Криобиология: изучение жизни при низких температурах

Введение

Криобиология — это раздел биологии, изучающий влияние низких температур на живые организмы в криосфере Земли или в научных исследованиях. Слово «криобиология» происходит от греческих слов κρύος [kryos] — «холод», βίος [bios] — «жизнь» и λόγος [logos] — «слово». На практике криобиология изучает биологический материал или системы при температурах ниже нормальных. Объектами изучения могут быть белки, клетки, ткани, органы или целые организмы. Температуры могут варьироваться от умеренно гипотермических до криогенных.

Области исследования

Можно выделить по крайней мере шесть основных областей криобиологии: 1) изучение адаптации к холоду микроорганизмов, растений (морозостойкости) и животных, как беспозвоночных, так и позвоночных (включая спячку), 2) криоконсервация клеток, тканей, гамет и эмбрионов животного и человеческого происхождения для (медицинских) целей длительного хранения путем охлаждения до температуры ниже точки замерзания воды. Это обычно требует добавления веществ, защищающих клетки при замораживании и оттаивании (криопротекторы), 3) сохранение органов в условиях гипотермии для трансплантации, 4) лиофилизация (сублимационная сушка) фармацевтических препаратов, 5) криохирургия – (минимально) инвазивный метод разрушения патологических тканей с использованием криогенных газов/жидкостей, и 6) физика переохлаждения, нуклеации/роста льда и механико-инженерные аспекты теплопередачи при охлаждении и нагревании, применимые к биологическим системам. Криобиология также включает крионику – низкотемпературное сохранение людей и млекопитающих с намерением их будущего оживления, хотя это не является частью общепринятой криобиологии и в значительной степени зависит от спекулятивных технологий, которые еще предстоит разработать. Ряд этих областей исследования опираются на криогенику – область физики и техники, изучающую производство и применение сверхнизких температур.

Криоконсервация в природе

Многие живые организмы способны переносить продолжительные периоды времени при температурах ниже точки замерзания воды. Большинство живых организмов накапливают криопротекторы, такие как антинуклеативные белки, полиолы и глюкоза, для защиты от повреждений, вызываемых острыми кристаллами льда. Большинство растений, в частности, могут безопасно выдерживать температуры от −4 °C до −12 °C.

Бактерии

По сообщениям, три вида бактерий – Carnobacterium pleistocenium, Chryseobacterium greenlandensis и Herminiimonas glaciei – были успешно возрождены после тысяч лет, проведенных в замороженном состоянии в льду. Некоторые бактерии, в частности Pseudomonas syringae, производят специализированные белки, которые выступают в роли мощных центров кристаллизации льда, используя их для стимулирования образования льда на поверхности различных фруктов и растений при температуре около -2 °C. Замораживание вызывает повреждения эпителия и делает питательные вещества, содержащиеся в нижележащих тканях растений, доступными для бактерий. Listeria растет медленно при температурах до 1,5 °C и некоторое время сохраняется в замороженных продуктах.

Растения

Многие растения проходят процесс, называемый закаливанием, который позволяет им выдерживать температуры ниже 0 °C в течение недель или месяцев.

Беспозвоночные

Нематоды, выживающие при температурах ниже 0 °C, включают Trichostrongylus colubriformis и Panagrolaimus davidi. Нимфы тараканов (Periplaneta japonica) выдерживают кратковременное замораживание при 6–8 °C. Красный плоский короед (Cucujus clavipes) способен выжить после замораживания до -150 °C. Грибной комарик Exechia nugatoria может выжить после замораживания до -50 °C благодаря уникальному механизму, при котором кристаллы льда образуются в теле, но не в голове. Еще один морозостойкий жук – Upis ceramboides. Подробнее о зимней экологии насекомых и антифризных белках. Еще одно беспозвоночное, кратковременно переносящее температуры до -273 °C, – это тихоходки. Личинки нематоды Haemonchus contortus могут выживать 44 недели при замораживании при -196 °C.

Позвоночные

Зимой до 45% тела лесной лягушки (Rana sylvatica) может замерзнуть и превратиться в лёд. «Кристаллы льда образуются под кожей и проникают в скелетные мышцы тела. Во время замерзания дыхание, кровоток и сердцебиение лягушки прекращаются. Замерзание становится возможным благодаря специализированным белкам и глюкозе, которые предотвращают внутриклеточное замерзание и обезвоживание». Лесная лягушка может выжить до 11 дней в замороженном состоянии при 4 °C. Другие позвоночные, способные выживать при температуре тела ниже 0 °C, включают крашеных черепах (Chrysemys picta), серых древесных лягушек (Hyla versicolor), лягушек-боров (Rana arvalis), коробчатых черепах (Terrapene carolina) – 48 часов при 2 °C, весеннего квакуша (Pseudacris crucifer), обыкновенных ужей (Thamnophis sirtalis) – 24 часа при 1,5 °C, хоровую лягушку (Pseudacris triseriata), сибирскую саламандру (Salamandrella keyserlingii) – 24 часа при 15,3 °C, европейскую живородящую ящерицу (Lacerta vivipara) и антарктических рыб, таких как Pagothenia borchgrevinki. Антифризные белки, клонированные из этих рыб, использовались для придания морозостойкости трансгенным растениям. Арктические суслики в состоянии спячки могут иметь температуру брюшной полости до −2,9 °C (26,8 °F), поддерживая температуру ниже нуля в течение более трех недель, хотя температура в области головы и шеи остается на уровне 0 °C или выше.

Исторический фон

История криобиологии восходит к древности. Еще в 2500 году до н.э. низкие температуры использовались в медицине Египта. Гиппократ рекомендовал использовать холод для остановки кровотечений и уменьшения отеков. С появлением современной науки Роберт Бойл изучал влияние низких температур на животных. В 1949 году команда ученых во главе с Кристофером Полджем впервые криоконсервировала бычью сперму. Это привело к значительно более широкому использованию криоконсервации, когда сегодня многие органы, ткани и клетки обычно хранятся при низких температурах. Крупные органы, такие как сердца, обычно хранятся и транспортируются для трансплантации на короткое время при прохладной, но не замерзающей температуре. Клеточные суспензии (например, кровь и сперма) и тонкие срезы тканей иногда могут храниться практически неограниченно долго при температуре жидкого азота (криоконсервация). Человеческие сперматозоиды, яйцеклетки и эмбрионы обычно хранятся в рамках исследований и лечения бесплодия. Контролируемая скорость замораживания и медленное замораживание – хорошо зарекомендовавшие себя методы, разработанные в начале 1970-х годов, которые позволили осуществить первое в мире рождение ребенка из замороженного эмбриона (Зоу Лейланд) в 1984 году. С тех пор во всем мире для изучения биологии человека, животных и клеток используются аппараты, которые замораживают биологические образцы, используя программируемые этапы или контролируемую скорость, – для лучшего сохранения образца перед его размораживанием, после чего он глубоко замораживается или криоконсервируется в жидком азоте. Такие аппараты используются для замораживания яйцеклеток, кожи, компонентов крови, эмбрионов, спермы, стволовых клеток и для общего сохранения тканей в больницах, ветеринарных клиниках и исследовательских лабораториях. Количество живорожденных детей от "медленно замороженных" эмбрионов составляет от 300 000 до 400 000, что составляет 20% от примерно 3 миллионов детей, зачатых с помощью экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Доктор Кристофер Чен (Австралия) сообщил о первой в мире беременности, полученной с использованием медленно замороженных яйцеклеток из британского аппарата с контролируемой скоростью замораживания в 1986 году. Криохирургия (преднамеренное и контролируемое разрушение тканей путем образования льда) была впервые проведена Джеймсом Арнотом в 1845 году во время операции на пациенте с раком.

Cryobiology history can be traced back to antiquity. As early as in 2500 BC, low temperatures were used in Egypt in medicine. The use of cold was recommended by Hippocrates to stop bleeding and swelling. With the emergence of modern science, Robert Boyle studied the effects of low temperatures on animals. In 1949, bull semen was cryopreserved for the first time by a team of scientists led by Christopher Polge. This led to a much wider use of cryopreservation today, with many organs, tissues and cells routinely stored at low temperatures. Large organs such as hearts are usually stored and transported, for short times only, at cool but not freezing temperatures for transplantation. Cell suspensions (like blood and semen) and thin tissue sections can sometimes be stored almost indefinitely in liquid nitrogen temperature (cryopreservation). Human sperm, eggs, and embryos are routinely stored in fertility research and treatments. Controlled rate and slow freezing are well established techniques pioneered in the early 1970s which enabled the first human embryo frozen birth (Zoe Leyland) in 1984. Since then, machines that freeze biological samples using programmable steps, or controlled rates, have been used all over the world for human, animal, and cell biology – 'freezing down' a sample to better preserve it for eventual thawing, before it is deep frozen, or cryopreserved, in liquid nitrogen. Such machines are used for freezing oocytes, skin, blood products, embryo, sperm, stem cells, and general tissue preservation in hospitals, veterinary practices, and research labs. The number of live births from 'slow frozen' embryos is some 300,000 to 400,000 or 20% of the estimated 3 million in vitro fertilized births. Dr Christopher Chen, Australia, reported the world’s first pregnancy using slow frozen oocytes from a British controlled rate freezer in 1986. Cryosurgery (intended and controlled tissue destruction by ice formation) was carried out by James Arnott in 1845 in an operation on a patient with cancer.

Методы консервации

Криобиология как прикладная наука в основном посвящена низкотемпературному хранению. Гипотермическое хранение обычно проводится при температуре выше 0 °C, но ниже нормотермической (32 °C–37 °C) температуры млекопитающих. Хранение методом криоконсервации, напротив, осуществляется в диапазоне температур от –80 до –196 °C. Органы и ткани чаще подвергаются гипотермическому хранению, в то время как одиночные клетки наиболее часто криоконсервируются. При гипотермическом хранении эмпирическое правило гласит, что каждое снижение температуры на 10 °C сопровождается уменьшением потребления кислорода на 50%. Хотя животные, впадающие в спячку, обладают адаптированными механизмами для предотвращения метаболических нарушений, связанных с гипотермией, гипотермические органы и ткани, предназначенные для трансплантации, требуют специальных консервирующих растворов для нейтрализации ацидоза, подавленной активности натриевого насоса и повышенного внутриклеточного содержания кальция. Для этих целей разработаны специальные растворы для сохранения органов, такие как Viaspan (раствор Университета Висконсина), HTK и Celsior. Эти растворы также содержат компоненты, минимизирующие повреждение свободными радикалами, предотвращающие отек и компенсирующие потерю АТФ и т. д. Криоконсервация клеток основывается на «двухфакторной гипотезе» американского криобиолога Питера Мазура, которая утверждает, что чрезмерно быстрое охлаждение приводит к гибели клеток из-за образования внутриклеточного льда, а чрезмерно медленное охлаждение – либо из-за электролитной токсичности, либо из-за механического разрушения. При медленном охлаждении лед образуется внеклеточно, что вызывает осмотический выход воды из клеток и, следовательно, их обезвоживание. Внутриклеточный лед может быть гораздо более разрушительным, чем внеклеточный. Для эритроцитов оптимальная скорость охлаждения очень высока (почти 100 °C в секунду), в то время как для стволовых клеток оптимальная скорость охлаждения очень низкая (1 °C в минуту). Криопротекторы, такие как диметилсульфоксид и глицерин, используются для защиты клеток от замораживания. Различные типы клеток защищаются 10% диметилсульфоксидом. Криобиологи стремятся оптимизировать концентрацию криопротектора (минимизируя как образование льда, так и токсичность) и скорость охлаждения. Клетки могут охлаждаться с оптимальной скоростью до температуры от –30 до –40 °C, прежде чем их погружают в жидкий азот. Методы медленного охлаждения основаны на том, что клетки содержат мало нуклеаторов, но содержат естественным образом встречающиеся стеклообразующие вещества, которые могут предотвратить образование льда в умеренно обезвоженных клетках. Некоторые криобиологи ищут смеси криопротекторов для полного остекления (нулевого образования льда) при сохранении клеток, тканей и органов. Методы остекления представляют собой проблему, поскольку требуют поиска криопротекторных смесей, способных минимизировать токсичность.

Cryobiology as an applied science is primarily concerned with low temperature preservation. Hypothermic storage is typically above 0 °C but below normothermic (32 °C to 37 °C) mammalian temperatures. Storage by cryopreservation, on the other hand, will be in the −80 to −196 °C temperature range. Organs, and tissues are more frequently the objects of hypothermic storage, whereas single cells have been the most common objects cryopreserved. A rule of thumb in hypothermic storage is that every 10 °C reduction in temperature is accompanied by a 50% decrease in oxygen consumption. Although hibernating animals have adapted mechanisms to avoid metabolic imbalances associated with hypothermia, hypothermic organs, and tissues being maintained for transplantation require special preservation solutions to counter acidosis, depressed sodium pump activity. and increased intracellular calcium. Special organ preservation solutions such as Viaspan (University of Wisconsin solution), HTK, and Celsior have
been designed for this purpose. These solutions also contain ingredients to minimize damage by free radicals, prevent edema, compensate for ATP loss, etc. Cryopreservation of cells is guided by the "two factor hypothesis" of American cryobiologist Peter Mazur, which states that excessively rapid cooling kills cells by intracellular ice formation and excessively slow cooling kills cells by either electrolyte toxicity or mechanical crushing. During slow cooling, ice forms extracellularly, causing water to osmotically leave cells, thereby dehydrating them. Intracellular ice can be much more damaging than extracellular ice. For red blood cells, the optimum cooling rate is very rapid (nearly 100 °C per second), whereas for stem cells the optimum cooling rate is very slow (1 °C per minute). Cryoprotectants, such as dimethyl sulfoxide and glycerol, are used to protect cells from freezing. A variety of cell types are protected by 10% dimethyl sulfoxide. Cryobiologists attempt to optimize cryoprotectant concentration (minimizing both ice formation and toxicity) and cooling rate. Cells may be cooled at an optimum rate to a temperature between −30 and −40 °C before being plunged into liquid nitrogen. Slow cooling methods rely on the fact that cells contain few nucleating agents, but contain naturally occurring vitrifying substances that can prevent ice formation in cells that have been moderately dehydrated. Some cryobiologists are seeking mixtures of cryoprotectants for full vitrification (zero ice formation) in preservation of cells, tissues, and organs. Vitrification methods pose a challenge in the requirement to search for cryoprotectant mixtures that can minimize toxicity.

У людей

Гаметы человека и эмбрионы из двух, четырех и восьми клеток могут выживать при криоконсервации при 196 °C в течение 10 лет в хорошо контролируемых лабораторных условиях. Криоконсервация при лечении бесплодия у людей включает в себя сохранение эмбрионов, сперматозоидов или яйцеклеток путем замораживания. Зачатие in vitro осуществляется путем размораживания сперматозоидов и введения их в "свежие" яйцеклетки, либо размораживания замороженных яйцеклеток и помещения сперматозоидов вместе с ними, после чего их помещают в матку, либо введения замороженного эмбриона в матку. Витрификация имеет недостатки и не является такой же надежной и проверенной, как замораживание оплодотворенных сперматозоидов, яйцеклеток или эмбрионов традиционными методами медленного замораживания, поскольку сами яйцеклетки чрезвычайно чувствительны к температуре. Многие исследователи также замораживают ткань яичников вместе с яйцеклетками в надежде, что эту ткань можно будет пересадить обратно в матку для стимуляции нормальных овуляторных циклов. В 2004 году Доннез из Лувена (Бельгия) сообщила о первом успешном рождении ребенка после трансплантации замороженной ткани яичников. В 1997 году у женщины с лимфомой Ходжкина были взяты образцы коры яичников, криоконсервированы в аппарате с контролируемой скоростью заморозки (Planer, Великобритания) и затем сохранены в жидком азоте. Химиотерапия была начата после развития у пациентки преждевременной недостаточности яичников. В 2003 году после размораживания и оттаивания была проведена ортотопная автотрансплантация коры яичников лапароскопическим путем, и через пять месяцев признаки реимплантации свидетельствовали о восстановлении регулярных овуляторных циклов. Через одиннадцать месяцев после реимплантации была подтверждена жизнеспособная внутриматочная беременность, в результате которой родилась девочка по имени Тамара. Терапевтическая гипотермия, например, во время операций на сердце, проводимых на "холодном" сердце (достигаемом холодным перфузионным охлаждением без образования льда), позволяет проводить более длительные операции и улучшает показатели выздоровления пациентов.

Научные общества

Общество криобиологии было основано в 1964 году для объединения специалистов в области биологии, медицины и физических наук, разделяющих общий интерес к воздействию низких температур на биологические системы. По состоянию на 2007 год в Обществе криобиологии насчитывалось около 280 членов со всего мира, половина из которых базировалась в США. Целью Общества является содействие научным исследованиям в области биологии низких температур, углубление научного понимания в этой области, а также распространение и применение этих знаний на благо человечества. Общество требует от всех своих членов соблюдения высочайших этических и научных стандартов в профессиональной деятельности. Согласно уставу Общества, в членстве может быть отказано кандидатам, чье поведение считается наносящим вред Обществу; в 1982 году устав был изменен, чтобы явно исключить "любую практику или применение замораживания умерших людей в надежде на их реанимацию", несмотря на возражения некоторых членов, являвшихся крионистами, таких как Джерри Лиф. Общество организует ежегодную научную конференцию, посвященную всем аспектам биологии низких температур. Эта международная конференция предоставляет возможности для представления и обсуждения новейших исследований в криобиологии, а также для углубленного изучения конкретных аспектов посредством симпозиумов и семинаров. Члены Общества также информируются о новостях и предстоящих мероприятиях через информационный бюллетень Общества, "Новости". В 2011–2012 годах президентом Общества криобиологии был Джон Х. Кроу. Общество биологии низких температур было основано в 1964 году и зарегистрировано как благотворительная организация в 2003 году с целью содействия исследованиям воздействия низких температур на все типы организмов, их клетки, ткани и органы. По состоянию на 2006 год в Обществе насчитывалось около 130 членов (в основном британских и европейских), и проводилось как минимум одно ежегодное общее собрание. Программа обычно включает симпозиум по актуальной теме и секцию свободных докладов по любому аспекту биологии низких температур. Недавние симпозиумы были посвящены долгосрочной стабильности, сохранению водных организмов, криоконсервации эмбрионов и гамет, сохранению растений, низкотемпературной микроскопии, витрификации (образованию стекла в водных системах при охлаждении), лиофилизации и хранению тканей. Члены Общества получают информацию через информационный бюллетень Общества, который в настоящее время издается три раза в год.

The Society for Cryobiology was founded in 1964 to bring together those from the biological, medical, and physical sciences who have a common interest in the effects of low temperatures on biological systems. As of 2007, the Society for Cryobiology had about 280 members from around the world, and one half of them are US based. The purpose of the Society is to promote scientific research in low temperature biology, to improve scientific understanding in this field, and to disseminate and apply this knowledge to the benefit of mankind. The Society requires of all its members the highest ethical and scientific standards in the performance of their professional activities. According to the Society's bylaws, membership may be refused to applicants whose conduct is deemed detrimental to the Society; in 1982, the bylaws were amended explicitly to exclude "any practice or application of freezing deceased persons in the anticipation of their reanimation", over the objections of some members who were cryonicists, such as Jerry Leaf. The Society organizes an annual scientific meeting dedicated to all aspects of low temperature biology. This international meeting offers opportunities for presentation and discussion of the most up to date research in cryobiology, as well as reviewing specific aspects through symposia and workshops. Members are also kept informed of news and forthcoming meetings through the Society newsletter, News Notes. The 2011–2012 president of the Society for Cryobiology was John H. Crowe. The Society for Low Temperature Biology was founded in 1964 and became a registered charity in 2003 with the purpose of promoting research into the effects of low temperatures on all types of organisms and their constituent cells, tissues, and organs. As of 2006, the society had around 130 (mostly British and European) members and holds at least one annual general meeting. The program usually includes both a symposium on a topical subject and a session of free communications on any aspect of low temperature biology. Recent symposia have included long term stability, preservation of aquatic organisms, cryopreservation of embryos and gametes, preservation of plants, low temperature microscopy, vitrification (glass formation of aqueous systems during cooling), freeze drying and tissue banking. Members are informed through the Society Newsletter, which is presently published three times a year.

Журналы

Криобиология (издатель: Elsevier) является ведущим научным изданием в этой области, публикующим около 60 рецензируемых статей ежегодно. Статьи посвящены любым аспектам биологии и медицины низких температур (например, замораживанию, лиофилизации, гибернации, холодостойкости и адаптации, криопротекторам, медицинскому применению пониженных температур, криохирургии, гипотермии и перфузии органов). Cryo Letters – независимый британский журнал оперативной информации, публикующий статьи о воздействии низких температур на широкий спектр биофизических и биологических процессов, а также исследования с использованием низкотемпературных методов в изучении биологических и экологических проблем. Biopreservation and Biobanking (ранее Cell Preservation Technology) – это рецензируемый ежеквартальный научный журнал, издаваемый Mary Ann Liebert, Inc., посвященный широкому спектру технологий сохранения, включая криоконсервацию, сухое состояние (ангидробиоз), стекловидное состояние и гипотермическое хранение. Cell Preservation Technology было переименовано в Biopreservation and Biobanking и является официальным журналом Международного общества биологических и экологических репозиториев. Проблемы криобиологии и криомедицины (ранее "Криобиология" (1985–1990) и "Проблемы криобиологии" (1991–2012)) – издание Института проблем криобиологии и криомедицины. Журнал охватывает все вопросы, связанные с биологией, медициной и инженерией низких температур.