Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Химический тест для обнаружения пептидных связей
Chemical test for detecting peptide bonds
В химии тест Биуре (IPA: /baɪˈjʊərət/), также известный как тест Пиотровского, является химическим тестом, используемым для обнаружения наличия как минимум двух пептидных связей в молекуле. В присутствии пептидов ион меди(II) образует лилово-цветные координационные комплексы в щелочном растворе. Реакция была впервые обнаружена в 1833 году; в Польше тест Биуре также известен как тест Пиотровского в честь польского физиолога, который независимо открыл его в 1857 году. Было разработано несколько вариантов теста, таких как тест BCA и модифицированный тест Лоури. Реакция Биуре может быть использована для оценки концентрации белков, поскольку пептидные связи встречаются с одинаковой частотой на каждую аминокислоту в пептиде. Интенсивность цвета, а следовательно, и поглощение при 540 нм, прямо пропорциональна концентрации белка в соответствии с законом Бира-Ламберта. Несмотря на свое название, реагент фактически не содержит биурет. Тест назван так, потому что он также дает положительную реакцию на пептидоподобные связи в молекуле биурета. В этом анализе медь(II) связывается с атомами азота, присутствующими в пептидах белков. Во вторичной реакции медь(II) восстанавливается до меди(I). Буферы, такие как Tris и аммиак, мешают этому анализу, что делает его непригодным для белковых образцов, очищенных после осаждения сульфатом аммония. Благодаря своей нечувствительности и незначительному влиянию свободных аминокислот, этот анализ наиболее полезен для образцов цельных тканей и других источников с высокой концентрацией белка.
In chemistry, the Biuret test (IPA: ,/b//aɪ//y//ə/'/r//ɛ//t/, '/b//aɪ//y//ə// ˌ//r//ɛ//t/), also known as Piotrowski's test, is a chemical test used for detecting the presence of at least two peptide bonds in a molecule. In the presence of peptides, a copper(II) ion forms mauve colored coordination complexes in an alkaline solution. The reaction was first observed in 1833; In Poland, the biuret test is also known as Piotrowski's test in honor of the Polish physiologist pl who independently rediscovered it in 1857. Several variants on the test have been developed, such as the BCA test and the Modified Lowry test. The biuret reaction can be used to assess the concentration of proteins because peptide bonds occur with the same frequency per amino acid in the peptide. The intensity of the color, and hence the absorption at 540 nm, is directly proportional to the protein concentration, according to the Beer–Lambert law. Despite its name, the reagent does not in fact contain biuret |[(H2N\sCO\s)2NH]. The test is named so because it also gives a positive reaction to the peptide like bonds in the biuret molecule. In this assay, the copper(II) binds with nitrogen atoms present in the peptides of proteins. In a secondary reaction, the copper(II) is reduced to copper(I). Buffers, such as Tris and ammonia interfere with this assay, therefore rendering this assay inappropriate for protein samples purified from ammonium sulfate precipitation. Due to its insensitivity and little interference by free amino acids, this assay is most useful for whole tissue samples and other sources with high protein concentration.
Процедура
Водный образец обрабатывают равным объемом 1% раствора сильного основания (гидроксида натрия или гидроксида калия), а затем добавляют несколько капель водного раствора сульфата меди(II). Если раствор окрашивается в фиолетовый цвет, это указывает на наличие белка. Можно определить концентрацию в диапазоне от 5 до 160 мг/мл. Для получения заметного и измеримого изменения цвета с этими реагентами необходимы пептиды, состоящие как минимум из трех аминокислот.
An aqueous sample is treated with an equal volume of 1% strong base (sodium or potassium hydroxide) followed by a few drops of aqueous copper(II) sulfate. If the solution turns purple, it contains protein. 5–160 mg/mL can be determined. Peptides with the correct length of at least 3 amino acids are necessary for a significant, measurable colour shift with these reagents.
Биуретовый реагент
Реагент Биурета состоит из гидроксида натрия (NaOH) и гидратированного сульфата меди(II), а также тартрата калия и натрия, последний из которых добавляется для хелатирования и, таким образом, стабилизации ионов меди. Реакция ионов меди с атомами азота, участвующими в пептидных связях, приводит к замещению атомов водорода пептидных связей в щелочных условиях. Три- или тетрадентатное хелатирование с атомами азота пептидной связи образует характерную окраску. Это наблюдается для дипептидов. Реагент обычно используется в биуретном анализе на белок, колориметрическом тесте, применяемом для определения концентрации белка с помощью УФ/ВИС-спектроскопии при длине волны 540 нм.
The Biuret reagent is made of sodium hydroxide (NaOH) and hydrated copper(II) sulfate, together with potassium sodium tartrate, the latter of which is added to chelate and thus stabilize the cupric ions. The reaction of the cupric ions with the nitrogen atoms involved in peptide bonds leads to the displacement of the peptide hydrogen atoms under the alkaline conditions. A tri or tetra dentate chelation with the peptide nitrogen produces the characteristic color. This is found with dipeptides. The reagent is commonly used in the biuret protein assay, a colorimetric test used to determine protein concentration by UV/VIS spectroscopy at wavelength 540 nm.
Варианты высокой чувствительности биуретового теста
В современном колориметрическом анализе пептидов обычно применяются две основные модификации биуретового анализа: анализ бицинхониновой кислоты (BCA) и анализ Лоури. В этих методах Cu+, образующийся в ходе биуретовой реакции, далее взаимодействует с другими реагентами, что приводит к более интенсивному окрашиванию. В анализе BCA Cu+ образует глубокий фиолетовый комплекс с бицинхониновой кислотой (BCA), который поглощает свет на длине волны около 562 нм, создавая характерный лиловый цвет. Водорастворимый комплекс BCA/медь поглощает значительно сильнее, чем комплекс пептид/медь, увеличивая чувствительность биуретового анализа примерно в 100 раз: анализ BCA позволяет обнаруживать белки в диапазоне концентраций от 0,0005 до 2 мг/мл. Кроме того, анализ белка BCA обладает важным преимуществом – совместимостью с веществами, такими как до 5% поверхностно-активных веществ в образцах белка. В анализе белка Лоури Cu+ окисляется обратно до Cu2+ под действием MoVI в реагенте Folin–Ciocalteu, что приводит к образованию синего молибдата (MoIV). Остатки тирозина в белке также образуют синий молибдат в этих условиях. Таким образом, белки могут быть обнаружены в концентрациях от 0,005 до 2 мг/мл. Синий молибдат, в свою очередь, способен связывать определенные органические красители, такие как малахитовый зеленый и аурамин О, что приводит к дальнейшему усилению сигнала.
Two major modifications of the biuret test are commonly applied in modern colorimetric analysis of peptides: the bicinchoninic acid (BCA) assay and the Lowry assay. In these tests, the Cu+ formed during the biuret reaction reacts further with other reagents, leading to a deeper color. In the BCA test, Cu+ forms a deep purple complex with bicinchoninic acid (BCA), which absorbs around 562 nm, producing the signature mauve color. The water soluble BCA/copper complex absorbs much more strongly than the peptide/copper complex, increasing the sensitivity of the biuret test by a factor of around 100: the BCA assay allows to detect proteins in the range of 0.0005 to 2 mg/mL). Additionally, the BCA protein assay gives the important benefit of compatibility with substances such as up to 5% surfactants in protein samples. In the Lowry protein assay Cu+ is oxidized back to Cu2+ by MoVI in the Folin–Ciocalteu reagent, which forms molybdenum blue (MoIV). Tyrosine residues in the protein also form molybdenum blue under these circumstances. In this way, proteins can be detected in concentrations between 0.005 and 2 mg/mL. Molybdenum blue in turn can bind certain organic dyes such as malachite green and Auramine O, resulting in further amplification of the signal.