Перлекан: структура, функции и роль в внеклеточном матриксе.

Введение

Перлекан (PLC), также известный как основной белок гепарансульфат протеогликана (HSPG) или гепарансульфат протеогликан 2 (HSPG2), — это белок, кодируемый геном HSPG2 у человека. Ген HSPG2 кодирует белок, состоящий из 4391 аминокислоты, с молекулярной массой 468 829. Это один из самых крупных известных белков. Название «перлекан» происходит от его внешнего вида в виде «жемчужной нити» на изображениях, полученных методом ротационной тени. Перлекан был впервые выделен из линии опухолевых клеток и показано, что он присутствует во всех нативных базальных мембранах. Перлекан представляет собой крупный мультидоменный белок (пять доменов, обозначенных I–V). Перлекан синтезируется как сосудистыми эндотелиальными, так и гладкомышечными клетками и откладывается во внеклеточном матриксе парагозоанов. Перлекан высоко консервативен у различных видов, и имеющиеся данные указывают на то, что он эволюционировал от древних предков путем дупликации генов и перетасовки экзонов. Хотя цепи HS не требуются для правильной укладки и секреции белка, отсутствие HS или снижение сульфатации может снизить способность перлекана взаимодействовать с белками матрицы. Удаление цепей HS может повлиять на организацию матрицы и функцию эндотелиального барьера. Домен II состоит из четырех повторов, гомологичных лигандосвязывающей части рецептора ЛПНП, с шестью консервативными остатками цистеина и пентапептидом DGSDE, который опосредует связывание лигандов рецептором ЛПНП. Домен III имеет гомологию с доменами IVa и IVb ламинина. Домен IV состоит из серии IG-модулей. Структура только 3-го иммуноглобулиноподобного (IG) повтора в домене IV показана на рисунке с надписью «HSPG2». C-концевой домен V, гомологичный домену G длинного плеча ламинина, отвечает за самосборку и может быть важен для формирования базальной мембраны in vivo. Домен V также содержит участки присоединения цепей HS/CS. Таким образом, основной белок перлекана и цепи HS могут модулировать сборку матрицы, пролиферацию клеток, связывание липопротеинов и клеточную адгезию.

Функция

Перлекан является ключевым компонентом внеклеточного матрикса хряща и взаимодействует с FGF 18 через домен III его основного белка, опосредуя их действие на рецепторы FGF. Перлекан, вероятно, играет критическую роль в секвестрации и/или доставке FGF 2 и FGF 18 во время эндохондрального окостенения. Перлекан также является ключевым компонентом сосудистого внеклеточного матрикса, где он взаимодействует с различными другими компонентами матрикса и способствует поддержанию функции эндотелиального барьера. Перлекан является мощным ингибитором пролиферации клеток гладкой мускулатуры и, таким образом, предположительно помогает поддерживать сосудистый гомеостаз. Перлекан также может усиливать активность факторов роста (например, FGF2) и, следовательно, стимулировать рост и регенерацию эндотелия.

Модификация цепей гликозаминогликанов

Модификации гепарансульфатных цепей в C- и N-концевых доменах являются наиболее изученными различиями в секреторном пути перлекана. Хондроитинсульфат может замещать гепарансульфат, а степень сульфатации или сахаросостав цепей может изменяться. Потеря ферментов, участвующих в пути синтеза гепарансульфата, приводит к ряду заболеваний. Дифференциальная модификация гепарансульфатных цепей может происходить под воздействием различных регуляторных сигналов. Перлекан в пластинке роста длинных костей мыши демонстрирует изменения гликозилирования в процессе дифференцировки хондроцитов от зоны покоя к зоне пролиферации. Хотя изначально считалось, что цепи гликозаминогликанов (GAG) перлекана состоят исключительно из гепарансульфата, это согласуется с предыдущими данными, показывающими, что к бычьему перлекану, продуцируемому хондроцитами, присоединены цепи GAG хондроитинсульфата, а рекомбинантный белок человеческого домена I при экспрессии в клетках яичника китайского хомяка гликозилируется как гепарансульфатными, так и хондроитинсульфатными цепями. Предпочтительное присоединение гепарансульфатных или хондроитинсульфатных цепей к доменам I и V может влиять на дифференцировку мезенхимальных тканей в хрящ, кость или другие ткани, однако регуляторные механизмы переключения от присоединения гепарансульфата к хондроитинсульфату изучены недостаточно. При изучении влияния состава протеогликанов на пермселективность при нефрите было отмечено, что обработка пуромицином человеческих гломерулярных эндотелиальных клеток (HGEC) изменяет уровень сульфатации цепей GAG в протеогликанах, таких как перлекан, что, в свою очередь, приводит к снижению стабильности этих цепей. Уровень мРНК основных белков протеогликанов не изменяется, следовательно, снижение количества цепей GAG обусловлено другим фактором, который в данном случае оказался снижением экспрессии ферментов сульфаттрансфераз, играющих ключевую роль в биосинтезе GAG. Похоже, что существует определенное пересечение в заболеваниях, возникающих в результате потери экспрессии гепарансульфатных протеогликанов и потери ферментов, участвующих в биосинтезе гепарансульфата.

Modifications of the heparan sulfate chains on C and N terminal domains are the best studied differences in the secretory pathway of perlecan. Chondroitin sulfate can be substituted for heparan sulfate, and sulfate incorporation or the sugar composition of the chains can change. Loss of enzymes involved in the heparan sulfate synthetic pathway lead to a number of conditions. Differential heparan sulfate chain modification can occur through a number of regulatory signals. Perlecan in the growth plate of mouse long bones shows glycosylation changes in the chondrocyte progression from the resting zone to the proliferating zone. Although initially the glycosaminoglycan (GAG) chains of perlecan were thought to be exclusively heparan sulfate, This was in agreement with previous data showing chondroitin sulfate GAG chains attached to bovine perlecan produced by chondrocytes and that recombinant human domain I protein was glycosylated with both heparan and chondroitin sulfate chains when expressed in Chinese Hamster Ovary cells. The preferential addition of heparan sulfate or chondroitin sulfate chains to domains I and V could have an effect on the differentiation of mesenchymal tissues into cartilage, bone or any number of tissues, but the regulatory mechanism of changing from heparan sulfate to chondroitin sulfate addition are not well understood. While studying the effect of proteoglycan composition on nephritic permselectivity, it was noted that puromycin treatment of human glomerular endothelial cells (HGEC) altered the sulfation level of GAG chains on proteoglycans such as perlecan, which in turn caused a decrease in the stability of the GAG chains. The core protein mRNA levels of proteoglycans were not affected, thus the decrease in GAG chains was as a result of some other factor, which in this case turned out to be a decrease in expression of sulfate transferase enzymes, which play a key role in GAG biosynthesis. It seems that there may be some overlap in diseases stemming from loss of heparan sulfate proteoglycan expression and loss of enzymes involved in heparan sulfate biosynthesis.

Деградация

Клетки могут модифицировать свою внеклеточную матрицу и базальные мембраны в ответ на сигналы или стресс. Специфические протеазы действуют на белки во внеклеточном окружении, когда у клеток появляется необходимость в перемещении или изменении своего окружения. Катепсин S – это цистеиновая протеаза, которая умеренно ослабляет связывание FGF-положительных клеток с перлекан-положительным субстратом. Катепсин S является потенциальной протеазой, воздействующей на основной белок перлекана в базальной мембране или строме. Гепарансульфатные цепи перлекана связывают факторы роста в внеклеточном матриксе и служат ко-лигандами или усилителями лигандов при связывании с рецепторами. Другое исследование показало, что высвобождение основного FGF, связанного с гепарансульфатом, в культуре можно достичь обработкой стромелизином, гепаритиназой I, коллагеназой крысы и плазмином, а эти участки протеолиза изображены на рисунке 1. Это было предложено как неполный список протеаз, способных опосредовать высвобождение факторов роста из гепарансульфатных цепей перлекана. Хотя Уайтлок и соавторы предположили, что в основном белке перлекана существуют консенсус-последовательности для расщепления тромбином, они также полагают, что любая активация перлекана тромбином на самом деле происходит из-за расщепления других компонентов внеклеточного матрикса. В данной статье утверждается, что гепараназа отвечает за расщепление гепарансульфатных цепей перлекана в матриксе. Это высвобождает факторы роста, связанные с гепарансульфатом, в частности FGF 10. Добавление гепараназы к клеточной культуре эпителия в базальной мембране привело к увеличению пролиферации эпителиальных клеток из-за высвобождения FGF 10. В модели роста экспланта in vitro с использованием эпителия роговицы экспрессия металлопротеиназы 2 (MMP2) коррелирует с начальной деградацией исходной базальной мембраны. Реформация базальной мембраны в культуре зависела от первоначальной индукции, за которой следовало подавление экспрессии MMP9, в отличие от постоянной экспрессии MMP2. Это не является доказательством того, что MMP2 и MMP9 непосредственно расщепляют белок перлекана in vivo, но показывает, что эти белки явно модулируют какой-то фактор созревания базальной мембраны. Другое семейство металлопротеаз, семейство белков костного морфогенеза 1/Tolloid-подобных, высвобождает C-концевой эндорепеллиновый домен основного белка перлекана. Ламининоподобный глобулярный домен содержит активный мотив эндорепеллина и не может быть расщеплен клетками, экспрессирующими мутантные и неактивные формы белков BMP1. Кроме того, критический остаток, необходимый для этого расщепления, был локализован в Asp4197. Этот протеолитический процесс может иметь значение при заболеваниях, поскольку соответствующий фрагмент был обнаружен в моче пациентов, страдающих терминальной стадией почечной недостаточности, и в амниотической жидкости беременных женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек.

Cells can modify their extracellular matrix and basement membranes in response to signals or stress. Specific proteases act on the protein in the extracellular environment when cells have a reason to move or change their surroundings. Cathepsin S is a cysteine protease that moderately attenuates binding of FGF positive cells to a perlecan positive substrate. Cathepsin S is a potential protease that acts on the core protein of perlecan in the basement membrane or stroma. The heparan sulfate chains of perlecan bind growth factors in the ECM, and serve as co ligands or ligand enhancers when bound to receptors. Another study showed that release of HS bound basic FGF in culture could be achieved through treatment with stromelysin, heparitinase I, rat collagenase and plasmin, and these proteolysis sites are illustrated in figure 1. This was proposed as a non exhaustive list of the proteases that could mediate release of growth factors from the heparan sulfate chains of perlecan. Although Whitelock et al. suggested that thrombin cleavage consensus sequences exist in the core protein of perlecan, they also postulate that any thrombin activation of perlecan actually comes from cleavage of other ECM constituents. This article states that heparanase is responsible for cleavage of the heparan sulfate chains of perlecan in matrix. This releases growth factors bound to the heparan sulfate, specifically FGF 10. Addition of heparanase to cell culture of epithelia in basement membrane caused an increase in epithelial cell proliferation due to FGF 10 release. In a model of explant growth in vitro using corneal epithelium, Matrix Metalloproteinase (MMP) 2 expression correlates with an initial degradation of the original basement membrane. Reformation of basement membrane in culture was dependent on an initial upregulation followed by a downregulation of MMP 9, in contrast to the constant expression of MMP 2. This is not evidence that MMP 2 and MMP 9 directly cleave perlecan protein in vivo but shows that the proteins clearly modulate some factor in maturation of basement membrane. Another family of metalloproteases, the Bone Morphogenetic Protein 1/Tolloid like family, releases the c terminal endorepellin domain of the perlecan core protein. The laminin like globular domain contains the active motif of endorepellin, and is unable to be cleaved by cells expressing mutant and inactive forms of the BMP 1 proteins. Furthermore, the critical residue necessary for this cleavage to take place was localized to Asp4197. This proteolytic process may have significance in disease as a corresponding fragment was found in the urine of patients suffering end stage renal failure and in the amniotic fluid of pregnant women who have undergone premature rupture of the membrane.

Выражение во время развития

Время экспрессии генов в ходе развития варьируется в зависимости от ткани. Базальные мембраны часто являются определяющим фактором, разделяющим эпителий от стромы и соединительной ткани. Перлекан играет особенно важную роль в развитии сердечно-сосудистой, нервной и хрящевой систем. Развитие бластоцисты до имплантации представляет собой контролируемый каскад регуляции генов и межклеточной сигнализации. Внеклеточный перлекан обнаруживается на стадии бластоцисты эмбрионального развития мыши, с выраженным повышением экспрессии в момент, когда эмбрион достигает "компетентности к прикреплению". Этот результат был подтвержден как на уровне мРНК, так и на уровне белка, что было показано с помощью RT-ПЦР и иммуногистохимии. Позднее эмбриональное развитие регулируется столь же точно, как и развитие до имплантации, но более сложно из-за дифференцировки всех тканей. Первое исследование экспрессии перлекана в ходе эмбрионального развития показало, что белок впервые экспрессируется в процессе развития сердечно-сосудистой системы, а затем коррелирует с созреванием большинства тканей организма, то есть с отделением эпителиальных слоев от эндотелия и стромы базальными мембранами. Опять же, это повышение регуляции в ходе развития сердечно-сосудистой системы совпадает с ролью C-концевого домена перлекана в качестве эндорепеллина. Пространственно-временная специфичность транс-активации гена перлекана в ходе развития имеет ключевое значение для созревания базальных мембран и, следовательно, для полного разделения эпителия от эндотелия и стромы. Тщательное исследование экспрессии перлекана в ходе развития эмбриона курицы показало, что перлекан присутствует на стадии морулы и на протяжении всего последующего развития, хотя экспрессия может быть временной и точно синхронизирована в определенных предшественниках тканей. У эмбрионов крысы было показано, что экспрессия перлекана увеличивается в клетках гладкой мускулатуры сосудов (КГМС) после 19-го дня внутриутробного развития. Это прекрасно коррелирует с прекращением пролиферации КГМС на 18-м дне и изменением их фенотипа. Теория, предложенная в этом исследовании, заключается в том, что перлекан играет антипролиферативную роль для КГМС после достижения определенной точки развития, подобно экспрессии перлекана, зависящей от конфлюентности, в культуре клеток. Эти результаты были подтверждены аналогичными результатами исследований легочной артерии и эпителия легких крыс. В этих тканях также было обнаружено, что продукция перлекана начинается после прекращения деления клеток, примерно на 19-й день внутриутробного развития. Развитие нервной системы и рост аксонов точно направляются сигналами из молекул внеклеточного матрикса. Рост обонятельных нейритов в ходе развития мыши, по крайней мере частично, направляется внеклеточным матриксом, синтезируемым обонятельными эпителиальными клетками (ОЭК). Перлекан и ламинин 1, по-видимому, играют важную роль в этом пути наведения, хотя индукция перлекана происходит немного позже, чем индукция ламинина 1. Эти данные подтверждаются более ранними данными, показывающими, что ОЭК экспрессируют FGF 1 в ходе развития обоняния, и что перлекан может стимулировать рост обонятельных сенсорных нейритов в культуре в присутствии FGF 1. В предыдущем исследовании также было показано, что перлекан обладает нервно-адгезивными свойствами, что позволяет предположить, что он может играть привлекательную роль в сочетании с ламинином, а не отталкивающую. Развитие хрящей и костей оказалось зависимым от экспрессии перлекана. Учитывая данные о том, что мыши с дефицитом гена *pln* не могут поддерживать стабильный хрящ, очевидно, что перлекан необходим для созревания и стабильности хрящевой ткани. Это подтверждается исследованием, показывающим, что подавление экспрессии перлекана ингибирует заключительные стадии хондрогенной дифференцировки в фибробластах C3H10T1/2 в культуре. Развитие костной ткани, то есть минерализация хрящевой ткани, коррелирует с потерей перлекана и гепарансульфата в хондрооссальном соединении (ХОС). Для понимания того, как гепарансульфат и перлекан направляют мезенхимальные стволовые клетки по остеогенному пути, мезенхимальные стволовые клетки человека обрабатывались гепараназой и хондроитиназой в культуре. Это привело к увеличению минерализации и экспрессии маркеров остеоцитов, что подтверждает данные о том, что потеря гепарансульфата в ХОС является ключевым фактором остеогенеза. Считается, что движущей силой активации остеогенеза гепараназой и хондроитиназой является высвобождение костного морфогенетического белка, связанного с цепями гепарансульфата.

Timing of gene expression during development varies from tissue to tissue. Basement membranes are often the driving force behind separating epithelia from stroma and connective tissue. Perlecan is of particular importance in cardiovascular, neural and cartilaginous development. Pre implantation blastocyst development is a controlled cascade of gene regulation and intercellular signaling. Extracellular perlecan has been observed at the blastocyst stage of mouse embryonic development, specifically upregulated at the point when the embryo reaches “attachment competence”. This finding was upheld at both the mRNA level and the protein level, shown by RT PCR and immunostaining. Later embryonic development is just as precisely regulated as pre implantation development, and is more complicated due to differentiation of all tissues. The first study of perlecan expression during embryonal development found that the protein was first expressed during development of the cardiovascular system, and later correlates with maturation of the majority of tissues in the body, i. e. separation of epithelial layers from endothelia and stroma by basement membranes. Again, this upregulation during cardiovascular development is concomitant with the role of perlecan's C terminus as endorepellin. Spatio temporal specificity in trans activation of the perlecan gene during development is key to the maturation of basement membranes and thus to the complete separation of epithelia from endothelia and stroma. A thorough study of perlecan expression during chick embryo development has shown that perlecan is present at the morula stage and for the rest of development, although expression can be transient and precisely timed in certain tissue predecessors. In the rat embryo, perlecan expression has been shown to increase in vascular smooth muscle cells (VSMCs) post e19 in fetal development. This correlates perfectly with the ceasing of proliferation of VSMCs at e18 and a change in their phenotype. The theory put forward in this study is that perlecan plays an anti proliferative role for VSMCs once a certain developmental point is reached, much like confluence dependent expression of perlecan in culture. These findings were corroborated by similar results from studies of rat pulmonary artery and lung epithelia. These tissues also were found to begin perlecan production once cell division had ceased, around fetal day 19. The development of the nervous system and extension of axons is precisely directed by cues from extracellular matrix molecules. Olfactory neurite outgrowth in mouse development is guided at least in part by an ECM laid down by olfactory epithelial cells (OECs). Perlecan and laminin 1 appear to be important in this guidance pathway, although perlecan induction occurs slightly later than laminin 1. This data is supported by earlier data showing that OECs express FGF 1 during olfactory development, and that perlecan can stimulate olfactory sensory neurite outgrowth in culture in the presence of FGF 1. Perlecan also showed nerve adhesive properties in a previous study, further suggesting that it may act in an attractive role in combination with laminin rather than a repulsive one. Cartilage and bone development have proven to be dependent upon perlecan expression. Taken with the data, that mice lacking the pln gene cannot maintain stable cartilage, it is apparent that perlecan is essential to the maturation and stability of cartilaginous structure. This is supported by a study showing that knockdown of perlecan production inhibits the final stages of chondrogenic differentiation in C3H10T1/2 fibroblasts in culture. Bone development, i. e. mineralization of cartilaginous tissue, correlates with loss of perlecan and heparan sulfate at the chondro osseous junction (COJ). In an effort to understand how heparan sulfate and perlecan direct mesenchymal stem cells into the osteogenic pathway, human mesenchymal stem cells were treated with heparanase and chondroitinase in culture. This led to increased mineralization and expression of osteocyte markers, supporting the data showing that loss of heparan sulfate at the COJ is a key factor in osteogenesis. It is thought that the driving force behind heparanase and chondroitinase activation of osteogenesis is release of bone morphogenetic protein bound in the heparan sulfate chains.

Животные модели

Устранение перлекана в эмбрионах рыб-зебр было достигнуто с помощью морфолиносов, нацеленных на транскрипт перлекана. Морфолины использовались для блокирования трансляции мРНК перлекана в эмбрионах рыб-зебр в рамках исследования функции перлекана в скелетном и сосудистом развитии. Морфолино нацелен на 5'-нетранслируемую область мРНК перлекана, тем самым блокируя трансляцию. Потеря белка перлекана у этих рыб привела к серьезным миопатиям и проблемам с кровообращением. Как показано в более позднем исследовании той же лаборатории, этот фенотип можно было скорректировать путем добавления экзогенного VEGF A. Важность перлекана для развития млекопитающих демонстрируют эксперименты по нокауту гена перлекана. Другие особи умирают вскоре после рождения с серьезными дефектами, такими как аномальное формирование базальной мембраны, дефектное развитие головных и длинных костей, а также ахондроплазия. Стратегия нокаута, использованная для одного из нокаутов по перлекану, заключалась в инактивации рецептора факторов роста фибробластов. В другой нокаутной модели мыши ген перлекана был мутирован посредством гомологической рекомбинации эндогенного гена перлекана с конструкцией, содержащей 2 и 5 кб гомологичных фрагментов, окружающих удаленный экзон 3, поскольку, помимо единственного сайта присоединения гепарансульфата, сохранившегося в домене I, отсутствует сайт присоединения в домене V. Однако, в отличие от мышей с полным нокаутом перлекана, жизнеспособность и рост длинных костей у мышей с нокаутом экзона 3 были нормальными. Это указывает на то, что у мышей с нокаутом экзона 3 оставшиеся сайты присоединения гепарансульфата в доменах I и V доступны для связывания FGF 2. Мыши с нокаутом экзона 3 также показали снижение способности к заживлению ран и ангиогенезу при повреждении эпидермиса или добавлении FGF 2 в роговицу. В исследовании повреждения эпидермиса у мышей с нокаутом экзона 3 и контрольных мышей была создана рана, охватывающая всю толщину эпидермиса, и у мышей с нокаутом ангиогенез и признаки заживления ран развивались медленнее, возможно, из-за снижения секвестрации фактора роста отрицательно заряженным гепарансульфатом перлекана. Аналогичный результат был получен в анализе микрокарманов роговицы, где FGF 2 имплантируется в роговицу мышей, и в нормальных мышах индуцируется ангиогенез. У мышей с нокаутом этот ангиогенный эффект был ослаблен, хотя и не полностью. Для создания трансгенной мыши с перлеканом был использован полноразмерный конструкт перлекана под контролем промотора коллагена II типа. Промотор коллагена II типа обеспечивал экспрессию перлекана только во внеклеточном матриксе, продуцируемом хондроцитами, но не в базальных мембранах, продуцируемых эндотелиальными, эпителиальными или мышечными клетками. Трансген перлекана у мыши с полным нокаутом перлекана устранил летальность и восстановил нормальный рост длинных костей. Это говорит о том, что перлекан играет важную роль в развитии хряща. Однако у трансгенных мышей с перлеканом наблюдалась гипертрофия мышц, что указывает на роль перлекана в развитии мышц, а также в росте хрящевой пластинки, опосредованном ростом длинных костей. Исследования на мышах с нокаутом гена и при заболеваниях человека также выявили важную in vivo роль перлекана в развитии хряща и активности нейромышечного синапса.

Perlecan knockdown in embryonic zebrafish has been achieved through the use of Morpholinos targeted to the perlecan transcript. Morpholinos were used to block translation of the perlecan mRNA in zebrafish embryos, as part of an investigation into perlecan function in skeletal and vascular development. The Morpholino targets the five prime untranslated region of the perlecan mRNA thus blocking translation of the message. Loss of the perlecan protein in these fish led to serious myopathies and circulation problems. As shown in a later study from the same laboratory, this phenotype could be rescued through the addition of exogenous VEGF A. The importance of perlecan to mammalian development is demonstrated by perlecan gene knockout experiments. Others die just after birth with severe defects such as abnormal basement membrane formation, defective cephalic and long bone development and achondroplasia. The knockout strategy employed for one of the perlecan knockouts a receptor for fibroblast growth factors. In yet another mouse knockout model, the perlecan gene was mutated by homologous recombination of the endogenous perlecan gene with a construct containing 2 and 5 kb arms of homology surrounding a deleted exon 3, because, in addition to the one heparan sulfate attachment site remaining on domain I, the attachment site on domain V Unlike the perlecan knockout mice however, viability and long bone growth in the exon 3 knockout mice was normal. This suggests that, in the exon 3 knockout, the remaining attachment sites for heparan sulfate on domains I and V available for FGF 2 binding Exon 3 knockout mice also showed decreased wound healing and angiogenesis capabilities when challenged by either epidermal injury or FGF 2 addition to the cornea. In the epidermal injury study, a wound spanning the depth of the epidermis was created in exon 3 negative mice and control mice, and in the knockout mice angiogenesis and the hallmarks of wound healing were slow to develop possibly due to decreased growth factor sequestration by the heparan sulfate negative perlecan. A similar result was produced in the corneal micropocket assay, where FGF 2 is implanted into the cornea of mice and in normal mice angiogenesis is induced. In the knockout mice this angiogenic effect was impaired, although not completely. A full length perlecan construct, under control of the collagen type II promoter, was used to make a perlecan transgenic mouse. The collagen type II promoter allowed perlecan expression in the extracellular matrix made by chondrocytes only but not in the basement membranes made by endothelial, epithelial or muscle cells. The perlecan transgene in the perlecan null mouse eliminated lethality and restored long bone growth to normal. This suggests that perlecan plays a critical role in cartilage development. The perlecan transgenic mice, however, exhibited muscle hypertrophy, indicating a role for perlecan in muscle development as well as in cartilage growth plate mediated long bone growth. Studies from gene knockout mice and human diseases have also revealed critical in vivo roles for perlecan in cartilage development and neuromuscular junction activity.

Сигнальные пути и их влияние на выражение

Сигнальные пути функционируют, повышая или понижая уровень транскрипции генов, что, в свою очередь, приводит к изменению профиля экспрессии генов в клетках. Конечный эффект сигнальных путей реализуется на промоторе генов, который может включать элементы, расположенные выше или ниже точки начала транскрипции, некоторые из которых могут находиться даже внутри транскрибируемого гена. На экспрессию перлекана могут влиять различные сигнальные молекулы, в том числе семейства трансформирующего фактора роста бета (TGF β), интерлейкинов (IL) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

Транскрипционная активация

Вверх по течению 2,5 килобазы в области промотора перлекана изучались с помощью CAT-активации в клеточных линиях различного гистологического происхождения. Это исследование показало наличие в промоторе элемента, чувствительного к TGF β, расположенного всего в 285 парах оснований выше участка начала транскрипции. Этот результат был подтвержден в таких тканях, как клетки карциномы толстой кишки человека и эпителий матки мыши, путем добавления цитокина в среду клеточной культуры in vitro. Исследования in vitro передачи сигналов TGF β1 и его влияния на экспрессию перлекана могут давать различные результаты в разных типах клеток. В культивируемых клетках гладкой мускулатуры коронарных артерий сигнализация TGF β1 не оказывала влияния на экспрессию перлекана, хотя и усиливала регуляцию других компонентов внеклеточного матрикса. Демонстрация динамической регуляции перлекана и его контроля посредством внеклеточных сигнальных путей in vivo имеет решающее значение для понимания роли белка в развитии. С этой целью была создана линия трансгенных мышей, экспрессирующая свиной TGF β1 под контролем линзоспецифичного промотора αA-кристаллина. Обработка фибробластов десен человека в культуре IL-4 привела к увеличению продукции различных гепарансульфатных протеогликанов, включая перлекан. Обработка фибробластов легких человека in vitro IL-1β не привела к значительному увеличению продукции перлекана. Другой сигнальный путь, способствующий увеличению транскрипции PLN, – это путь VEGF. Обработка VEGF165 микрососудистых эндотелиальных клеток мозга человека в культуре стимулирует увеличение транскрипции PLN. Эта молекула является лигандом рецептора VEGF 2 (VGFR2), и, по-видимому, этот ответ на VEGF165 специфичен для повышения регуляции перлекана, что приводит к положительной обратной связи, включающей фактор роста фибробластов (FGF), рецептор FGF (FGFR) и VEGFR2 в ответ на повреждение эндотелия. Это микрососудисто-специфическая регуляция VEGF165 позволяет предположить, что антикоагулянтная функция перлекана является частью процесса контроля повреждения эндотелия мозга. Сигнализация протеинкиназы C предположительно отвечает за повышение регуляции транскрипции и трансляции определенных протеогликанов, включая перлекан. Когда эндоцитарный путь клеток HeLa ингибируется сверхэкспрессией мутантного динамина, протеинкиназа C активируется, и впоследствии увеличивается уровень мРНК и белка перлекана. Напротив, обычное подавление экспрессии перлекана в ответ на гипергликемию теряется у мышей с дефицитом PKC α.

The upstream 2.5 kilobases of the perlecan promoter region were studied by CAT activation in cell lines of various histological origins. This study concluded that there existed a TGF β responsive element in the promoter just 285 base pairs upstream of the transcriptional start site. This result has been corroborated in such tissues as human colon carcinoma cells. and murine uterine epithelium by in vitro addition of the cytokine to cell culture medium. In vitro studies of TGF β1 signaling and its effects on perlecan expression can have varying results in different cell types. In human coronary smooth muscle cells in culture, TGF β1 signaling showed no effect on perlecan expression although it did upregulate other matrix constituents. In vivo demonstration of the dynamic regulation of perlecan and its control by extracellular signaling pathways is critical to our understanding of the protein's role in development. To this end, a transgenic mouse line was created expressing porcine TGF β1 under the lens specific αA crystallin promoter IL 4 treatment of human gingival fibroblasts in culture led to increased production of various heparan sulfate proteoglycans including perlecan. Treatment of human lung fibroblasts in vitro with IL 1 beta did not lead to any significant increase in perlecan production. Another signaling pathway shown to augment pln transcription is the VEGF pathway. VEGF165 treatment of human brain microvascular endothelial cells in culture stimulates increased pln transcription. This molecule is a ligand of VEGF Receptor 2 (VGFR2), and it seems that this VEGF165 response is specific for perlecan upregulation, leading to a positive feedback loop involving fibroblastic growth factor (FGF), FGF Receptor (FGFR) and VEGFR2 in response to endothelial damage. This microvascular specific regulation by VEGF165 raises the possibility that the anti coagulant function of perlecan is a part of the damage control process in brain endothelia. Protein Kinase C signaling is putatively responsible for upregulating transcription and translation of certain proteoglycans including perlecan. When the endocytic pathway of HeLa cells is inhibited by overexpression of a mutant dynamin, Protein Kinase C is activated and perlecan message and protein are subsequently increased. In contrast, the usual downregulation of perlecan in response to hyperglycemia is lost in mice negative for PKC α.

Транскрипционная понижающая регуляция

Сигнализация интерфероном γ опосредует транскрипционную репрессию гена перлекана. Это было впервые показано в клеточных линиях рака толстой кишки, а затем и в клеточных линиях тканей другого происхождения, но в каждом случае для реализации сигнала требовался неповрежденный транскрипционный фактор STAT1. Это заставило исследователей предположить, что транскрипционный фактор STAT1 взаимодействует с промотором Pln в дистальной области, расположенной на расстоянии 660 пар оснований выше точки начала транскрипции. Вероятно, потеря экспрессии перлекана обусловлена снижением транскрипции посредством активности транскрипционного фактора STAT1, как было показано ранее. Эти результаты, полученные in vitro, не обязательно отражают нормальные физиологические концентрации интерферона γ, и цитокин обычно не экспрессируется повсеместно, а лишь в очень специфические моменты развития. Важно отметить, что экспрессия перлекана может быть снижена при обработке экзогенным цитокином, таким как интерферон γ, и физиологически аномальное повышение экспрессии цитокина могло бы препятствовать имплантации.

Стрессоры клеток и их влияние на экспрессию

Механические и химические воздействия могут повреждать базальные мембраны или клетки, которые они поддерживают. Это может повлиять на профиль экспрессии генов клеток, особенно в их внеклеточном матриксе, который часто обеспечивает физическую поддержку и химический барьер для клеток. Гипоксия, воспаление, механические и химические воздействия изучались в связи с экспрессией перлекана. Гипоксия – это состояние, встречающееся при заболеваниях и травмах, и часто приводит к снижению пролиферации эндотелиальных клеток. Это, а также роль перлекана как эндорепеллина, послужили причиной изучения природы регуляции экспрессии перлекана эндотелиальными клетками в условиях гипоксии. В условиях гипоксии экспрессия перлекана в микрососудистых эндотелиальных клетках сердца крысы снизилась на шестьдесят один процент по сравнению с нормальным контролем. В данной работе утверждается, что снижение экспрессии перлекана приводит к потере активации FAK и, следовательно, к уменьшению ERK-сигнализации, что ведет к снижению пролиферации клеток. Кажется нелогичным, что эндотелиальные клетки будут пролиферировать медленнее из-за потери перлекана и его эндорепеллинового субъединицы. Возможно, эти эндотелиальные клетки просто снизили транскрипцию многих генов в ответ на гипоксические условия. В другом исследовании гипоксия привела к индукции генов, связанных с апоптозом и гибелью клеток, но подавление генов не ограничивалось белками, связанными с определенным сигнальным путем. При воздействии на клетки эпителия кишечника T84 гипоксических условий в течение 24 часов наблюдается значительное увеличение продукции перлекан-мРНК и белка. Это связывают с тем, что многие гены, экспрессия которых повышается в ответ на гипоксию, содержат элемент ответа на цАМФ (CRE) в своем промоторе, как и pln. Эта разница между эндотелиальными клетками, исследованными в исследовании 2007 года, и эпителиальными клетками, изученными в этих экспериментах, указывает на то, насколько разнообразны механизмы регуляции перлекана в различных типах клеток. Развитие бета-амилоидных бляшек в мозге связано с началом болезни Альцгеймера. Эти бляшки индуцируют постоянное состояние воспаления в областях накопления, что приводит к экспрессии определенных генов, связанных с воспалением, некоторые из которых поддерживают воспаление в контексте мозга. Как упоминалось ранее, для изучения влияния воспаления мозга на уровни экспрессии перлекана, в мозге мышей создавались проколы иглой, а после воспаления и различных периодов восстановления уровни мРНК и белка оценивались с помощью in situ гибридизации и иммуноокрашивания. Уровни перлекана были повышены в гиппокампе, но не в стриатуме в период заживления, наряду с экспрессией IL-1α. На уровне организма механическое напряжение оказывает глубокое влияние на целостность внеклеточного матрикса и, вероятно, вызывает индукцию ряда генов ЭКМ для восстановления и ремоделирования ЭКМ в строме ткани и базальных мембранах. В одном исследовании изучались in vitro эффекты давления на глобальную транскрипцию генов с использованием микромассива и системы растяжения клеток, предназначенной для имитации внутриглазного давления в ламини крибозы (соединительной ткани) головки зрительного нерва. Было обнаружено, что перлекан и несколько других протеогликанов повышались в ответ на растягивающий стимул. Также индуцировались TGF β2 и VEGF, что, возможно, способствовало повышению регуляции транскрипта и белка перлекана. Показано, что аутокринная сигнализация TGF β является компенсаторным результатом механического напряжения in vitro в эндотелиальных клетках. Используя аналогичный механизм растяжения клеток для имитации артериального давления, это исследование показало, что продукция перлекана увеличивается в ответ на механическое напряжение. Это зависит от аутокринной сигнализации TGF β в положительной обратной связи с p38 и ERK. Это увеличение эндотелиальных клеток в производстве ингибиторов роста гладкомышечных клеток сосудов (т.е. гепарина) обращается в гладкомышечных клетках сосудов, где механическое напряжение вызывает пролиферацию. Деформация клеток гладкомышечных клеток сосудов в культуре приводит к повышению регуляции перлекана, со значительным увеличением сульфатации гепаран-сульфатных цепей. Это не противоречит данным, показывающим, что экспрессия перлекана остается постоянной после e19 в гладкомышечных клетках сосудов крысы, что предполагает, что перлекан играет антипролиферативную роль для гладкомышечных клеток сосудов. В этом случае, похоже, что сигнальная функция молекулы является основным фактором повышения регуляции, особенно из-за увеличения сульфатации гепаран-сульфатных цепей. Химическое повреждение органов может влиять не только на генетическую и механическую целостность клеток, но и на внеклеточный матрикс ткани. Для изучения влияния химического повреждения на клетки печени крысам Wistar вводили тетрахлорметан в течение 48 часов перед убоем. До обработки CCl4 окрашивание перлеканом ограничивалось желчными протоками и синусоидальными сосудами печени. После обработки окрашивание перлеканом было интенсивным в областях некроза. Это могло быть связано с увеличением капилляризации печени в попытке регенерировать поврежденную ткань. Аналогичный результат был показан при обработке мышей ацетаминофеном, где перлекан и другие компоненты матрикса были сильно экспрессированы в некротических очагах печени.

Mechanical and chemical stress can damage basement membranes or the cells they support. This could influence the gene expression profile of the cells, especially in their extracellular matrix, which often provides physical support and a chemical barrier for the cells. Hypoxia, inflammation, mechanical and chemical stress have been examined as to how they relate to perlecan expression. Hypoxia is a condition found in disease states and during injury and often results in a lack of endothelial cell proliferation. This and perlecan's role as endorepellin prompted one study into the nature of perlecan expression regulation by endothelial cells during hypoxic conditions. Under hypoxic conditions, this study found that perlecan expression by rat cardiac microvascular endothelial cells was decreased sixty one percent compared to normal controls. The contention of this paper is that perlecan downregulation leads to a loss of FAK activation and thus less ERK signaling, leading to decreased cell proliferation. It does seem counterintuitive that endothelial cells would proliferate less quickly due to loss of perlecan and its endorepellin subunit. It could be that these endothelial cells merely downregulated transcription of many genes in response to hypoxic conditions. In another study, hypoxia led to induction of genes associated with apoptosis and cell death, but repression of genes was not limited to proteins associated with a specific pathway. When T84 intestinal epithelial cells are exposed to hypoxic conditions for 24 hours a significant increase in perlecan mRNA and protein production occurs. They relate this to the fact that many genes elevated in response to hypoxia contain a cAMP response element (CRE) in their promoter, as does pln. This difference between endothelial cells from the study in 2007 and the epithelial cell studied in these experiments is indicative of how varied the regulatory mechanisms of perlecan may be in different cell types. The development of beta amyloid plaques on the brain is associated with onset of Alzheimer's disease. These plaques induce a constant state of inflammation in areas of accumulation, leading to expression of certain inflammation related gene products, some of which perpetuate the inflammation in the brain context. As previously mentioned, to investigate the effect of brain inflammation on expression levels of perlecan, needle stab wounds were created in mice brains, and after inflammation and variable periods of recovery, mRNA and protein levels were assessed via in situ hybridization and immunostaining. Perlecan levels were increased in the hippocampus but not in the striatum during the healing period, along with IL 1 alpha expression. At the organismic level, mechanical stress has a profound impact on extracellular matrix integrity and probably causes induction of a number of ECM genes for repair and remodeling of ECM in tissue stroma and basement membranes. One study examined the in vitro effects of pressure on global gene transcription using a microarray approach and a cell stretching system meant to simulate intraocular pressure in the lamina cribosa (connective tissue) of the optic nerve head. Their findings were that perlecan and several other proteoglycans were upregulated in response to the stretching stimulus. TGF β2 and VEGF were induced as well, possibly contributing to the upregulation of the perlecan transcript and protein. It has been shown that autocrine TGF β signaling is a compensatory result of mechanical stress in vitro in endothelial cells. Using a similar cell stretching mechanism to mimic arterial pressure, this investigation showed that perlecan production increased in response to mechanical strain. This is contingent upon TGF β autocrine signaling in a positive feedback loop with p38 and ERK. This endothelial cell increase in production of VSMC growth inhibitors (i. e. heparin) is reversed in VSMCs, where mechanical stress induces proliferation. Deformation of VSMC cells in culture leads to perlecan upregulation, with a significant increase in sulfation of the heparan sulfate chains. This is not in contrast to the data shown where perlecan expression is constant beyond e19 in rat VSMC, which suggested that perlecan plays an antiproliferative role for VSMCs. In this case, it seems that the molecule's signaling function is the operative upregulated factor, especially due to the increase in sulfation of the heparan sulfate chains. Chemical damage to organs can affect not only the cell's genetic and mechanical integrity but the extracellular matrix of the tissue. To study the effect of chemical damage on liver cells, Wistar rats were treated with carbon tetrachloride for 48 hours prior to sacrificing. Prior to treatment with CCl4, perlecan staining was limited to the bile duct and sinusoidal blood vessels of the liver. After treatment, perlecan staining was intense in areas of necrosis. This could have been due to the increase in capillarization of the liver as an attempt to regenerate damaged tissue. A similar finding was shown in acetamenophin treatment of mice, where perlecan and other matrix components were heavily expressed in necrotic lesions of the liver.

Экспрессия в клеточной культуре

Одним из весомых аргументов против достоверности результатов клеточных культур in vitro, полученных на двухмерных пластиковых пластинах, является то, что среда культивирования неточно отражает микроокружение клеток в организме. Решение этой проблемы заключается в разработке трехмерных клеточных культур с использованием широкого спектра субстратов в качестве каркасов или сред для клеток. В таких условиях экспрессия генов внеклеточного матрикса (ВКМ) может более точно соответствовать профилю экспрессии in vivo. Трехмерные каркасы, представляющие собой структуры, на которых растут культивируемые клетки, могут состоять из других клеток, то есть кокультур, синтетических полимеров, имитирующих естественную среду клеток, или очищенного ВКМ, такого как матригель, а также любых комбинаций этих трех компонентов. Одна из таких систем была разработана для изучения развития кожи и формирования базальной мембраны между кератиноцитами и стромой. Эта система используется для изучения развития основной мембраны между фибробластами в строме (в данном случае фибробластами в геле коллагена I типа) и кератиноцитами, выращенными на поверхности геля. Экспрессия перлекана и, следовательно, созревание основной мембраны в этой системе зависят от нидоген-опосредованного сшивания коллагена IV и гамма-1 цепи ламинина. Этот эффект также привел к отсутствию гемидесмосом в развивающейся ткани. Другая система, использующая дезорганизованный гидратированный гель коллагена I, была использована для демонстрации того, что первичные фибробласты роговицы человека в конечном итоге проникают в гель и создают матрицу, состоящую из коллагена I типа и перлекана, а также нескольких других сульфатированных матричных гликопротеинов. Это имитирует программу развития фибробластов роговицы in vivo и их реакцию на повреждение. Одной из долгосрочных целей создания трехмерных клеточных культур является разработка тканей, которые можно использовать для замены поврежденных органов и тканей у пациентов с различными заболеваниями. В тканеинженерных клапанах сердца, созданных путем засевания миофибробластов на коллаген I типа с последующим добавлением эндотелиальных клеток, была подтверждена экспрессия гепарансульфата протеогликана, однако в этих тканях не проводилось различий между синдеканом и перлеканом. Еще одной процедурой, которая может стать возможной благодаря тканевой инженерии, является кератоэпителиопластика. Для обеспечения жизнеспособности трансплантированной ткани необходима предварительно сформированная основная мембрана. Коллагеновые гели способствуют формированию полной основной мембраны эпителиальными клетками роговицы в культуре. Перлекан также перспективен в качестве каркаса для культивирования клеток. Клетки протоков и ацинусов слюнной железы человека были успешно выращены на биоактивном пептиде, содержащем последовательность, повторяющуюся в домене IV белка перлекана. Эти клетки воспроизводят ациноподобные структуры, аналогичные тем, что встречаются в нативной железе, а также плотные контакты и полные основные мембраны в культуре.

One of the resounding arguments against the validity of in vitro results of cell culture on 2D plastic plates is that the environment does not accurately reflect that of the cells in the organism. This problem is being dealt with by developing 3D cell cultures using a wide variety of substrates as the scaffolds or environments for the cells. In this kind of setting the expression of ECM genes has the potential to more closely resemble that of the native expression profile. 3D scaffolds, the structures on which the cultured cells grow, can be composed of other cells, i. e. cocultures, synthetic polymers mimicking the cells natural environment or purified ECM such as matrigel, and any mixture of these three components. One such system has been developed to study skin development and basal membrane formation between keratinocytes and the stroma. This system is used to delineate the development of basement membrane between fibroblasts in the stroma (in this case fibroblasts in a type I collagen gel) and keratinocytes grown on top of the gel. Perlecan expression and thus basement membrane maturation is dependent on nidogen crosslinking of collagen IV and laminin γ1 chain in this system. This effect also led to a lack of hemidesmosomes in the developing tissue. Another system using a disorganized hydrated collagen I gel has been used to demonstrate that primary human corneal fibroblasts will eventually invade the gel and create a matrix consisting of collagen type I and perlecan, as well as several other sulfated matrix glycoproteins. This mimics the in vivo corneal fibroblast's developmental program and response to injury. One of the long term goals of creating 3D cell culture systems is to engineer tissues that can be used as replacements for patients with many types of disease. In tissue engineered heart valves created by seeding myofibroblasts onto collagen type I followed by endothelial cells, heparan sulfate proteoglycan expression has been verified, although no distinction between syndecan and perlecan has been made in these tissues. Another procedure that could be made possible by tissue engineering is keratoepithelioplasty. Transplanted tissue must remain intact, which requires a pre formed basement membrane. Collagen gels have promoted formation of a complete basement membrane by corneal epithelial cells in culture. Perlecan also holds promise to serve as a scaffold for plating cells in culture. Human salivary gland ductal and acinar cells have been successfully grown on a bioactive peptide containing a sequence repeated in domain IV of the perlecan protein. These cells reproduce acini like structures similar to those found in the native gland and tight junctions, along with complete basement membranes in culture.

Рак

В то время как подавление перлекана вызывает существенное ингибирование роста опухоли и неоваскуляризации у мышей с нокаутом по гену перлекана, напротив, при введении клеток с нокаутом по гену перлекана в мышей с дефицитом иммунитета наблюдается усиленный рост опухоли по сравнению с контрольной группой. Прогрессирование рака и патогенез тесно связаны с составом внеклеточного матрикса, и роль перлекана и других молекул внеклеточного матрикса в раке изучается во многих лабораториях. Поскольку базальная мембрана является первым препятствием на пути экстравазации раковых клеток, функции перлекана в этом процессе многообразны. Одной из модельных систем, используемых для изучения экспрессии перлекана в клеточных линиях карциномы, является система клеточных линий метастатической прогрессии меланомы MeWo/70W. Клетки MeWo, как правило, менее инвазивны, чем их клональный вариант – клеточная линия 70W. В одной лаборатории изучали экспрессию перлекана в 27 инвазивных меланомах, и в 26 из 27 образцов было обнаружено значительное увеличение уровня мРНК перлекана по сравнению с нормальной тканью тех же пациентов. Затем они использовали клеточные линии MeWo и 70W для изучения изменений экспрессии перлекана при обработке нейротрофинами, которые могут стимулировать инвазию клеток через матригель in vitro. Более инвазивные клетки 70W начали экспрессировать мРНК перлекана через десять минут после стимуляции нейротрофинами, в то время как клетки MeWo не производили мРНК pln независимо от обработки. В этом исследовании было особо отмечено, что повышение регуляции перлекана происходило даже раньше, чем повышение уровня гепараназы – важного белка, участвующего в процессе экстравазации. При раке яичников, как и при других видах рака, экспрессия перлекана изменяется на разных стадиях прогрессирования заболевания. Окраска на перлекан теряется в базальной мембране яичников, поврежденной инвазивной аденокарциномой, в отличие от окраски на перлекан в базальных мембранах нормальных яичников и яичников с доброкачественными опухолями, где базальная мембрана однородна и по составу очень похожа на базальные мембраны других нормальных тканей. Это согласуется с другими результатами, показывающими потерю перлекана в базальных мембранах, пораженных инвазивным раком шейки матки, распространяющимся в тазовые лимфатические узлы, что неудивительно, учитывая корреляцию повышенных уровней экспрессии мРНК гепараназы с инвазией аналогичной карциномы шейки матки. Напротив, образование опухоли бессмертной линией эпителиальных клеток мыши RT101 при введении в крыс зависело от экспрессии перлекана клетками мыши, а не от наличия эндогенного перлекана у крыс. Клетки RT101 с подавленной экспрессией перлекана с помощью антисмысловых олигонуклеотидов не показали образования опухоли в этой системе, однако клетки, экспрессирующие антисмысловый перлекан и рекомбинантную конструкцию, кодирующую домены I, II и III мышиного перлекана, действительно показали образование опухоли. Таким образом, в этой системе экспрессия перлекана в опухолевых клетках, по-видимому, необходима для агрегации опухоли. Дальнейшие исследования модификации цепей GAG или основного белка инвазивными опухолевыми клетками по сравнению с доброкачественными опухолевыми клетками и нормальной тканью были бы полезны для лучшего понимания роли перлекана в миграции рака. Несколько лабораторий изучали ангиогенез опухолевых клеток in vitro, используя антисмысловые конструкции для подавления экспрессии перлекана. ДНК-комплемент, управляемый сильным промотором, трансфицируется в различные типы клеток для блокирования экспрессии перлекана. Антисмысловые олигонуклеотиды в клетках колоректального рака блокируют трансляцию перлекана, что приводит к снижению роста опухоли и ангиогенеза. Аналогичное снижение пролиферации in vitro наблюдалось в клетках NIH 3T3 и в клеточной линии меланомы человека, экспрессирующей антисмысловую мРНК перлекана. Результаты in vitro с клеточными линиями саркомы Капоши показали, что потеря перлекана в результате трансфекции антисмысловым конструктом привела к снижению пролиферации и миграции этого высокометастатического клеточного типа. Эти результаты контрастируют с результатами in vivo с теми же линиями саркомы Капоши, которые показывают, что снижение уровня перлекана приводит к увеличению ангиогенеза, что облегчает миграцию и, следовательно, связано с увеличением степени злокачественности опухоли. Эти выводы о большем опухолеобразовании in vivo подтверждаются данными, показывающими, что C-концевой участок белка перлекана действует как эндостатинный модуль, известный как эндорепеллин. Была создана рибозимная конструкция для подавления уровня трансляции перлекана. Этот рибозим был направлен на последовательность, кодирующую домен I белка перлекана. Он снижал экспрессию перлекана до 80% в линии рака предстательной железы C42B. В отличие от ранее обсуждавшихся исследований, эти клетки образовывали меньшие опухоли, чем их исходные клетки, при введении в атимичных мышей. Значение этого расхождения в результатах для инвазии неизвестно, хотя верно, что перлекан является частью внеклеточного матрикса в мезенхимальной ткани, и клетки, подвергающиеся эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП), могут повышать экспрессию перлекана как часть своей программы ЭМП.

While Perlecan suppression causes substantial inhibition of tumor growth and neovascularization in null mice, in contrast, when perlecan null cells are injected into nude mice enhanced tumor growth is observed when compared to controls. Cancer progression and pathogenesis is intimately linked to extracellular matrix composition and the role of perlecan and other ECM molecules in cancer is being studied by a large number of laboratories. Since the basement membrane is the first obstacle in the way of extravasating carcinoma cells, the functions of perlecan in this process are multiple. One model system used to study perlecan expression in carcinoma cell lines is that of the MeWo/70W melanoma metastatic progression cell lines. MeWo cells are characteristically less invasive than their clonal variant cell line 70W. One lab studied perlecan expression in 27 invasive melanomas and 26 of the 27 samples showed a significant increase in perlecan message when compared to normal tissue from the same patients. They then used the MeWo and 70W cell lines to study if perlecan expression changed during treatment with neurotrophins, which can stimulate cell invasion through matrigel in vitro. The more invasive 70W cells began expressing perlecan message ten minutes after stimulation with the neurotrophins, and the MeWo cells did not produce any pln message regardless of treatment. This study took special note of the fact that perlecan upregulation occurred even before that of heparanase, an essential protein involved in the process of extravasation. In ovarian cancer as in other cancers, perlecan expression occurs differently throughout progression of the disease. Perlecan staining is lost in ovarian basement membrane that has been breached by an invasive adenocarcinoma, which is in contrast to perlecan staining in the basement membranes of normal ovaries and those with benign tumors, where basement membrane is homogeneous and very similar in composition to that in other normal tissues. This is consistent with other results showing loss of perlecan in basement membranes affected by invasive cervical cancer spreading to the pelvic lymph nodes, which comes as no surprise due to the correlation of elevated levels of heparanase mRNA expression with invasion of similar cervical carcinoma. By contrast, tumor formation of the immortalized mouse epithelial cell line RT101 injected into rats was dependent on perlecan expression by the mouse cells and not on the presence of endogenous rat perlecan. RT101 cells with perlecan knocked down by antisense did not show tumor formation in this system, however cells expressing the antisense perlecan and a recombinant construct encoding domains I, II, and III of mouse perlecan did indeed show tumor formation. Thus in this system it does appear that tumor cell expression of perlecan is necessary for tumor aggregation. More research into GAG chain or core protein modification by invasive tumor cells as compared to benign tumor cells and normal tissue would be informative to better understand perlecans role in cancer migration. Several laboratories have studied in vitro tumor cell angiogenesis using antisense constructs to the perlecan message. The full length reverse complement cDNA, driven by a strong promoter, is transfected into various cell types to eliminate perlecan expression. Antisense in colon carcinoma cells blocks perlecan translation, leading to decreased tumor growth and angiogenesis. A similar in vitro decrease in proliferation occurred in NIH 3T3 cells and a human melanoma cell line expressing antisense perlecan mRNA. Findings in vitro with Kaposi's sarcoma cell lines showed that loss of perlecan via transfection with an antisense construct led to decreased proliferation and migration of this highly metastatic cell type. These results are in contrast to in vivo results with the same Kaposi Sarcoma lines, which show that decreased perlecan leads to increased angiogenesis, which facilitates migration and thus is associated with increase in tumor grade. These findings of greater tumorigenesis in vivo are supported by data showing that the C terminus of the perlecan protein acts as an endostatic module now known as endorepellin. A ribozyme construct was created for use in knocking down perlecan translation levels. This ribozyme was targeted at a sequence coding domain I of the perlecan protein. It reduced expression of perlecan up to 80% in the prostate cancer cell line C42B. In contrast to previously discussed studies these cells produced smaller tumors than their parental cells when injected into athymic mice. What this disparity in results means for invasion is unknown, although it is true that perlecan is part of the extracellular matrix in mesenchymal tissue, and cells undergoing epithelial mesenchymal transition (EMT) may upregulate perlecan expression as part of their EMT programming.

Диабет и сердечно-сосудистые заболевания

Уровни перлекана снижаются при многих заболеваниях, например, при диабете, атеросклерозе и артрите. Перлекан играет важную роль в поддержании гломерулярного фильтрационного барьера. Снижение уровня перлекана в гломерулярной основной мембране играет центральную роль в развитии диабетической альбуминурии. Экспрессия перлекана подавляется многими атерогенными стимулами, и поэтому считается, что перлекан играет защитную роль при атеросклерозе. Диабет и атеросклероз часто встречаются совместно. В 80% случаев смерти, связанных с диабетом, наблюдаются те или иные атеросклеротические осложнения, а базальная мембрана эндотелия вовлечена в атерогенный процесс. Синтез гепарансульфата снижается в артериях пациентов с диабетом и в артериях, где развиваются атеросклеротические поражения. Механизм снижения гепарансульфата в этих поражениях долгое время оставался неизвестным. Одна из теорий предполагает, что высокий уровень глюкозы в крови может приводить к снижению присоединения GAG-цепей к перлекану, но не обязательно к изменению пути синтеза GAG-цепей или самого белка-ядра. После обработки эндотелиальных клеток аорты человека средой с высоким содержанием глюкозы, выделяемый перлекан содержал меньше сульфатных включений, сопровождающихся снижением общего включения GAG-цепей. Хотя сигнальный путь, приводящий к такому снижению включения GAG-цепей, не был идентифицирован, предполагается, что потеря 30% общего гликозилирования белка может означать потерю одной из трех HS-цепей перлекана в этой модели гипергликемии, связанной с диабетом. Также отмечается, что аналогичное снижение внеклеточного ГС без изменения окраски для белковых цепей ядра наблюдается в почках пациентов с диабетом и в клетках почек в культуре, обработанных высоким содержанием глюкозы. Атеросклероз является наиболее частой причиной ишемической болезни сердца и других сердечно-сосудистых заболеваний, а значительное скопление белка перлекана является признаком развитых атеросклеротических бляшек. Гладкие мышечные клетки сосудов (ГМКС) являются продуцентами перлекана в этом состоянии, что означает, что значительная часть исследований была направлена на понимание механизмов регуляции экспрессии перлекана. В тесте, оценивающем влияние циркулирующих свободных жирных кислот (симптоматичных для диабета и атерогенеза) на экспрессию перлекана в ГМКС, экспрессия не изменилась по сравнению с контрольными клетками. Это контрастировало с 2-10-кратным увеличением экспрессии других протеогликанов основной мембраны. Тромбин – еще один маркер, связанный с атерогенезом и прокоагуляцией, который избирательно повышает продукцию перлекана, но не других протеогликанов в человеческих ГМКС в культуре. Предполагается, что этот эффект наблюдается только при достижении ГМКС конфлюэнтности, но не до нее. Эта концепция созвучна ранее упомянутым исследованиям, показывающим, что перлекан продуцируется ГМКС только после прекращения их пролиферации в процессе развития. Учитывая значимость экспрессии перлекана при атеросклерозе, существует потенциал для терапии, основанной на модуляции экспрессии перлекана, и исследования могут в конечном итоге быть направлены в этом направлении.

Perlecan levels are decreased in many disease states e. g., diabetes, atherosclerosis and arthritis. Perlecan has an important role in the maintenance of the glomerular filtration barrier. Decreased perlecan in the glomerular basement membrane has a central role in the development of diabetic albuminuria. Perlecan expression is down regulated by many atherogenic stimuli and thus Perlecan is thought to play a protective role in atherosclerosis. Diabetes and atherosclerosis are commonly associated syndromes. 80% of diabetes associated deaths involve some form of atherosclerotic complication, and the basement membrane of endothelia has been implicated in the atherogenic process. Synthesis of heparan sulfate was shown to decrease in the arteries of diabetics and in arteries developing atherosclerotic lesions. The mechanism by which heparan sulfate was downregulated in these lesions remained unknown for some time. One theory states that high glucose in circulation could lead to a decrease in GAG chain attachment to perlecan, but not necessarily a change in the synthetic pathway of the GAG chains or that of the core protein. After treatment of human aortic endothelial cells with high glucose medium, secreted perlecan contained less sulfate incorporation accompanied by less overall GAG chain incorporation. Although no signaling pathway is identified leading to this decrease in GAG chain incorporation, it is suggested that the 30% loss in overall glycosylation of the protein could mean loss of one of the three HS chains on perlecan in this model of diabetes associated hyperglycemia. It is also noted that similar decreases in extracellular HS without a change in staining for the core protein chains occur in diabetic kidneys and in kidney cells in culture treated with high glucose. Atherosclerosis is most often the culprit in coronary heart disease and other cardiovascular conditions, and a large aggregation of perlecan protein is symptomatic of advanced atherosclerotic plaques. VSMCs are the producers of the perlecan in this condition, meaning that a good deal of research has been focused on understanding the means of perlecan upregulation in this condition. In a test of the effect of circulating nonesterified fatty acids (symptomatic of diabetes and atherogenesis) on perlecan expression by VSMCs, expression did not change when compared to control cells. This was in contrast to a 2 10 fold increase in expression of other basement membrane proteoglycans. Thrombin is another marker associated with atherogenesis and procoagulation, and it selectively upregulates production of perlecan but not other proteoglycans in human VSMCs in culture. It is suggested that this effect is only seen when VSMCs reach confluence, but not prior to confluence. This concept is similar to previously mentioned studies showing that perlecan is only produced by VSMCs once they have ceased proliferation during development. Given the prominence of perlecan expression in atherosclerosis there is potential for therapy based upon perlecan expression and research may eventually proceed in that direction.