Введение

Молекулярный комплекс

Реплисома – это сложная молекулярная машина, осуществляющая репликацию ДНК. Реплисома сначала раскручивает двухцепочечную ДНК на две одноцепочечные нити. Для каждой из полученных нитей синтезируется новая комплементарная последовательность ДНК. Общий результат – образование двух новых двухцепочечных последовательностей ДНК, являющихся точными копиями исходной двухцепочечной последовательности ДНК. По своей структуре реплисома состоит из двух репликационных полимеразных комплексов, один из которых синтезирует ведущую цепь, а другой – отстающую цепь. Реплисома состоит из множества белков, включая геликазу, RFC, PCNA, гиразу/топоизомеразу, SSB/RPA, примазу, ДНК-полимеразу III, РНКазу H и ДНК-лигазу.

Обзор процесса репликации ДНК прокариотов

Для прокариотов каждый делящийся нуклеоид (область, содержащая генетический материал, не заключенный в ядро) требует двух реплисомов для двунаправленной репликации. Эти два реплисома продолжают репликацию на обеих вилках, расположенных в середине клетки. В конечном итоге, по мере репликации терминального участка, два реплисома отделяются от ДНК. Реплисома остается неподвижной в середине клетки, прикрепленной к мембране, а матричная ДНК протягивается через нее. ДНК поступает через эту неподвижную пару реплисом, расположенных в клеточной мембране.

Обзор процесса репликации ДНК у эукариотов

Для эукариот многочисленные пузыри репликации формируются в точках начала репликации по всей хромосоме. Как и у прокариот, требуются две реплисомы – по одной на каждой репликативной вилке, расположенной на конце пузыря репликации. В связи со значительными различиями в размере хромосом и сопутствующей сложностью высококонденсированных хромосом, различные аспекты процесса репликации ДНК у эукариот, включая заключительные фазы, изучены хуже, чем у прокариот.

Решение проблем репликации ДНК

Многие структурные и химические проблемы, связанные с репликацией ДНК, решаются с помощью высококонсервативного молекулярного аппарата, общего для различных организмов. В этом разделе обсуждается, каким образом факторы реплисомы преодолевают структурные и химические трудности репликации ДНК.

Разделение дуплекса

ДНК представляет собой дуплекс, образованный двумя антипараллельными цепями. Согласно модели Мезельсона и Сталя, процесс репликации ДНК является полуконсервативным, то есть во время репликации исходный дуплекс ДНК разделяется на две дочерние цепи (которые называют матрицами ведущей и отстающей нитей). Каждая дочерняя цепь становится частью нового дуплекса ДНК. Ферменты, известные как геликазами, раскручивают дуплекс.

Геликазы

Геликаза — это фермент, который разрывает водородные связи между основаниями в середине двухцепочечной ДНК. Её структура в форме кольца охватывает ДНК и разделяет цепи перед синтезом ДНК. У эукариот комплекс Mcm2-7 выполняет функцию геликаза, однако не до конца понятно, какие субъединицы необходимы для геликазной активности. Эта геликаза транслоцируется в том же направлении, что и ДНК-полимераза (3'–5' относительно матричной цепи). У прокариот геликазы идентифицированы лучше и включают dnaB, которая перемещается в направлении 5'–3' по цепи, противоположной ДНК-полимеразе.

Размотка суперсмотки и декатендование

Когда геликаза раскручивает двойную спираль, топологические изменения, вызванные вращательным движением геликазы, приводят к образованию сверхзавитков перед геликазой (подобно тому, что происходит при скручивании нити).

Гиразы и топоизомеразы

Гираза (форма топоизомеразы) расслабляет и устраняет суперспирализацию, вызванную геликазой. Она делает это, разрезая цепи ДНК, позволяя им вращаться и высвобождать суперспираль, а затем вновь соединяя цепи. Гираза чаще всего обнаруживается перед вилкой репликации, где и формируются суперспирали.

Примаза

В прокариотах примаза синтезирует РНК-праймер в начале вновь образовавшихся ведущей и отстающей цепей.

ДНК-полимераза альфа

В эукариотах ДНК-полимераза альфа создает РНК-праймер в начале вновь синтезируемых ведущей и отстающей цепей, и, в отличие от примазы, ДНК-полимераза альфа также синтезирует короткую цепочку дезоксинуклеотидов после создания этого праймера.

Обеспечение процессивности и синхронизации

Процессивность относится как к скорости, так и к непрерывности репликации ДНК, а высокая процессивность необходима для своевременной репликации. Высокая процессивность частично обеспечивается кольцеобразными белками, называемыми «зажимами», которые помогают репликативным полимеразам оставаться связанными с ведущей и отстающей цепями. Существуют и другие факторы: с химической точки зрения, белки, связывающие цепи, стимулируют полимеризацию и обеспечивают дополнительную термодинамическую энергию для реакции. С точки зрения системы, структура и химия многих факторов реплисомы (таких как АТФазная активность типа AAA+ отдельных субъединиц загрузки зажима, а также спиральная конформация, которую они принимают), и ассоциации между факторами загрузки зажима и другими вспомогательными факторами также повышают процессивность. Согласно исследованиям Куриана и др., загрузчики зажимов и скользящие зажимы находятся в центре реплисомного механизма благодаря своей роли в привлечении и связывании других факторов, таких как прайминговые ферменты и репликативные полимеразы. Исследования показали, что факторы загрузки и скольжения зажима абсолютно необходимы для репликации, что объясняет высокую степень структурной консервации, наблюдаемую для этих факторов. Эта архитектурная и структурная консервация наблюдается в организмах, столь различных, как бактерии, фаги, дрожжи и люди. Тот факт, что такая значительная степень структурной консервации наблюдается при отсутствии гомологии последовательностей, еще больше подчеркивает важность этих структурных решений для задач репликации.

Загрузчик сцепления

Загрузчик клемм – это общий термин, обозначающий факторы репликации, называемые гамма (у бактерий) или RFC (у эукариот). Сочетание ДНК-матрицы и праймерной РНК называют «ДНК формы А», и считается, что белки, загружающие клемму (геликоидные гетеропентамеры), стремятся ассоциироваться с ДНК формы А из-за ее формы (структуры большой и малой бороздки) и химических свойств (расположения доноров и акцепторов водородных связей). Таким образом, белки загрузки клеммы связываются с праймированной областью цепи, что вызывает гидролиз АТФ и обеспечивает энергию для раскрытия клеммы и ее присоединения к цепи. (Предполагается, что они образуют асимметричный димер с ДНК-полимеразой эпсилон.)

ДНК полимераза I

ДНК-полимераза I — это фермент, который восстанавливает ДНК.

РНК-аза H

РНК-H — это фермент, который удаляет РНК из двухцепочечного комплекса РНК-ДНК.

Стресс репликации

Стресс репликации может приводить к остановке репликационной вилки. Один из видов репликативного стресса возникает из-за повреждений ДНК, таких как межцепочечные сшивки (ICL). ICL может блокировать продвижение репликационной вилки из-за невозможности разделения цепей ДНК. В клетках позвоночных репликация хроматидного шаблона, содержащего ICL, вызывает привлечение более 90 факторов репарации ДНК и поддержания генома. Эти факторы включают белки, осуществляющие последовательные надрезы и гомологичную рекомбинацию.

История

Кэтрин Лемон и Алан Гроссман показали на примере Bacillus subtilis, что реплисомы не перемещаются вдоль ДНК подобно поездам по рельсам, а ДНК фактически подается через неподвижную пару реплисомов, расположенных на клеточной мембране. В их эксперименте реплисомы B. subtilis были помечены зеленым флуоресцентным белком, а за местоположением комплекса наблюдали в реплицирующихся клетках с помощью флуоресцентной микроскопии. Если бы реплисомы двигались как поезд по рельсам, белок GFP, связанный с полимеразой, обнаруживался бы в разных позициях в каждой клетке. Однако вместо этого в каждой реплицирующейся клетке реплисомы наблюдались как отдельные флуоресцентные фокусы, расположенные в середине клетки или вблизи нее. Клеточная ДНК, окрашенная синим флуоресцентным красителем (DAPI), отчетливо занимала большую часть цитоплазматического пространства.