиболее часто используемых плазмидах тетрациклиновый элемент ответа состоит из семи повторов 19-нуклеотидной бактериальной последовательности TetO (TCCCTATCAGTGATAGAGA), разделенных спейсерными последовательностями (например: ACGATGTCGAGTTTAC). Последовательность TetO распознается и связывается с TetR-фрагментом Tet On или Tet Off. ТРЭ обычно располагается выше по течению от минимального промотора, который демонстрирует очень низкую базальную экспрессию в отсутствие связанного Tet Off (или Tet On).

Преимущества и недостатки

Система Тет обладает преимуществами перед системами условной экспрессии генов Cre, FRT и ER (эстроген-рецептор). В системах Cre и FRT активация или нокаут гена необратимы после завершения рекомбинации, в то время как в системах Tet и ER они обратимы. Система Тет обеспечивает очень строгий контроль экспрессии, тогда как система ER обладает некоторой утечкой. Однако система Тет, которая зависит от транскрипции и последующего трансляции целевого гена, действует не так быстро, как система ER, которая стабилизирует уже экспрессированный целевой белок при введении гормона. Кроме того, поскольку последовательность tetO длиной 19 пар оснований естественным образом отсутствует в клетках млекопитающих, считается, что плейотропия минимизирована по сравнению с гормональными методами контроля. При использовании системы Тет в клеточных культурах важно убедиться, что каждая партия фетальной бычьей сыворотки проверена на отсутствие или достаточно низкое содержание загрязняющих тетрациклинов, чтобы они не мешали индукции. Механизм антибактериального действия тетрациклинов заключается в нарушении трансляции белка в бактериях, тем самым нарушая способность микробов расти и восстанавливаться; однако трансляция белка также нарушается в митохондриях эукариот, что может приводить к эффектам, искажающим результаты экспериментов.