Альфа-аманитин: структура, свойства и методы обнаружения

Введение

Химическое соединение

α-Аманитин (альфа-аманитин) — это циклический пептид, состоящий из восьми аминокислот. Он, возможно, является самым смертоносным из всех аматоксинов — токсинов, содержащихся в нескольких видах грибов рода Amanita, включая бледную поганку (Amanita phalloides), а также в комплексе видов, известных как "разрушительные ангелы", главным образом A. virosa и A. bisporigera. Он также встречается в грибах Galerina marginata и Conocybe filaris. Смертельная доза аманитина для крыс составляет 100 мкг/кг. В отличие от большинства циклических пептидов, аматоксины (и фаллотоксины) синтезируются на рибосомах. Гены, кодирующие пропротеин α-аманитина, принадлежат к тому же семейству, что и гены, кодирующие фаллацидин (фалотоксин).

Научное использование

Аманитин является селективным ингибитором РНК-полимеразы II и III, но не I. Этот механизм обуславливает его смертельную токсичность. Аманитин также может быть использован для определения типов присутствующих РНК-полимераз. Это достигается путем тестирования чувствительности полимеразы в присутствии α-аманитина. РНК-полимераза I нечувствительна, РНК-полимераза II обладает высокой чувствительностью (ингибируется при 1 мкг/мл), РНК-полимераза III – умеренной чувствительностью (ингибируется при 10 мкг/мл), а РНК-полимераза IV – незначительной чувствительностью (ингибируется при 50 мкг/мл).

Химическая структура

α-аманитин – сильно модифицированный бициклический октапептид, состоящий из внешней и внутренней петли. Внешняя петля формируется пептидными связями между карбоксильным концом одной аминокислоты и последующим аминоконцом следующего остатка. Внутренняя петля замкнута триптатионовой связью между 6-гидрокситриптофаном и цистеином. Кроме того, α-аманитин содержит модифицированные боковые цепи аминокислот – (2S,3R,4R)-4,5-дигидроксиизолейцин и транс-4-гидроксипролин, что обуславливает его высокое сродство к РНК-полимеразам II и III.

Методы обнаружения

Ранние методы обнаружения альфа-аманитина включали тонкослойную хроматографию (ТЛХ). В большинстве используемых в ТЛХ растворительных систем альфа-аманитин и бета-аманитин перемещались с разной скоростью, что позволяло идентифицировать каждый токсин по отдельности. Другим ранним методом был тест Мейкснера (также известный как тест Виланда), который обнаруживал аматоксины, но также давал ложноположительные результаты для некоторых соединений, таких как псилоцин. Капиллярный электрофорез также был разработан, но его чувствительности было недостаточно для клинических образцов, хотя он был достаточен для экстрактов грибов. В последнее время предпочтительным методом стало использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), обеспечивающей лучшее разрешение, воспроизводимость и более высокую чувствительность. С ВЭЖХ можно использовать различные детекторы, такие как УФ-детектор или масс-спектрометрия. Еще в 1980-х годах были разработаны иммуноанализы на основе антител для аманитина (однако чаще они распознают аматоксины, поскольку антитела перекрестно реагируют с некоторыми аналогами). Первыми иммуноанализами были радиоиммуноанализы, а затем иммуноферментные анализы (ИФА). Совсем недавно, в 2020 году, был разработан иммуноанализ на основе моноклональных антител с боковым потоком (подобный тесту на беременность), который позволяет быстро и селективно обнаруживать аматоксины в грибах и образцах мочи.

Общий синтез

Матинху и соавторы разработали стратегии преодоления трех синтетических препятствий для получения α-аманитина в 2018 году. Во-первых, энантиоселективный синтез, совместимый с пептидным синтезом на твердой фазе, (2S,3R,4R)-4,5-дигидроксиизолейцина был осуществлен за 11 стадий из 2-(бензилокси)ацетальдегида. Два ключевых этапа, определяющих стереохимию, включают кротильное присоединение по Брауну в (3R,4R)-положения и асимметричный синтез аминокислот Стрекера в (2S)-α-положении. Во-вторых, химиоселективное замыкание внутреннего кольца посредством фторциклизации между 6-гидрокситриптофаном и цистеином было достигнуто внутримолекулярной реакцией Savige Fontana. Это требует совместимости с пептидным синтезом на твердой фазе и использования метилиминодиацетата (MIDA) – защитной группы бора, ортогональной аминокислоты – в 5 стадий. Первые эффекты отмечаются в течение 10 часов; однако, значительные эффекты часто проявляются не ранее чем через 24 часа после приема внутрь, и эта задержка симптомов затрудняет диагностику отравления α-аманитином и делает его еще более опасным. К тому времени уже слишком поздно для эффективной промывки желудка. Первыми симптомами являются диарея и спазмы, но они проходят, создавая ложное впечатление о выздоровлении. Обычно на 4-е или 5-е сутки токсин начинает оказывать серьезное воздействие на печень и почки, приводя к полиорганной недостаточности. Смерть обычно наступает около недели после приема яда. Примерно 15% отравившихся умирают в течение 10 дней, проходя через коматозную стадию, затем почечную и печеночную недостаточность, печеночную кому, дыхательную недостаточность и, в конечном итоге, смерть. Выздоравливающие подвержены риску стойкого повреждения печени. Диагностика затруднена и основывается на наблюдении клинических симптомов, а также на обнаружении α-аманитина в моче. Анализ мочи наиболее информативен в течение 48 часов после приема яда. Лечение в основном поддерживающее (промывание желудка, активированный уголь, инфузионная терапия), но включает различные препараты для нейтрализации аматоксинов, такие как внутривенный пенициллин и производные цефалоспорина, а в тяжелых случаях может потребоваться ортотопная трансплантация печени. Наиболее надежный метод лечения отравления аманитином – промывание желудка сразу после приема яда; однако, начало симптомов обычно наступает слишком поздно для его применения. Химически модифицированный силибинин, дигидрогендисукцинат силибинина натрия (торговое название Legalon SIL) – раствор для внутривенного введения – используется при лечении тяжелых интоксикаций гепатотоксическими веществами, такими как парацетамол и аманитины.

Matinkhoo et al. devised strategies to surmount three synthetic hurdles to give α amanitin in 2018. First, enantioselective synthesis of solid phase peptide synthesis compatible (2S,3R,4R) 4,5 dihydroxyisoleucine was afforded in 11 steps from 2 (benzyloxy)acetaldehyde. Two key stereochemistry defining steps include Brown crotylation at (3R,4R) positions, and asymmetric Strecker amino acid synthesis at the (2S) α carbon. Secondly, chemoselective inner ring closure by fluorocyclization between 6 hydroxytrytophan and cysteine was achieved by intra annular Savige Fontana reaction. This requires a solid phase peptide synthesis compatible, and methyliminodiacetic acid (MIDA), a boron protecting group, orthogonal amino acid in 5 steps. Few effects are reported within 10 hours; it is not unusual for significant effects to take as long as 24 hours after ingestion to appear, with this delay in symptoms making α amanitin poisoning even more difficult to diagnose and all the more dangerous. By then, it is far past the time in which stomach pumping would yield an efficient result. Diarrhea and cramps are the first symptoms, but those pass, giving a false sign of remission. Typically, on the 4th to 5th day, the toxin starts to have severe effects on the liver and kidneys, leading to total system failure in both. Death usually takes place around a week from ingestion. Around 15% of those poisoned will die within 10 days, progressing through a comatose stage to kidney failure, liver failure, hepatic coma, respiratory failure and death. Those who recover are at risk of permanent liver damage. Diagnosis is difficult, and is established by observation of the clinical symptoms as well as the presence of α amanitin in the urine. Urine screening is generally most useful within 48 hours of ingestion. Treatment is mainly supportive (gastric lavage, activated carbon, fluid resuscitation) but includes various drugs to counter the amatoxins, including intravenous penicillin and cephalosporin derivatives, and, in cases of greater ingestion, can extend to an orthotopic liver transplant. The most reliable method to treat amanitin poisoning is through gastric lavage immediately after ingestion; however, the onset of symptoms is generally too late for this to be an option. Chemically modified silibinin, silibinin dihydrogen disuccinate disodium (trade name Legalon SIL) a solution for IV administration, is used in treatment of severe intoxications with hepatotoxic substances such as paracetamol and amanitins.

Способ ингибирующего действия

[[Изображение:Альфа-аманитинРНК-полимераза II комплекс 1К83. png|мини|α-Аманитин (красный), связанный с РНК-полимеразой II из Saccharomyces cerevisiae (пивных дрожжей). Это взаимодействие препятствует транслокации РНК и ДНК, необходимой для освобождения активного центра для следующего раунда синтеза РНК. Добавление α-аманитина может снизить скорость транслокации поли II по ДНК с нескольких тысяч до нескольких нуклеотидов в минуту, но практически не влияет на сродство поли II к нуклеозидтрифосфатам, и образование фосфодиэфирной связи все еще возможно. Мостовая спираль эволюционировала, чтобы быть гибкой, и ее движение необходимо для транслокации полимеразы вдоль цепи ДНК. Связывание α-аманитина ограничивает ее подвижность, тем самым замедляя транслокацию полимеразы и скорость синтеза молекулы РНК.

Использование в конъюгатах антитела и лекарств

Новая технология конъюгатов антител (ADC) на основе α-аманитина продемонстрировала активность в опухолевых клетках, устойчивых к терапии, например, в клетках, экспрессирующих транспортеры множественной лекарственной устойчивости, опухолевых инициаторных клетках и не делящихся клетках, при пикомолярных концентрациях. Уникальный механизм действия α-аманитина делает конъюгаты антител на основе аманитина подходящим токсичным компонентом. Аманитин обладает водорастворимой структурой, что приводит к образованию ADC с низкой склонностью к агрегации.