Альфа-аманитин: Химиялық құрамы, қасиеттері және анықтау әдістері
Α-Amanitin
Альфа-аманитин – аса қауіпті улы зат, Amanita және Galerina саңырауқүлдерінде кездеседі. Рибосомаларда синтезделеді, 100 мкг/кг дозасы егеуқұйрықтар үшін өлімге алып келеді.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Химиялық қосылыс
Chemical compound
α Аманитин (альфа Аманитин) – сегіз аминқышқылынан тұратын циклдік пептид. Бұл, мүмкін, барлық аматоксиндердің ішіндегі ең қауіптісі, Аманита туысына жататын бірнеше түрде кездесетін токсиндер, олардың бірі – өлім қалпағы (Amanita phalloides), сондай-ақ жойғыш періште, ұқсас түрлердің жиынтығы, негізінен A. virosa және A. bisporigera. Ол сондай-ақ Galerina marginata және Conocybe filaris саңырауқұлақтарында да табылады. Егеуқұйрықтар үшін аманитиннің ауыз арқылы берілетін дозасы 100 мкг/кг құрайды. Көптеген циклдік пептидтерден өзгеше, аматоксиндер (және фалотоксиндер) рибосомаларда синтезделеді. α Аманитин пропротеинін кодтайтын гендер фаллацидинді (фалотоксин) кодтайтын гендермен туыс.
α Amanitin (alpha Amanitin) is a cyclic peptide of eight amino acids. It is possibly the most deadly of all the amatoxins, toxins found in several species of the mushroom genus Amanita, one being the death cap (Amanita phalloides) as well as the destroying angel, a complex of similar species, principally A. virosa and A. bisporigera. It is also found in the mushrooms Galerina marginata and Conocybe filaris. The oral of amanitin is 100 μg/kg for rats. Unlike most cyclic peptides, amatoxins (and phallotoxins) are synthesized on ribosomes. The genes encoding the proprotein for α amanitin belong to the same family as those that encode for phallacidin (a phallotoxin).
Ғылыми қолдану
Аманитин РНК полимеразаның II және III-тің, бірақ I-нің селективті ингибиторы болып табылады. Осы механизм оны қауіпті уға айналдырады. Аманитин РНК полимеразаның қандай түрлері бар екенін анықтау үшін де қолданылуы мүмкін. Бұл α-аманитиннің қатысуында полимеразаның сезімталдығын тексеру арқылы жасалады. РНК полимераза I сезімтал емес, РНК полимераза II жоғары сезімтал (1 мкг/мл-де тежеледі), РНК полимераза III орташа сезімтал (10 мкг/мл-де тежеледі), ал РНК полимераза IV аздап сезімтал (50 мкг/мл-де тежеледі).
α Amanitin is a selective inhibitor of RNA polymerase II and III but not I. This mechanism makes it a deadly toxin. α Amanitin can also be used to determine which types of RNA polymerase are present. This is done by testing the sensitivity of the polymerase in the presence of α amanitin. RNA polymerase I is insensitive, RNA polymerase II is highly sensitive (inhibited at 1μg/ml), RNA polymerase III is moderately sensitive (inhibited at 10μg/ml), and RNA polymerase IV is slightly sensitive (inhibited at 50μg/ml).
Химиялық құрылысы
α-аманитин – сыртқы және ішкі циклден тұратын, күшті модификацияланған бициклдік октапептид. Сыртқы цикл аминқышқылының карбоксилдік тобы мен келесі қалдықтың амин тобы арасындағы пептидтік байланыстар арқылы қалыптасады. Ішкі цикл 6-гидрокситриптофан мен цистеин арасындағы триптатионин байланысымен жабылады. Бұған қоса, α-аманитин (2S,3R,4R) 4,5-дигидроксиизолеуцин және транс-4-гидроксипролин сияқты модификацияланған аминқышқылдарының тізбектерімен безендірілген, бұл оның РНК полимераза II және III-ке жоғары сәйкестігін қамтамасыз етеді.
α amanitin is a highly modified bicyclic octapeptide consisting of an outer and an inner loop. The outer loop is formed by peptide bonds between a carboxyl terminus of an amino acid to the subsequent amino terminus of the next residue. The inner loop is closed by a tryptathionine linkage between 6 hydroxy tryptophan and cysteine. In addition, α amanitin is decorated with modified amino acid side chains (2S,3R,4R) 4,5 dihydroxy isoleucine, trans 4 hydroxy proline, which gives its high affinity for RNA polymerase II and III.
Анықтау әдістері
Альфа-аманитинді анықтаудың алғашқы әдістері жұқа қабатты хроматографияны (ТКХ) қамтиды. ТКХ-да қолданылатын көптеген еріткіш жүйелерінде альфа-аманитин мен бета-аманитин әртүрлі жылдамдықпен жылжып, әрбір удың жеке анықталуына мүмкіндік береді. Тағы бір ерте әдіс – Meixner сынағы (Wieland сынағы деп те аталады), ол аматоксиндерді анықтайды, бірақ псилоцин сияқты кейбір заттар үшін қате оң нәтижелер де береді. Капиллярлық аймақ электрофорезі де жасалды, бірақ ол клиникалық үлгілер үшін жеткілікті сезімтал болмаса, саңырауқұлақтардан алынған сындар үшін жеткілікті болды. Соңғы кезде жоғары өнімді сұйық хроматографиясы (HPLC) басым әдіс болып табылады, ол жақсырақ ажырату, қайталанатын нәтижелер және жоғары сезімталдық береді. HPLC-мен бірге УФ- немесе массалық спектрометрия сияқты түрлі детекторларды қолдануға болады. 1980 жылдардың басынан бастап аманитинге қарсы антиденеге негізделген иммунотесттер (иммуноанализдер) жасалды (бірақ антиденелер кейбір туыс заттармен қиылысқандықтан көбінесе аматоксиндерді анықтайды). Алғашқы иммуноанализдер радиоиммуноанализдер, содан кейін ферменттік иммуносорбенттік талдаулар (ELISA) болды. Жақында, 2020 жылы, моноклоналды антиденеге негізделген қаптамалы ағынды иммуноанализ (жүктілік тестіне ұқсас) әзірленді, ол саңырауқұлақтар мен зәр үлгілеріндегі аматоксиндерді жылдам және таңдап анықтай алады.
Early methods to detect alpha amanitin included thin layer chromatography (TLC). In most solvent systems used in TLC, alpha amanitin and beta amanitin would travel at different rates, thus allowing individual identification of each toxin. Another early method was the Meixner test (also known as the Wieland test), which would detect amatoxins, but also yielded false positives for some compounds, such as psilocin. Capillary zone electrophoresis was also developed, but was not adequately sensitive for clinical samples, but sufficient for mushroom extracts. More recently, the use of high performance liquid chromatography (HPLC) has become the preferred method, which allows for better resolution, reproducibility, and higher sensitivity. A range of detectors can be paired with HPLC, such as UV or mass spectrometry. As early as the 1980s, antibody based assays (immunoassays) were developed for amanitin (but more often recognize amatoxins as the antibodies cross react with some of the congeners). The earliest immunoassays were radioimmunoassays and then enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs). More, recently, in 2020, a monoclonal antibody based lateral flow immunoassay (similar to a pregnancy test) has been developed that can quickly and selectively detect amatoxins in mushrooms and in urine samples.
Жалпы синтез
Матинху және тағы басқалар 2018 жылы α-аманитин алу үшін үш синтетикалық қиындықтарды жеңу стратегияларын жасады. Біріншіден, 2-(бензилокси)ацетальдегидтен 11 қадамда қатты фазалы пептид синтезіне үйлесімді (2S,3R,4R) 4,5-дигидроксиизолейциннің энантиоселективті синтезі жүзеге асырылды. Екі маңызды стереохимиялық қадамға (3R,4R) позициясындағы Браун кротильдеуі және (2S) α-көміртектегі асимметриялық Стрекер аминқышқылы синтезі кіреді. Екіншіден, 6-гидрокситриптофан мен цистеин арасындағы флюороциклизация арқылы ішкі сақинаның хемоселективті жабылуы савиге-фонтаналық сақиналық реакция арқылы қол жеткізілді. Бұл үшін қатты фазалы пептид синтезіне үйлесімді, борды қорғаушы тобы – метилиминодиацетат қышқылы (MIDA) және 5 қадамда ортогональды аминқышқылы қажет болды. 10 сағат ішінде әсерлер туралы аздаған мәліметтер бар; маңызды әсерлердің пайда болуына 24 сағатқа дейін уақыт кететін жағдайлар да кездеседі, симптомдардың кешігуі α-аманитин улануын диагностикалауды одан да қиындатады және оны қауіпті етеді. Осы уақытқа қарай асқазанды шаю тиімді нәтиже бермейді. Диарея мен құрысу – алғашқы белгілер, бірақ олар өтіп кетеді, бұл жазылудың жалған белгісін береді. Әдетте, 4-5 күні токсин бауыр мен бүйрекке күшті әсер ете бастайды, екеуінің де толыққанды жұмыс істемей қалуына алып келеді. Өлім көбінесе жұтылғаннан кейін шамамен бір аптадан кейін орын алады. Уланғандардың шамамен 15%-ы 10 күн ішінде қайтыс болады, комалық жағдайдан бастап бүйрек жеткіліксіздігіне, бауыр жеткіліксіздігіне, бауыр комасына, тыныс алу жеткіліксіздігіне және өлімге ұшырайды. Жазылғандардың бауырында қанағаттандырмас зақымдану қаупі бар. Диагноз қою қиын, ол клиникалық белгілерді бақылау және зәрде α-аманитиннің болуын анықтау арқылы қойылады. Зәрді тексеру көбінесе жұтылғаннан кейін 48 сағат ішінде ең пайдалы болады. Емдеу көбінесе қолдаушы сипатта (асқазанды шаю, белсендірілген көмір, сұйықтықтарды құю), бірақ аматоксиндерге қарсы түрлі дәрілерді де қамтиды, соның ішінде ішекке енгізілетін пенициллин мен цефалоспорин туындыларын, ал көп мөлшерде жұтылған жағдайларда бауыр трансплантациясына дейін созылуы мүмкін. Аманитин улануын емдеудің ең сенімді әдісі – жұтылғаннан кейін дереу асқазанды шаю; алайда, симптомдардың пайда болуы көбінесе осы мүмкіндікті жоқ етеді. Химиялық өзгертілген силибинин, силибинин дигидроген дисукцинаты динатрий (саудалық атауы Legalon SIL) – құрамындағы ерітінді, парацетамол және аманитиндер сияқты гепатотоксикалық заттармен ауыр улануды емдеу үшін қолданылады.
Matinkhoo et al. devised strategies to surmount three synthetic hurdles to give α amanitin in 2018. First, enantioselective synthesis of solid phase peptide synthesis compatible (2S,3R,4R) 4,5 dihydroxyisoleucine was afforded in 11 steps from 2 (benzyloxy)acetaldehyde. Two key stereochemistry defining steps include Brown crotylation at (3R,4R) positions, and asymmetric Strecker amino acid synthesis at the (2S) α carbon. Secondly, chemoselective inner ring closure by fluorocyclization between 6 hydroxytrytophan and cysteine was achieved by intra annular Savige Fontana reaction. This requires a solid phase peptide synthesis compatible, and methyliminodiacetic acid (MIDA), a boron protecting group, orthogonal amino acid in 5 steps. Few effects are reported within 10 hours; it is not unusual for significant effects to take as long as 24 hours after ingestion to appear, with this delay in symptoms making α amanitin poisoning even more difficult to diagnose and all the more dangerous. By then, it is far past the time in which stomach pumping would yield an efficient result. Diarrhea and cramps are the first symptoms, but those pass, giving a false sign of remission. Typically, on the 4th to 5th day, the toxin starts to have severe effects on the liver and kidneys, leading to total system failure in both. Death usually takes place around a week from ingestion. Around 15% of those poisoned will die within 10 days, progressing through a comatose stage to kidney failure, liver failure, hepatic coma, respiratory failure and death. Those who recover are at risk of permanent liver damage. Diagnosis is difficult, and is established by observation of the clinical symptoms as well as the presence of α amanitin in the urine. Urine screening is generally most useful within 48 hours of ingestion. Treatment is mainly supportive (gastric lavage, activated carbon, fluid resuscitation) but includes various drugs to counter the amatoxins, including intravenous penicillin and cephalosporin derivatives, and, in cases of greater ingestion, can extend to an orthotopic liver transplant. The most reliable method to treat amanitin poisoning is through gastric lavage immediately after ingestion; however, the onset of symptoms is generally too late for this to be an option. Chemically modified silibinin, silibinin dihydrogen disuccinate disodium (trade name Legalon SIL) a solution for IV administration, is used in treatment of severe intoxications with hepatotoxic substances such as paracetamol and amanitins.
Ингибиторлық әсер ету түрі
[[Сурет:Альфа-аманитинРНК полимераза II кешені 1К83. png|thumb|α Аманитин (қызыл түспен көрсетілген) Saccharomyces cerevisiae (пиво ашытқысы) РНК полимераза II-ге байланысқан күйде. Бұл өзара әрекеттесу РНК синтезінің келесі айналымы үшін орынды босатуға қажетті РНК және ДНК транслокациясына бөгет жасайды. α Аманитин қосылғанда, ДНК-дағы Pol II транслокациясының жылдамдығы минутына бірнеше мыңнан бірнеше нуклеотидке дейін төмендейді, бірақ Pol II-нің нуклеозид трифосфатына деген туыстығына аз ғана әсер етеді және фосфодиэстерлік байланыс түзілуі мүмкін. Көпір спиралі икемді болу үшін эволюциялық дамыған және полимеразаның ДНК тізбегі бойымен транслокациясы үшін оның қозғалысы қажет. α Аманитиннің байланысуы оның қозғалмалылығын шектейді, соның салдарынан полимеразаның транслокациясы мен РНК молекуласының синтезделу жылдамдығы төмендейді.
[[Image:Alpha Amanitin–RNA polymerase II complex 1K83. png|thumb|α Amanitin (red) bound to RNA polymerase II from Saccharomyces cerevisiae (brewer's yeast). From This interaction interferes with the translocation of RNA and DNA needed to empty the site for the next round of RNA synthesis. The addition of α amanitin can reduce the rate of pol II translocating on DNA from several thousand to a few nucleotides per minute, but has little effect on the affinity of pol II for nucleoside triphosphate, and a phosphodiester bond can still be formed. The bridge helix has evolved to be flexible and its movement is required for translocation of the polymerase along the DNA backbone. Binding of α amanitin puts a constraint on its mobility, hence slowing down the translocation of the polymerase and the rate of synthesis of the RNA molecule.
Антитело-дәрмек конъюгаттарында қолдану
А-аманитинге негізделген жаңа антидене-дәрі конъюгаты (ADC) технологиясы терапияға төзімді ісік жасушаларында, мысалы, көп дәріге төзімді тасымалдаушыларды экспрессиялейтін жасушаларда, ісік бастаушы жасушаларда және бөлінбейтін жасушаларда пикомолярлық концентрацияда әсерлі екенін көрсетті. А-аманитиннің ерекше әсер ету механизмі аманитинге негізделген ADC-ді тиімді токсикалық жүктемеге айналдырады. Аманитин суда жақсы еритін құрылымға ие, нәтижесінде агрегацияға бейімділігі төмен ADC-лер алынады.
A new antibody drug conjugate (ADC) technology based on α amanitin has shown activity in therapy resistant tumor cells, e. g. cells expressing multi drug resistant transporters, tumor initiating cells and non dividing cells at picomolar concentrations. The unique mode of action of α amanitin seems to make the amanitin based ADCs a suitable toxic payload. Amanitin has a water soluble structure, resulting in ADCs with low tendency for aggregation.