Обратный захват нейротрансмиттеров: механизмы и транспортные белки.

Введение

Реабсорбция нейротрансмиттера транспортером нейротрансмиттера

Реабсорбция (или обратный захват) – это процесс реабсорбции нейротрансмиттера транспортером нейротрансмиттера, расположенным вдоль плазменной мембраны аксонового терминала (то есть предсинаптического нейрона в синапсе) или глиальной клетки после выполнения функции передачи нервного импульса. Обратный захват необходим для нормальной синаптической физиологии, поскольку он обеспечивает переработку нейротрансмиттеров и регулирует их концентрацию в синапсе, тем самым контролируя продолжительность сигнала, вызванного высвобождением нейротрансмиттера. Поскольку нейротрансмиттеры слишком велики и гидрофильны, чтобы диффундировать через мембрану, для их реабсорбции необходимы специфические транспортные белки. Проведено множество биохимических и структурных исследований для выяснения механизма обратного захвата.

Структура белка

Первая первичная последовательность белка обратного захвата была опубликована в 1990 году. Метод определения последовательности белка основывался на очистке, секвенировании и клонировании соответствующего белка-транспортера или стратегиях экспрессионного клонирования, в которых транспортная функция использовалась в качестве анализа для видов кДНК, кодирующих этот транспортер. После разделения было обнаружено множество сходств между двумя последовательностями ДНК. Дальнейшие исследования в области белков обратного захвата показали, что многие транспортеры, связанные с важными нейротрансмиттерами в организме, также очень похожи по последовательности на транспортеры ГАМК и норэпинефрина. В этот новый класс входят транспортеры дофамина, норэпинефрина, серотонина, глицина, пролина и ГАМК. Они были названы Na+/Cl−-зависимыми транспортерами нейротрансмиттеров. Зависимость от ионов натрия и хлорида будет обсуждаться далее в описании механизма действия. На основе общих черт в последовательностях и анализа гидрофобности было предсказано наличие 12 гидрофобных трансмембранных доменов в «классическом» семействе транспортеров. Кроме того, N- и C-концы расположены во внутриклеточном пространстве. Эти белки также имеют протяженную внеклеточную петлю между третьей и четвертой трансмембранными последовательностями. Эксперименты по направленной химической модификации подтвердили предсказанную топологическую организацию серотонинового транспортера. Помимо транспортеров нейротрансмиттеров, аналогичные последовательности были обнаружены у многих других белков как у животных, так и у прокариот, что указывает на более широкое семейство симпортеров нейротрансмиттеров и натрия (NSS). Один из этих белков, LeuT, из *Aquifex aeolicus*, был кристаллизован Ямашитой и соавторами с очень высоким разрешением, что позволило увидеть молекулу лейцина и два иона Na+, связанных вблизи центра белка. Было обнаружено, что трансмембранные (ТМ) спирали 1 и 6 содержат развернутые сегменты в середине мембраны. Вместе с этими двумя спиралями, ТМ-спирали 3 и 8, а также области, окружающие развернутые участки спиралей 1 и 6, формируют сайты связывания субстрата и ионов натрия. Кристаллическая структура выявила псевдосимметрию в LeuT, при которой структура ТМ-спиралей 1–5 отражается в структуре спиралей 6–10. В белке имеется внеклеточная полость, в которую выступает спиральная шпилька, образованная внеклеточной петлей EL4. В ТМ1 аспартат отличает моноаминовые NSS-транспортеры от аминокислотных транспортеров, содержащих глицин в той же позиции. Внешние и внутренние «ворота» были отнесены к парам отрицательно и положительно заряженных аминокислотных остатков во внеклеточной полости и вблизи цитоплазматических концов ТМ-спиралей 1 и 8.

The first primary sequence of a reuptake protein was published in 1990. The technique for protein sequence determination relied upon the purification, sequencing, and cloning of the transporter protein in question, or expression cloning strategies in which transport function was used as an assay for cDNA species coding for that transporter. After separation, it was realized that there were many similarities between the two DNA sequences. Further exploration in the field of reuptake proteins found that many of the transporters associated with important neurotransmitters within the body were also very similar in sequence to the GABA and norepinephrine transporters. The members of this new family include transporters for dopamine, norepinephrine, serotonin, glycine, proline and GABA. They were called Na+/Cl− dependent neurotransmitter transporters. Sodium and chloride ion dependence will be discussed later in the mechanism of action. Using the commonalities among sequences and hydropathy plot analyses, it was predicted that there are 12 hydrophobic membrane spanning regions in the 'Classical' transporter family. In addition to this, the N and C termini exist in the intracellular space. These proteins also all have an extended extracellular loop between the third and fourth transmembrane sequences. Site directed chemical labeling experiments verified the predicted topological organization of the serotonin transporter. In addition to neurotransmitter transporters, many other proteins in both animals and prokaryotes were found with similar sequences, indicating a larger family of Neurotransmitter: Sodium Symporters (NSS). One of these proteins, LeuT, from Aquifex aeolicus, was crystallized by Yamashita et al. with very high resolution, revealing a molecule of leucine and two Na+ ions bound near the center of the protein. They found that the transmembrane (TM) helices 1 and 6 contained unwound segments in the middle of the membrane. Along with these two helices, TM helices 3 and 8 and the areas surrounding the unwound sections of 1 and 6 formed the substrate and sodium ion binding sites. The crystal structure revealed pseudo symmetry in LeuT, in which the structure of TM helices 1 5 is reflected in the structure of helices 6–10. There is an extracellular cavity in the protein, into which protrudes a helical hairpin formed by extracellular loop EL4. In TM1, an aspartate distinguishes monoamine NSS transporters from amino acid transporters which contain a glycine at the same position. External and internal "gates" were assigned to pairs of negatively and positively charged residues in the extracellular cavity and near the cytoplasmic ends of TM helices 1 and 8.

Механизм действия

Классические белки-транспортеры используют трансмембранные ионные градиенты и электрический потенциал для транспортировки нейротрансмиттеров через мембрану пресинаптического нейрона. Типичные нейротрансмиттерные симпортеры натрия (НСС), зависимые от ионов Na+ и Cl−, используют как градиент Na+, так и градиент Cl−, направленные внутрь клетки. Ионы движутся по своим градиентам концентрации, во многих случаях вызывая трансмембранное перемещение заряда, которое усиливается мембранным потенциалом. Эти силы втягивают субстрат нейротрансмиттера в клетку, даже против его собственного градиента концентрации. На молекулярном уровне ионы Na+ стабилизируют связывание аминокислот в месте связывания субстрата, а также поддерживают транспортер в конформации, открытой наружу, что позволяет связываться с субстратом. Предполагается, что роль иона Cl− в механизме симпорта заключается в стабилизации заряда симпортируемого Na+. После связывания ионов и субстрата должно произойти некоторое конформационное изменение. На основе конформационных различий между структурой ТМ1-5 и ТМ6-10, а также идентификации пути прохождения субстрата между местом связывания SERT и цитоплазмой, был предложен механизм конформационного изменения, в котором четырехспиральный пучок, состоящий из ТМ1, ТМ2, ТМ6 и ТМ7, меняет свою ориентацию внутри остальной части белка. Структура LeuT во внутренней открытой конформации впоследствии показала, что основным компонентом конформационного изменения является перемещение этого пучка относительно остальной части белка.

Механизм ингибирования обратного поглощения

Основная цель ингибитора обратного захвата – значительно снизить скорость реабсорбции нейротрансмиттеров в пресинаптический нейрон, увеличивая концентрацию нейротрансмиттера в синапсе. Это усиливает связывание нейротрансмиттеров с пре- и постсинаптическими рецепторами. В зависимости от задействованной нейронной системы, ингибитор обратного захвата может оказывать существенное влияние на когнитивные функции и поведение. Неконкурентное ингибирование бактериального гомолога LeuT трициклическими антидепрессантами происходит вследствие связывания этих ингибиторов в канале внеклеточной проницаемости. Однако конкурентный характер ингибирования транспорта серотонина антидепрессантами указывает на то, что в транспортерах нейротрансмиттеров они связываются в участке, перекрывающемся с субстратным центром.

Системы человека

Хоршиц и др. исследовали селективность ингибиторов обратного захвата серотонина среди белка обратного захвата серотонина (SERT) крысы, экспрессированного в клетках почек эмбриона человека (HEK SERT). Они воздействовали на SERT различными дозами циталопрама (СИОЗС) или дезипрамина (ингибитор белка обратного захвата норадреналина, NET). Изучив кривые «доза-ответ» (используя обычную среду в качестве контроля), они количественно оценили, что циталопрам действует на SERT как СИОЗС, а дезипрамин не оказывает влияния на SERT. В отдельном эксперименте Хоршиц и др. подвергали HEK SERT длительному воздействию циталопрама. Они заметили, что длительное воздействие приводило к снижению регуляции связывающих участков. Эти результаты указывают на возможный механизм долгосрочных изменений в пресинаптических нейронах после медикаментозной терапии. Хоршиц и др. обнаружили, что после удаления циталопрама из системы нормальный уровень экспрессии связывающих участков SERT восстанавливался. Это усиливает серотониновую сигнализацию, которая, согласно гипотезе, повышает настроение и, таким образом, облегчает симптомы депрессии. Данное предположение относительно антидепрессивного механизма ингибиторов обратного захвата серотонина не учитывает временные рамки терапевтического эффекта, который развивается в течение недель или месяцев, в то время как ингибирование транспортера происходит практически мгновенно. Общий эффект применения амфетамина (AMPH) заключается в увеличении концентрации дофамина, норадреналина и серотонина в синапсе. Показано, что AMPH воздействует на следовой аминоассоциированный рецептор 1 (TAAR1), индуцируя высвобождение и ингибирование обратного захвата серотонина, норадреналина и дофамина. Для этого требуется ко-локализация (совместное нахождение) транспортера и TAAR1 в одном нейроне.

Нейропротекторная роль

Астроциты, по-видимому, используют механизмы обратного захвата для нейропротекции. Астроциты используют возбуждающий аминокислотный транспортер 2 (EAAT2, также известный как GLT-1) для удаления глутамата из синапса. Мыши с нокаутом по гену EAAT2 были более подвержены летальным и спонтанным судорогам, а также острым повреждениям мозга в коре головного мозга. Эти эффекты могли быть связаны с повышенной концентрацией глутамата в мозге мышей с нокаутом по гену EAAT2, выявленной при посмертном анализе.