Катанин: белок, разрушающий микротрубочки и его роль в клеточном делении.

Введение

Катанин — это белок AAA-класса, разрушающий микротрубочки. Он получил своё название в честь японского меча катаны. Катанин представляет собой гетеродимерный белок, впервые обнаруженный у морских ежей. Он содержит субъединицу АТФазы массой 60 кДа, кодируемую геном KATNA1, которая отвечает за разрушение микротрубочек. Для активации этой субъединицы необходимы АТФ и присутствие микротрубочек. Вторая субъединица массой 80 кДа, кодируемая геном KATNB1, регулирует активность АТФазы и обеспечивает локализацию белка в центросомах. Электронная микроскопия показывает, что катанин в активном олигомеризованном состоянии образует кольца диаметром 14–16 нм на стенках микротрубочек (но не вокруг них).

Механизм и регулирование длины микротубулей

Структурный анализ с использованием электронной микроскопии показал, что протофиламенты микротрубочек изменяют свою конфигурацию с прямой на изогнутую при гидролизе ГТФ β-тубулином. Однако, когда эти протофиламенты являются частью полимеризованной микротрубочки, стабилизирующие взаимодействия, создаваемые окружающими субъединицами решетки, фиксируют их в прямой конфигурации, даже после гидролиза ГТФ. Для разрушения этих стабильных взаимодействий катанин, будучи связанным с АТФ, олигомеризуется в кольцевую структуру на стенке микротрубочки. В некоторых случаях олигомеризация повышает аффинность катанина к микротрубочкам и стимулирует его АТФазную активность. После формирования этой структуры катанин гидролизует АТФ и, вероятно, претерпевает конформационное изменение, которое создает механическое напряжение в субъединицах тубулина, дестабилизируя их взаимодействие в решетке микротрубочки. Предполагаемое конформационное изменение также, вероятно, снижает аффинность катанина к тубулину, а также к другим белкам катанина, что приводит к разборке кольцевой структуры катанина и рециркуляции отдельных инактивированных белков. Разделение микротрубочек катанином регулируется защитными микротрубочко-ассоциированными белками (MAP), а субъединица p80 (p60 гораздо эффективнее разделяет микротрубочки в присутствии p80). Эти механизмы оказывают различное влияние в зависимости от места их активации или нарушения в клетке. Например, разрешение катанин-опосредованного разделения в центросоме высвобождает микротрубочки для свободного движения. В одном эксперименте введение антител к катанину в клетку вызвало значительное накопление микротрубочек вокруг центросомы и ингибирование роста микротрубочек. Следовательно, катанин-опосредованное разделение может способствовать поддержанию организации цитоплазмы, стимулируя деполимеризацию микротрубочек и их эффективное перемещение. Во время клеточного деления разделение у полюса веретена приводит к образованию свободных концов микротрубочек и обеспечивает полюсный поток тубулина и усадку микротрубочки. Разделение микротрубочек в цитоплазме облегчает беговую дорожку и подвижность, что важно в процессе развития.

Structural analysis using electron microscopy has revealed that microtubule protofilaments change from a straight to a curved conformation upon GTP hydrolysis of β tubulin. However, when these protofilaments are part of a polymerized microtubule, the stabilizing interactions created by the surrounding lattice lock subunits into a straight conformation, even after GTP hydrolysis. In order to disrupt these stable interactions, katanin, once bound to ATP, oligomerizes into a ring structure on the microtubule wall in some cases oligomerization increases the affinity of katanin for microtubules and stimulates its ATPase activity. Once this structure is formed, katanin hydrolyzes ATP, and likely undergoes a conformational change that puts mechanical strain on the tubulin subunits, which destabilizes their interactions within the microtubule lattice. The predicted conformational change also likely decreases the affinity of katanin for tubulin as well as for other katanin proteins, which leads to disassembly of the katanin ring structure, and recycling of the individual inactivated proteins. The severing of microtubules by katanin is regulated by protective microtubule associated proteins (MAPs), and the p80 subunit (p60 severs microtubules much better in the presence of p80). These mechanisms have different consequences, depending on where in the cell they are activated or disrupted. For example, allowing katanin mediated severing at the centrosome releases microtubules for free movement. In one experiment, anti katanin antibodies were injected into a cell, causing a large accumulation of microtubules around the centrosome and inhibition of microtubule outgrowth. Therefore, katanin mediated severing may serve to maintain organization in the cytoplasm by promoting microtubule disassembly and efficient movement. During cell division, severing at the spindle pole produces free microtubule ends and allows poleward flux of tubulin and retraction of the microtubule. Severing microtubules in the cytoplasm facilitates treadmilling and mobility, which is important during development.

Роль в клеточном делении

Разрыв микротрубочек при участии катанина является важным этапом митоза и мейоза. Показано, что катанин отвечает за разрыв микротрубочек в фазу M у Xenopus laevis. Дезагрегация микротрубочек от их интерфазных структур необходима для подготовки клетки и митотического веретена к делению. Это регулирование осуществляется косвенно: белки MAP, защищающие микротрубочки от разрыва в интерфазе, диссоциируют и позволяют катанину действовать. Кроме того, катанин отвечает за разрыв микротрубочек в митотическом веретене, когда дезагрегация необходима для разделения сестринских хроматид в анафазе. Сообщалось, что Mei 1 и Mei 2 кодируют белки, сходные с p60 и p80 субъединицами катанина. С помощью антител было установлено, что эти два белка локализуются на концах микротрубочек в мейотическом веретене, и при экспрессии в клетках HeLa они инициировали разрыв микротрубочек. Эти данные свидетельствуют о том, что катанин выполняет аналогичную функцию как в митозе, так и в мейозе, обеспечивая сегрегацию хроматид к полюсам веретена.

Роль в развитии

Катанин играет важную роль в развитии многих организмов. Как элиминация, так и сверхэкспрессия катанина оказывают негативное влияние на рост аксонов, поэтому катанин должен тщательно регулироваться для нормального развития нервной системы. В частности, рассечение микротрубочек в определенных клеточных областях позволяет фрагментам исследовать различные пути роста. Катанин оказался необходим для решения этой задачи. Эксперимент с использованием цифровой визуализации флуоресцентно меченого тубулина показал, что ростовые конусы аксонов останавливаются, а микротрубочки фрагментируются в местах ветвления во время развития нервной системы. Аналогичный эксперимент с использованием флуоресцентно меченого тубулина выявил локальную фрагментацию микротрубочек в ламеллиподиях клеток легкого тритона во время эмбриональной миграции, где фрагменты ориентированы перпендикулярно продвигающейся клеточной мембране, способствуя исследованию пространства. Локальный характер обоих событий фрагментации, вероятно, указывает на регуляцию катанином, поскольку он может концентрироваться в определенных клеточных регионах. Это подтверждается исследованием, показавшим, что мутация Fra2, затрагивающая ортолог катанина в Arabidopsis thaliana, приводит к аномальному расположению целлюлозных микрофибрилл вдоль развивающейся клеточной стенки у этих растений. Эта мутация вызвала фенотип с уменьшенным удлинением клеток, что свидетельствует о значимости катанина в развитии широкого спектра организмов.

Функция в нейронах

Известно, что катанин в изобилии присутствует в нервной системе, и даже умеренные его уровни могут вызывать значительное истощение микротрубочек. Однако микротрубочки должны подвергаться разделению во всех других компартментах нейрона, чтобы достаточное количество микротрубочек могло быстро транспортироваться. В нервной системе соотношение двух субъединиц значительно отличается от такового в других органах организма. Поэтому важно уметь регулировать это соотношение для контроля за разделением микротрубочек. Мономер p80 обнаружен во всех компартментах нейрона, что означает, что его функция не может заключаться исключительно в нацеливании на катанин. Катанин p80 имеет несколько доменов с различными функциями. Один домен нацелен на центросому, другой усиливает разделение микротрубочек катанином p60, а последний подавляет разделение микротрубочек. Обилие катанина в нейронах указывает на то, что они могут перемещаться вдоль аксона. Наблюдается разрыв микротрубочек в точках ветвления аксонов и в конусах роста нейронов. Распределение катанина в нейроне помогает понять феномен регулирования длины и количества микротрубочек, а также высвобождения микротрубочек из центросомы. Считается, что регуляция катанина осуществляется посредством фосфорилирования других белков. Изгиб усиливает доступ катанина к решетке, облегчая разделение. Поскольку растительным клеткам не хватает традиционных центросом, катанин накапливается в ядерной оболочке во время препрофазы и профазы, где формируются веретенообразные микротрубочки. Во время удлинения клеток микротрубочки должны постоянно корректировать свою ориентацию, чтобы соответствовать увеличению длины клетки. Предполагается, что это постоянное изменение в организации микротрубочек осуществляется посредством быстрого деполимеризации, полимеризации и транслокации микротрубочек. Недавно было показано, что мутации в растительном гомологе катанина изменяют переходы в организации микротрубочек, что, в свою очередь, приводит к нарушениям правильного отложения целлюлозы и гемицеллюлозы. Предполагается, что это вызвано неспособностью растительной клетки регулировать длину микротрубочек. Гомолога регуляторной субъединицы катанина p80 не существует. Поэтому для изучения его функций в растениях был создан At p60, меченный His-tag. His At p60 способен разделять микротрубочки in vitro в присутствии АТФ. Он непосредственно взаимодействует с микротрубочками в анализах коседиментации. Активность АТФазы стимулировалась негиперболическим образом. Гидролиз АТФ стимулируется при низком соотношении тубулин/At p60 и ингибируется при более высоких соотношениях. Низкие соотношения благоприятствуют взаимодействию субъединиц катанина, в то время как высокие соотношения демонстрируют нарушение. At p60 может олигомеризоваться, как и его аналоги у животных. At p60 взаимодействует непосредственно с микротрубочками, в то время как животный p60 связывается через свои N-концы. N-концевая часть p60 недостаточно консервативна между растительным и животным царствами.

Katanin is known to be abundant in the nervous system and even modest levels of it can cause significant microtubule depletion. But microtubules need to be severed throughout other compartments of the neuron so that sufficient numbers of microtubules can undergo rapid transport. In the nervous system, the ratio of the two subunits is dramatically different from other organs of the body. So it is important to be able to regulate the ratio to control microtubule severing. The monomer p80 is found in all the compartments of the neuron, which means its function cannot be solely to target katanin. The p80 katanin has multiple domains with different functions. One domain targets the centrosome, another augments microtubule severing by the p60 katanin, and the last suppresses microtubule severing. The abundance of katanin in the neurons show they can move along the axon. There is breakage of microtubules at the axonal branch points and in the growth cones of the neurons. The distribution of katanin in the neuron helps understand the phenomenon for regulating microtubule length and number, as well as releasing the microtubules from the centrosome. Katanin is believed to be regulated by the phosphorylation of other proteins. Bending enhances the access of katanin to the lattice, facilitating severing. Because plant cells lack traditional centrosomes, katanin accumulates at the nuclear envelope during pre prophase and prophase, where the spindle microtubules are forming. During cell elongation, microtubules must adjust their orientation constantly to keep up with the increasing cell length. This constant change in microtubule organization was proposed to be performed by the rapid disassembly, assembly, and translocation of microtubules. Recently, mutations in the plant katanin homologue have been shown to alter transitions in microtubule organization, which, in turn, cause impairments in the proper deposition of cellulose and hemicellulose. This is presumed to be caused by the plant cell's lack of ability to regulate microtubule lengths. There is no homologue for the p80 katanin regulatory subunit. Therefore, a His tagged At p60 was made to describe its functions in plants. The His At p60 can sever microtubules in vitro in the presence of ATP. It directly interacts with microtubules in co sedimentation assays. The ATPase activity was stimulated in a non hyperbolic way. ATP hydrolysis is stimulated at a low tubulin/At p60 ratio and inhibited at higher ratios. The low ratios favor the katanin subunit interactions, whereas the high ratios show impairment. The At p60 can oligomerize like the ones in animals. The At p60 interacts directly with microtubules, whereas the animal p60 bind via their N termini. The N terminal part of p60 is not well conserved between the plant and animal kingdoms.