ДНК-ДНК гибридизация: метод оценки генетического сходства.
DNA–DNA hybridization
ДНК-ДНК гибридизация: метод оценки генетического сходства ДНК-последовательностей в геномике. Используется в филогении, таксономии для определения родства организмов.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Техника, используемая для измерения сходства в последовательностях ДНК, ее специфическое применение в геномике.
Technique used to measure similarity in DNA sequences
the specific use in genomics
В геномике ДНК-ДНК гибридизация – это метод молекулярной биологии, измеряющий степень генетического сходства между последовательностями ДНК. Он используется для определения генетического расстояния между двумя организмами и широко применяется в филогенезе и таксономии.
In genomics, DNA–DNA hybridization is a molecular biology technique that measures the degree of genetic similarity between DNA sequences. It is used to determine the genetic distance between two organisms and has been used extensively in phylogeny and taxonomy.
Метод
ДНК одного организма маркируется, а затем смешивается с немаркированной ДНК для сравнения. Смесь инкубируется для диссоциации цепей ДНК, после чего охлаждается для формирования новых гибридных двухцепочечных молекул ДНК. Гибридные последовательности с высокой степенью сходства будут прочнее связываться и потребуют больше энергии для разделения: то есть они разделяются при нагревании до более высокой температуры, чем несхожие последовательности – этот процесс известен как "денатаурация ДНК" (или "плавление ДНК"). Для оценки профиля денатурации гибридизированной ДНК, двухцепочечную ДНК фиксируют на колонке или фильтре, а затем смесь нагревают небольшими ступенями. На каждой ступени колонка или фильтр промываются; денатурированные последовательности становятся одноцепочечными и смываются. Температура, при которой отщепляется маркированная ДНК, отражает степень сходства между последовательностями (при этом образец самогибридизации служит контролем). Эти результаты объединяют для определения степени генетического сходства между организмами. Был разработан метод гибридизации большого числа образцов ДНК с большим числом ДНК-зондов на одной мембране. Эти образцы должны быть разделены в отдельных дорожках на мембране, после чего мембрану поворачивают под другим углом для обеспечения одновременной гибридизации с множеством различных ДНК-зондов.
The DNA of one organism is labelled, then mixed with the unlabelled DNA to be compared against. The mixture is incubated to allow DNA strands to dissociate and then cooled to form renewed hybrid double stranded DNA. Hybridized sequences with a high degree of similarity will bind more firmly, and require more energy to separate them: i. e. they separate when heated at a higher temperature than dissimilar sequences, a process known as "DNA melting". To assess the melting profile of the hybridized DNA, the double stranded DNA is bound to a column or filter and the mixture is heated in small steps. At each step, the column or filter is washed; sequences that melt become single stranded and wash off. The temperatures at which labelled DNA comes off reflects the amount of similarity between sequences (and the self hybridization sample serves as a control). These results are combined to determine the degree of genetic similarity between organisms. One method was introduced for hybridizing large numbers of DNA samples against large numbers of DNA probes on a single membrane. These samples would have to be separated in their own lanes inside the membranes and then the membrane would have to be rotated to a different angle where it would result in simultaneous hybridization with many different DNA probes.
Применение
При сравнении нескольких видов значения сходства позволяют упорядочить организмы в филогенетическом дереве, что делает этот метод одним из подходов к молекулярной систематике.
When several species are compared, similarity values allow organisms to be arranged in a phylogenetic tree; it is therefore one possible approach to carrying out molecular systematics.
В микробиологии
Гибридизация ДНК-ДНК (DDH) используется как основной метод для различения бактериальных видов, поскольку их точная визуальная классификация затруднена. Этот метод не получил широкого распространения применительно к более крупным организмам, у которых различия между видами легче идентифицировать. В конце 1900-х годов штаммы считались принадлежащими к одному и тому же виду, если значение сходства ДНК-ДНК превышало 70%, а температуры плавления отличались не более чем на 5 °C. В 2014 году для разделения бактериальных подвидов был предложен порог сходства в 79%. DDH является распространенным методом для бактерий, но он трудоемок, склонен к ошибкам и технически сложен. В 2004 году была описана новая методика DDH, использующая микропластинки и колориметрически меченную ДНК для сокращения времени и увеличения количества обрабатываемых образцов. Эта новая методика DDH стала стандартом в бактериальной таксономии.
DNA–DNA hybridization (DDH) is used as a primary method to distinguish bacterial species as it is difficult to visually classify them accurately. This technique is not widely used on larger organisms where differences in species are easier to identify. In the late 1900s, strains were considered to belong to the same species if they had a DNA–DNA similarity value greater than 70% and their melting temperatures were within 5 °C of each other. In 2014, a threshold of 79% similarity has been suggested to separate bacterial subspecies. DDH is a common technique for bacteria, but it is labor intensive, error prone, and technically challenging. In 2004, a new DDH technique was described. This technique utilized microplates and colorimetrically labelled DNA to decrease the time needed and increase the amount of samples that can be processed. This new DDH technique became the standard for bacterial taxonomy.
В зоологии
Чарльз Сибли и Джон Ахквист, пионеры данной методики, использовали ДНК-ДНК гибридизацию для изучения филогенетических связей птиц (таксономия Сибли — Ахквиста) и приматов.
Charles Sibley and Jon Ahlquist, pioneers of the technique, used DNA–DNA hybridization to examine the phylogenetic relationships of avians (the Sibley–Ahlquist taxonomy) and primates.
В радиоактивности
В 1969 году Мэри Лу Пардью и Джозеф Г. Галл в Йельском университете использовали один из таких методов, основанный на радиоактивности, который заключался в гибридизации радиоактивной пробной ДНК в растворе со стационарной ДНК цитологического препарата, а обнаружение осуществлялось методом авторадиографии.
In 1969, one such method was performed by Mary Lou Pardue and Joseph G. Gall at the Yale University through radioactivity where it involved the hybridization of a radioactive test DNA in solution to the stationary DNA of a cytological preparation, which is identified as autoradiography.
Замена путем секвенирования генома
Критики утверждают, что метод неточен при сравнении близкородственных видов, поскольку любая попытка измерения различий между ортологическими последовательностями у разных организмов затрудняется гибридизацией паралогических последовательностей внутри генома одного организма. В настоящее время секвенирование ДНК и вычислительное сравнение последовательностей обычно используются для определения генетического расстояния, хотя данный метод все еще применяется в микробиологии для идентификации бактерий.
Critics argue that the technique is inaccurate for comparison of closely related species, as any attempt to measure differences between orthologous sequences between organisms is overwhelmed by the hybridization of paralogous sequences within an organism's genome. DNA sequencing and computational comparisons of sequences is now generally the method for determining genetic distance, although the technique is still used in microbiology to help identify bacteria.
Методы in silico
Современный подход заключается в проведении ДНК-ДНК гибридизации in silico с использованием полностью или частично секвенированных геномов. GGDC и TYGS, разработанные в DSMZ, являются наиболее точными известными инструментами для расчета значений, аналогичных DDH. Судебная комиссия Международного комитета по систематике прокариотов признала dDDH таксономическим критерием.
The modern approach is to carry out DNA–DNA hybridization in silico utilizes completely or partially sequenced genomes. The GGDC and TYGS developed at DSMZ are the most accurate known tools for calculating DDH analogous values. The Judicial Commission of International Committee on Systematics of Prokaryotes has admitted dDDH as taxonomic evidence.