Zygosaccharomyces bailii: характеристика и устойчивость к консервантам.

Введение

Вид гриба

Zygosaccharomyces bailii – вид рода Zygosaccharomyces. Изначально он был описан как Saccharomyces bailii Линднером в 1895 году, но в 1983 году был переклассифицирован как Zygosaccharomyces bailii в работе Барнетта и др. Порча, вызванная ростом дрожжей Zygosaccharomyces, широко распространена и приводит к значительным экономическим потерям в пищевой промышленности. Внутри этого рода Z. bailii является одним из наиболее проблемных видов благодаря его исключительной устойчивости к различным неблагоприятным условиям. Широкий спектр кислых и/или высокосахаристых продуктов, таких как фруктовые концентраты, вино, безалкогольные напитки, сиропы, кетчуп, майонез, соленые огурцы, салатные заправки и т.д., обычно считаются стабильными при хранении, то есть они легко инактивируют широкий спектр пищевых микроорганизмов. Однако эти продукты все еще восприимчивы к порче, вызываемой Z. bailii.

Морфология и способы размножения

Вегетативные клетки Zygosaccharomyces bailii обычно эллипсоидные, неподвижные и размножаются бесполым путем многосторонним почкованием, то есть почки могут образовываться в различных местах на клетках. В процессе почкования материнская клетка формирует почку на своей внешней поверхности. По мере удлинения почки ядро материнской клетки делится, и одно ядро мигрирует в почку. Материал клеточной стенки заполняет пространство между почкой и материнской клеткой; в конечном итоге почка отделяется, образуя дочернюю клетку неравного размера. Размер клеток Z. bailii варьируется в пределах (3,5–6,5) x (4,5–11,5) мкм, и клетки существуют поодиночке или парами, редко образуя короткие цепочки. Было установлено, что время удвоения этих дрожжей составляет приблизительно 3 часа при 23 °C в дрожжевой азотной среде, содержащей 20% (мас./об.) фруктозы (pH 4,0). В более стрессовых условиях время генерации значительно увеличивается. Помимо бесполого размножения, при определенных условиях (например, при дефиците питательных веществ) Z. bailii производит половые споры (аскоспоры) в мешке, называемом аскусом (множественное число: аски). Следует отметить, что аскоспоры наблюдаются редко, поскольку индуцировать их образование сложно и может занять много времени; кроме того, многие штаммы дрожжей теряют способность производить аскоспоры при повторных пересевах в лаборатории. Для обнаружения кислотоустойчивых дрожжей, таких как Z. bailii, рекомендуется использовать подкисленные среды, такие как MEA или TGY с добавлением 0,5% (об./об.) уксусной кислоты. Высев на агаровую среду часто используется для подсчета дрожжей, при этом метод поверхностного посева предпочтительнее метода заливки в чашки Петри, поскольку первый метод обеспечивает лучшее восстановление клеток с меньшими ошибками разбавления. Обычные условия инкубации – аэробная атмосфера, температура 25 °C в течение 5 дней. Тем не менее, для Z. bailii можно использовать более высокую температуру инкубации (30 °C) и более короткое время инкубации (3 дня), поскольку дрожжи растут быстрее при этой повышенной температуре.

Характеристики сопротивления

Выдающейся особенностью Z. bailii является его исключительная устойчивость к слабым кислотным консервантам, обычно используемым в пищевых продуктах и напитках, таким как уксусная, молочная, пропионовая, бензойная, сорбиновая кислоты и диоксид серы. Кроме того, сообщается, что дрожжи способны переносить высокие концентрации этанола (≥ 15% (v/v)). Диапазон pH и aw для роста широк, 2,0 – 7,0 и 0,80 – 0,99 соответственно. Примечательно, что отдельные клетки в любой популяции Z. bailii значительно различаются по своей устойчивости к сорбиновой кислоте, при этом небольшая часть способна расти при концентрациях консерванта, вдвое превышающих средние для популяции. В некоторых видах пищевых продуктов дрожжи способны расти даже в присутствии бензойной и сорбиновой кислот в концентрациях, превышающих установленные законом, и при pH ниже pKa этих кислот. Однако Z. bailii может расти в безалкогольных напитках, содержащих 0,05% (w/v) этой кислоты (pKa 4,8). В частности, имеются убедительные доказательства того, что устойчивость Z. bailii усиливается при наличии нескольких консервантов. Следовательно, дрожжи могут выживать и преодолевать синергические комбинации консервантов, которые обычно обеспечивают микробиологическую стабильность обработанных продуктов. Было замечено, что поглощение уксусной кислоты клетками ингибируется при добавлении сорбиновой или бензойной кислоты в культуральную среду. Аналогично, уровни этанола до 10% (v/v) не оказывали негативного влияния на устойчивость дрожжей к сорбиновой и бензойной кислотам при pH 4,0 – 5,0. Показано, что в Z. bailii этанол играет защитную роль против негативного воздействия уксусной кислоты, ингибируя транспорт и накопление этой кислоты внутри клеток. Как и другие микроорганизмы, Z. bailii обладает способностью адаптироваться к суб-ингибиторным уровням консерванта, что позволяет дрожжам выживать и расти при концентрациях консерванта, значительно превышающих те, которые были до адаптации. Некоторые исследования показали незначительное влияние различных сахаров на устойчивость Z. bailii к консервантам, например, сопоставимая устойчивость к сорбиновой и бензойной кислотам наблюдалась независимо от того, выращивались ли клетки в среде, содержащей глюкозу или фруктозу в качестве ферментируемых субстратов. Однако на устойчивость дрожжей к консервантам влияет уровень глюкозы, причем максимальная устойчивость достигается при концентрации сахара 10–20% (w/v). Наибольшая толерантность к соли наблюдается при низких значениях pH, например, максимальная концентрация NaCl, позволяющая рост, составляет 12,5% (w/v) при pH 3,0, в то время как при pH 5,0 она составляет всего 5,0% (w/v). Кроме того, присутствие соли или сахара положительно влияет на способность Z. bailii инициировать рост при экстремальных значениях pH, например, дрожжи не росли при pH 2,0 в отсутствие NaCl и сахарозы, но росли при этом pH в 2,5% (w/v) NaCl или 50% (w/v) сахарозы. Большинство факультативно ферментирующих видов дрожжей не могут расти в полном отсутствии кислорода. Это означает, что ограничение доступности кислорода может быть полезным для контроля порчи продуктов, вызванной ферментативными дрожжами. Однако было отмечено, что Z. bailii способен быстро расти и активно ферментировать сахар в сложной среде в строго анаэробных условиях, что указывает на то, что потребности в питательных веществах для анаэробного роста удовлетворяются компонентами сложной среды. Следовательно, ограничение поступления кислорода в продукты и напитки, богатые питательными веществами, не является перспективной стратегией для предотвращения риска порчи, вызываемой этими дрожжами. Кроме того, Leyva et al. (1999) сообщили, что клетки Z. bailii могут сохранять способность к порче, производя значительное количество газа даже в условиях отсутствия роста (т.е. при наличии сахаров, но отсутствии источника азота).

An outstanding feature of Z. bailii is its exceptional resistance to weak acid preservatives commonly used in foods and beverages, such as acetic, lactic, propionic, benzoic, sorbic acids and sulfur dioxide. In addition, it is reported that the yeast is able to tolerate high ethanol concentrations (≥ 15% (v/v)). The ranges of pH and aw for growth are wide, 2.0 7.0 and 0.80 0.99, respectively. Notably, individual cells in any Z. bailii population differ considerably in their resistance to sorbic acid, with a small fraction able to grow in preservative levels double that of the average population. In some types of food, the yeast is even able to grow in the presence of benzoic and sorbic acids at concentrations higher than those legally permitted and at pH values below the pKa of the acids. however Z. bailii can grow in soft drinks containing 0.05% (w/v) of this acid (pKa 4.8). Particularly, there is strong evidence that the resistance of Z. bailii is stimulated by the presence of multiple preservatives. Hence, the yeast can survive and defeat synergistic preservative combinations that normally provide microbiological stability to processed foods. It has been observed that the cellular acetic acid uptake was inhibited when sorbic or benzoic acid was incorporated into the culture medium. Similarly, ethanol levels up to 10% (v/v) did not adversely influence sorbic and benzoic acid resistance of the yeast at pH 4.0 5.0. have proved that in Z. bailii, ethanol plays a protective role against the negative effect of acetic acid by inhibiting the transport and accumulation of this acid intracellularly. Like other microorganisms, Z. bailii has the ability to adapt to sub inhibitory levels of a preservative, which enables the yeast to survive and grow in much higher concentrations of the preservative than before adaptation. Some studies have revealed the negligible effects of different sugars on preservative resistance of Z. bailii, e. g. comparable sorbic and benzoic acid resistance was observed regardless whether the cells were grown in culture medium containing glucose or fructose as fermentable substrates. However, the preservative resistance of the yeast is influenced by glucose level, with maximum resistance obtained at 10 20% (w/v) sugar concentrations. The highest tolerance to salt has been observed at low pH values, e. g. the maximum NaCl allowing growth was 12.5% (w/v) at pH 3.0 whereas this was only 5.0% (w/v) at pH 5.0. Moreover, the presence of either salt or sugar has a positive effect on the ability of Z. bailii to initiate growth at extreme pH levels, e. g. the yeast showed no growth at pH 2.0 in the absence of NaCl and sucrose, but grew at this pH in 2.5% (w/v) NaCl or 50% (w/v) sucrose. Most facultatively fermentative yeast species cannot grow in the complete absence of oxygen. That means limitation of oxygen availability might be useful in controlling food spoilage caused by fermentative yeasts. However, it has been observed that Z. bailii is able to grow rapidly and ferment sugar vigorously in a complex medium under strictly anaerobic condition, indicating that the nutritional requirement for anaerobic growth was met by the complex medium components. Therefore, restriction of oxygen entry into foods and beverages, which are rich in nutrients, is not a promising strategy to prevent the risk of spoilage by this yeast. Besides, Leyva et al. (1999) have reported that Z. bailii cells can retain their spoilage capability by producing a significant amount of gas even in non growing conditions (i. e. presence of sugars but absence of nitrogen source).

Механизмы консервирующей стойкости

Были предложены различные стратегии для объяснения устойчивости Z. bailii к слабым кислотным консервантам, включающие: (i) разложение кислот, (ii) предотвращение проникновения кислот в клетки или их выведения из них, (iii) изменение мишени ингибитора или уменьшение вызванного им повреждения, что свидетельствует об индукции системы, позволяющей клеткам снижать внутриклеточное накопление кислоты. Согласно Уорту (1977), вряд ли одной лишь активной экструзии кислоты будет достаточно для достижения неравномерного распределения кислоты через клеточную мембрану. Скорее всего, Z. bailii разработал более эффективные механизмы изменения своей клеточной мембраны для ограничения диффузионного проникновения кислот в клетки. Это, в свою очередь, значительно снизит потребность в активной экструзии протонов и кислотных анионов, тем самым экономя энергию. Действительно, Уорт (1989). Кроме того, Коул и Кинан (1987) показали, что у Z. bailii фруктоза транспортируется с помощью специфической системы высокой пропускной способности, в то время как глюкоза транспортируется системой с более низкой пропускной способностью, которая частично инактивируется фруктозой и также может использовать фруктозу в качестве субстрата. Медленная ферментация сахарозы напрямую связана с метаболизмом фруктозы. По мнению Питта и Хокинга (1997), поэтому использование сахарозы в качестве подсластителя (вместо глюкозы или фруктозы) настоятельно рекомендуется в синтетических продуктах, таких как безалкогольные напитки. Поскольку сахара являются распространенными компонентами продуктов питания и напитков, ферментация является типичной характеристикой процесса порчи. В основном эти сахара превращаются в этанол и CO2, что приводит к потере сладости продукта и приобретению характерного алкогольного аромата и газированности. Помимо этого, образуется множество вторичных продуктов в небольших количествах, таких как органические кислоты, эфиры, альдегиды и т.д. Z. bailii отличается высокой продукцией вторичных метаболитов, например, уксусной кислоты, этилацетата и ацетальдегида. В достаточно высоких концентрациях эти вещества могут существенно влиять на сенсорные свойства продукта. Большая устойчивость Z. bailii к слабым кислотам по сравнению с S. cerevisiae может быть частично объяснена его способностью метаболизировать консерванты. Было продемонстрировано, что Z. bailii способен потреблять уксусную кислоту в присутствии ферментируемых сахаров, в то время как системы поглощения и утилизации ацетата у S. cerevisiae полностью подавляются глюкозой. Кроме того, Z. bailii может окислительно разлагать сорбат и бензоат (и использовать эти соединения в качестве единственного источника углерода), в то время как S. cerevisiae не обладает этой способностью.

Different strategies have been suggested in accounting for Z. bailii resistance to weak acid preservatives, which include: (i) degradation of the acids, (ii) prevention of entry or removal of acids from the cells, (iii) alteration of the inhibitor target, or amelioration of the caused damage. which indicates the induction of a system whereby the cells can reduce the intracellular acid accumulation. According to Warth (1977), Besides, it is unlikely that an active acid extrusion alone would be sufficient to achieve an unequal acid distribution across the cell membrane. Instead, Z. bailii might have developed much more efficient ways of altering its cell membrane to limit the diffusional entry of acids into the cells. This, in turn, will dramatically reduce any need for active extrusion of protons and acid anions, thus saving a lot of energy. Indeed, Warth (1989) In addition, Cole and Keenan (1987) This is because in Z. bailii, fructose is transported by a specific high capacity system, while glucose is transported by a lower capacity system, which is partially inactivated by fructose and also accepts fructose as a substrate. The slow fermentation of sucrose is directly related to fructose metabolism. According to Pitt and Hocking (1997), Therefore, the use of sucrose as a sweetener (instead of glucose or fructose) is highly recommended in synthetic products such as soft drinks. As sugars are common components of foods and beverages, fermentation is a typical feature of the spoilage process. Principally, these sugars are converted to ethanol and CO2, causing the products to lose sweetness and acquire a distinctive alcoholic aroma along with gassiness. Besides, many secondary products are formed in small amounts, such as organic acids, esters, aldehydes, etc. Z. bailii is noted for its strong production of secondary metabolites, e. g. acetic acid, ethyl acetate and acetaldehyde. In high enough concentrations, these substances can have a dominant effect on the sensorial quality of the products. The higher resistance of Z. bailii to weak acids than S. cerevisiae can partly be explained by its ability to metabolize preservatives. It has been demonstrated that Z. bailii is able to consume acetic acid in the presence of fermentable sugars, whereas the acetate uptake and utilization systems of S. cerevisiae are all glucose repressed. In addition, Z. bailii can also oxidatively degrade sorbate and benzoate (and use these compounds as a sole carbon source), while S. cerevisiae does not have this capability.

Деятельность по порче

Согласно Томасу и Давенпорту (1985), кроме того, порча, вызываемая этими дрожжами, распространяется на новые категории продуктов питания, такие как готовые горчицы, газированные фруктовые напитки, содержащие концентрированные цитрусовые, яблочные и виноградные соки. Порча, вызываемая Z. bailii, часто происходит в кислотных продуктах длительного хранения, которые полагаются на совместное действие кислотности (например, уксуса), соли и сахара для подавления роста микроорганизмов. Испорченные продукты обычно демонстрируют сенсорные изменения, которые легко распознаются потребителями, что приводит к значительным экономическим потерям из-за жалоб потребителей или отзыва продукции.