Никотинамидадениндинуклеотид: окислительно-восстановительные реакции и метаболизм

Введение

Химическое соединение, которое подвергается восстановлению и окислению, аденозиндинуклеотид никотинамида (NAD) – кофермент, играющий центральную роль в метаболизме. NAD, содержащийся во всех живых клетках, называется динуклеотидом, поскольку состоит из двух нуклеотидов, соединенных через фосфатные группы. Один нуклеотид содержит аденин, а другой – никотинамид. NAD существует в двух формах: окисленной и восстановленной, обозначаемых как NAD⁺ и NADH (H обозначает водород) соответственно. В клеточном метаболизме NAD участвует в окислительно-восстановительных реакциях, перенося электроны от одной реакции к другой, поэтому он представлен двумя формами: NAD⁺ является окислителем, принимающим электроны от других молекул и восстанавливаясь; при присоединении H⁺ эта реакция образует NADH, который может использоваться как восстановитель для передачи электронов. Эти реакции переноса электронов – основная функция NAD. Он также используется в других клеточных процессах, в частности, в качестве субстрата ферментов при добавлении или удалении химических групп из белков, в посттрансляционных модификациях. Ввиду важности этих функций, ферменты, участвующие в метаболизме NAD, являются мишенями для разработки лекарственных препаратов. В организмах NAD может синтезироваться de novo из простых строительных блоков – триптофана или аспартата, каждый из которых является аминокислотой. Альтернативно, более сложные компоненты кофермента поступают с питательными веществами, такими как ниацин; подобные соединения образуются в реакциях расщепления структуры NAD, обеспечивая путь рециркуляции и восстановления активной формы. Часть NAD преобразуется в кофермент никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP⁺), химия которого во многом аналогична NAD, однако его основная роль заключается в качестве кофермента в анаболическом метаболизме. В обозначении NAD⁺ знак «плюс» вверху указывает на положительный формальный заряд одного из атомов азота.

Концентрация и состояние в клетках

В печени крысы общее количество NAD и NADH составляет примерно 1 мкмоль на грамм влажного веса, что примерно в 10 раз больше концентрации NADP и NADPH в тех же клетках. Фактическую концентрацию NAD в клеточном цитозоле измерить сложнее, по последним оценкам в клетках животных она составляет около 0,3 мМ, а в дрожжах – примерно от 1,0 до 2,0 мМ. Однако более 80% флуоресценции NADH в митохондриях приходится на связанную форму, поэтому концентрация в растворе намного ниже. Концентрация NAD наиболее высока в митохондриях, составляя от 40% до 70% от общей клеточной концентрации NAD. NAD в цитозоле переносится в митохондрию специфическим мембранным транспортным белком, поскольку коэнзим не может диффузировать через мембраны. В одном обзоре указано, что внутриклеточный период полувыведения NAD+ составляет от 1 до 2 часов, в то время как другой обзор приводит различные оценки в зависимости от компартмента: внутриклеточный – 1–4 часа, цитоплазматический – 2 часа и митохондриальный – 4–6 часов. Баланс между окисленной и восстановленной формами никотинамида адениндинуклеотида называется соотношением NAD/NADH. Это соотношение является важным компонентом так называемого окислительно-восстановительного состояния клетки, показателя, отражающего как метаболическую активность, так и здоровье клеток. Эффекты соотношения NAD/NADH сложны, поскольку они контролируют активность нескольких ключевых ферментов, включая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и пируватдегидрогеназу. В здоровых тканях млекопитающих оценки соотношения свободной NAD к NADH в цитоплазме обычно составляют около 700:1; таким образом, соотношение благоприятно для окислительных реакций. Соотношение общей NAD/NADH значительно ниже, с оценками от 3 до 10 у млекопитающих. В отличие от этого, соотношение NADP/NADPH обычно составляет около 0,005, поэтому NADPH является доминирующей формой этого кофермента. Эти различные соотношения имеют ключевое значение для различных метаболических ролей NADH и NADPH.

Биосинтез

NAD синтезируется двумя метаболическими путями. Он образуется либо de novo из аминокислот, либо посредством путей восстановления, перерабатывая уже существующие компоненты, такие как никотинамид, обратно в NAD. Хотя в тканях млекопитающих NAD преимущественно синтезируется по пути восстановления, значительно больший de novo синтез происходит в печени из триптофана, а в почках и макрофагах – из никотиновой кислоты.

Производство De Novo

Большинство организмов синтезируют NAD из простых компонентов. Хинолиновая кислота превращается в никотиновой кислоты мононуклеотид (NaMN) путем переноса фосфорибозного фрагмента. Затем к нему присоединяется аденилатный фрагмент, образуя никотиновой кислоты аденодиндинуклеотид (NaAD). Наконец, никотиновая кислота в NaAD амидируется до никотинамида (Nam), формируя никотинамид аденин динуклеотид. В большинстве организмов этот фермент использует аденозинтрифосфат (АТФ) в качестве источника фосфатной группы, однако некоторые бактерии, такие как Mycobacterium tuberculosis и гипертермофильный археон Pyrococcus horikoshii, используют неорганический полифосфат в качестве альтернативного донора фосфорильной группы.

Спасательные пути

Несмотря на наличие пути de novo, реакции спасения необходимы для человека; недостаток ниацина в рационе вызывает пеллагру – заболевание, вызванное дефицитом витамина. Эта высокая потребность в NAD обусловлена постоянным расходованием коэнзима в реакциях, таких как посттрансляционные модификации, поскольку циклирование NAD между окисленными и восстановленными формами в окислительно-восстановительных реакциях не изменяет общую концентрацию коэнзима. Первым этапом и лимитирующим скорость ферментом в пути спасения является никотинамид фосфорибозилтрансфераза (NAMPT), которая производит никотинамид мононуклеотид (NMN). Помимо синтеза NAD de novo из простых предшественников аминокислот, клетки также используют повторное использование уже готовых соединений, содержащих пиридиновое основание. Три витаминных предшественника, используемые в этих метаболических путях спасения, – это никотиновая кислота (NA), никотинамид (Nam) и никотинамид рибозид (NR). Имеются данные о том, что клетки млекопитающих могут поглощать внеклеточный NAD из окружающей среды, а никотинамид и никотинамид рибозид могут всасываться в кишечнике. Пути спасения, используемые микроорганизмами, отличаются от путей спасения у млекопитающих. Некоторые патогены, такие как дрожжи Candida glabrata и бактерия Haemophilus influenzae, являются NAD-аксотрофами – они не способны синтезировать NAD, но обладают путями спасения и, следовательно, зависят от внешних источников NAD или его предшественников. Еще более удивительно, что внутриклеточный патоген Chlamydia trachomatis не имеет идентифицируемых генов, участвующих в биосинтезе или спасении как NAD, так и NADP, и должен получать эти коэнзимы от хозяина.

Функции

Никотинамид аденин динуклеотид выполняет несколько важных функций в метаболизме. Он действует как кофермент в окислительно-восстановительных реакциях, как донор фрагментов ADP-рибозы в реакциях ADP-рибозилирования, как предшественник вторичного мессенджера циклического ADP-рибозы, а также как субстрат для бактериальных ДНК-лигаз и группы ферментов, называемых сиртуинами, которые используют NAD для удаления ацетильных групп от белков. Помимо этих метаболических функций, NAD+ проявляется как адениннуклеотид, который может высвобождаться из клеток спонтанно и посредством регулируемых механизмов, и, следовательно, может выполнять важные внеклеточные функции. Однако эти ферменты также называют дегидрогеназами или редуктазами, при этом NADH-убихинон оксидоредуктазу обычно называют NADH-дегидрогеназой или иногда коэнзимом Q-редуктазой. Существует множество различных суперсемейств ферментов, связывающих NAD / NADH. Одно из наиболее распространенных суперсемейств включает структурный мотив, известный как Россмановский мотив (или Россмановская складка). Мотив назван в честь Майкла Россмана, который первым заметил, насколько распространена эта структура среди белков, связывающих нуклеотиды. Пример бактериального фермента, связывающего NAD и участвующего в метаболизме аминокислот, не имеющего Россмановской складки, обнаружен у Pseudomonas syringae pv. tomato (;). [[Файл:NAD+ phys alt. На этой диаграмме углеродный атом-акцептор C4 показан вверху. Когда никотинамидное кольцо лежит в плоскости страницы, с карбоксиамидной группой справа, как показано, донор гидрида находится либо "выше", либо "ниже" плоскости страницы. Если перенос гидрида "вверх" относится к классу А, если перенос гидрида "вниз" – к классу В. Несмотря на сходство в том, как белки связывают два кофермента, ферменты почти всегда проявляют высокую специфичность к NAD или NADP. Эта специфичность отражает различные метаболические роли соответствующих коферментов и является результатом различных наборов аминокислотных остатков в двух типах кофермент-связывающих карманов. Например, в активном центре NADP-зависимых ферментов образуется ионная связь между основной боковой цепью аминокислоты и кислой фосфатной группой NADP. В то же время, в NAD-зависимых ферментах заряд в этом кармане обращен в противоположную сторону, препятствуя связыванию NADP. Однако существуют некоторые исключения из этого общего правила, и такие ферменты, как альдозоредуктаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и метилентетрагидрофолатредуктаза, могут использовать оба кофермента у некоторых видов.

Nicotinamide adenine dinucleotide has several essential roles in metabolism. It acts as a coenzyme in redox reactions, as a donor of ADP ribose moieties in ADP ribosylation reactions, as a precursor of the second messenger molecule cyclic ADP ribose, as well as acting as a substrate for bacterial DNA ligases and a group of enzymes called sirtuins that use NAD to remove acetyl groups from proteins. In addition to these metabolic functions, NAD+ emerges as an adenine nucleotide that can be released from cells spontaneously and by regulated mechanisms, and can therefore have important extracellular roles. However, these enzymes are also referred to as dehydrogenases or reductases, with NADH ubiquinone oxidoreductase commonly being called NADH dehydrogenase or sometimes coenzyme Q reductase. There are many different superfamilies of enzymes that bind NAD / NADH. One of the most common superfamilies includes a structural motif known as the Rossmann fold. The motif is named after Michael Rossmann, who was the first scientist to notice how common this structure is within nucleotide binding proteins. An example of a NAD binding bacterial enzyme involved in amino acid metabolism that does not have the Rossmann fold is found in Pseudomonas syringae pv. tomato (; ). [[File:NAD+ phys alt. svg|thumb|left|In this diagram, the hydride acceptor C4 carbon is shown at the top. When the nicotinamide ring lies in the plane of the page with the carboxy amide to the right, as shown, the hydride donor lies either "above" or "below" the plane of the page. If "above" hydride transfer is class A, if "below" hydride transfer is class B. Despite the similarity in how proteins bind the two coenzymes, enzymes almost always show a high level of specificity for either NAD or NADP. This specificity reflects the distinct metabolic roles of the respective coenzymes, and is the result of distinct sets of amino acid residues in the two types of coenzyme binding pocket. For instance, in the active site of NADP dependent enzymes, an ionic bond is formed between a basic amino acid side chain and the acidic phosphate group of NADP. On the converse, in NAD dependent enzymes the charge in this pocket is reversed, preventing NADP from binding. However, there are a few exceptions to this general rule, and enzymes such as aldose reductase, glucose 6 phosphate dehydrogenase, and methylenetetrahydrofolate reductase can use both coenzymes in some species.

Нередокс-роли

Кофермент NAD также расходуется в реакциях переноса ADP-рибозы. Например, ферменты, называемые ADP-рибозилтрансферазами, присоединяют ADP-рибозный фрагмент этой молекулы к белкам в процессе посттрансляционной модификации, называемой ADP-рибозилированием. ADP-рибозилирование включает в себя либо присоединение одной молекулы ADP-рибозы, в моно-ADP-рибозилировании, либо перенос ADP-рибозы к белкам в виде длинных разветвленных цепей, что называется поли(ADP-рибозилированием). Моно-ADP-рибозилирование было впервые обнаружено как механизм действия группы бактериальных токсинов, в частности, холерного токсина, но также участвует в нормальной клеточной сигнализации. Поли(ADP-рибозилирование) осуществляется поли(ADP-рибозовыми) полимеразами. Структура поли(ADP-рибозы) участвует в регуляции нескольких клеточных процессов и особенно важна в ядре клетки, в таких процессах, как репарация ДНК и поддержание теломер. NAD также может присоединяться к клеточной РНК в качестве 5'-терминальной модификации. Другая функция этого кофермента в клеточной сигнализации – это его роль в качестве предшественника циклической ADP-рибозы, которая образуется из NAD под действием ADP-рибозильных циклаз, как часть системы вторичных посредников. Эта молекула участвует в кальциевой сигнализации, высвобождая кальций из внутриклеточных хранилищ. Это происходит путем связывания и открытия класса кальциевых каналов, называемых рианодиновыми рецепторами, расположенными в мембранах органелл, таких как эндоплазматический ретикулум, и индуцирует активацию транскрипционного фактора NAFC3.

The coenzyme NAD is also consumed in ADP ribose transfer reactions. For example, enzymes called ADP ribosyltransferases add the ADP ribose moiety of this molecule to proteins, in a posttranslational modification called ADP ribosylation. ADP ribosylation involves either the addition of a single ADP ribose moiety, in mono ADP ribosylation, or the transferral of ADP ribose to proteins in long branched chains, which is called poly(ADP ribosyl)ation. Mono ADP ribosylation was first identified as the mechanism of a group of bacterial toxins, notably cholera toxin, but it is also involved in normal cell signaling. Poly(ADP ribosyl)ation is carried out by the poly(ADP ribose) polymerases. The poly(ADP ribose) structure is involved in the regulation of several cellular events and is most important in the cell nucleus, in processes such as DNA repair and telomere maintenance. NAD may also be added onto cellular RNA as a 5' terminal modification. thumb|left|upright=1.1|The structure of cyclic ADP ribose

Another function of this coenzyme in cell signaling is as a precursor of cyclic ADP ribose, which is produced from NAD by ADP ribosyl cyclases, as part of a second messenger system. This molecule acts in calcium signaling by releasing calcium from intracellular stores. It does this by binding to and opening a class of calcium channels called ryanodine receptors, which are located in the membranes of organelles, such as the endoplasmic reticulum, and inducing the activation of the transcription factor NAFC3

NAD is also consumed by different NAD+ consuming enzymes, such as CD38, CD157, PARPs and the NAD dependent deacetylases (sirtuins,such as Sir2.). These enzymes act by transferring an acetyl group from their substrate protein to the ADP ribose moiety of NAD; this cleaves the coenzyme and releases nicotinamide and O acetyl ADP ribose. The sirtuins mainly seem to be involved in regulating transcription through deacetylating histones and altering nucleosome structure. However, non histone proteins can be deacetylated by sirtuins as well. These activities of sirtuins are particularly interesting because of their importance in the regulation of aging. Other NAD dependent enzymes include bacterial DNA ligases, which join two DNA ends by using NAD as a substrate to donate an adenosine monophosphate (AMP) moiety to the 5' phosphate of one DNA end. This intermediate is then attacked by the 3' hydroxyl group of the other DNA end, forming a new phosphodiester bond. This contrasts with eukaryotic DNA ligases, which use ATP to form the DNA AMP intermediate. Li et al. have found that NAD directly regulates protein protein interactions. They also show that one of the causes of age related decline in DNA repair may be increased binding of the protein DBC1 (Deleted in Breast Cancer 1) to PARP1 (poly[ADP–ribose] polymerase 1) as NAD levels decline during aging. Thus, the modulation of NAD may protect against cancer, radiation, and aging. NAD+ is released from neurons in blood vessels, large intestine, from neurosecretory cells, and from brain synaptosomes, and is proposed to be a novel neurotransmitter that transmits information from nerves to effector cells in smooth muscle organs. Further studies are needed to determine the underlying mechanisms of its extracellular actions and their importance for human health and life processes in other organisms.

NAD также потребляется различными NAD+-потребляющими ферментами, такими как CD38, CD157, PARP и NAD-зависимые деацетилазы (сиртуины, такие как Sir2). Эти ферменты действуют путем переноса ацетильной группы от белка-субстрата к ADP-рибозному фрагменту NAD, что приводит к расщеплению кофермента и высвобождению никотинамида и O-ацетил-ADP-рибозы. Сиртуины, по-видимому, в основном участвуют в регуляции транскрипции путем деацетилирования гистонов и изменения структуры нуклеосом. Однако сиртуины могут деацетилировать и белки, не являющиеся гистонами. Эти функции сиртуинов особенно интересны в связи с их ролью в регуляции старения. К другим NAD-зависимым ферментам относятся бактериальные ДНК-лигазы, которые соединяют два конца ДНК, используя NAD в качестве субстрата для донирования фрагмента аденозинмонофосфата (АМФ) к 5'-фосфату одного конца ДНК. Затем эта промежуточная группа подвергается атаке 3'-гидроксильной группой другого конца ДНК, образуя новую фосфодиэфирную связь. Это отличается от эукариотических ДНК-лигаз, которые используют АТФ для образования промежуточного соединения ДНК-АМФ. Ли и соавторы обнаружили, что NAD напрямую регулирует взаимодействие белков. Они также показали, что одной из причин возрастного снижения репарации ДНК может быть увеличение связывания белка DBC1 (Deleted in Breast Cancer 1) с PARP1 (поли(ADP-рибозовой) полимеразой 1) по мере снижения уровня NAD во время старения. Таким образом, модуляция уровня NAD может защитить от рака, радиации и старения. NAD+ высвобождается из нейронов в кровеносных сосудах, толстом кишечнике, из нейросекреторных клеток и из синаптосом мозга и предлагается в качестве нового нейротрансмиттера, передающего информацию от нервов к эффекторным клеткам в гладкомышечных органах. Необходимы дальнейшие исследования для определения основных механизмов его внеклеточных действий и их значимости для здоровья человека и жизненных процессов в других организмах.

Клиническое значение

Ферменты, синтезирующие и использующие NAD и NADH, играют важную роль как в фармакологии, так и в исследованиях, направленных на разработку новых методов лечения заболеваний. Разработка лекарственных препаратов использует NAD тремя способами: в качестве прямой мишени для лекарств, путем создания ингибиторов или активаторов ферментов, основанных на его структуре, изменяющих активность NAD-зависимых ферментов, и путем попыток ингибировать биосинтез NAD. Поскольку раковые клетки характеризуются повышенным гликолизом, а NAD усиливает этот процесс, никотинамидфосфорибозилтрансфераза (путь восстановления NAD) часто экспрессируется в больших количествах в раковых клетках. Этот фермент изучается на предмет его потенциального применения в терапии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, а также рассеянного склероза. NAD также является прямой мишенью изониазида, препарата, используемого для лечения туберкулеза, инфекции, вызываемой Mycobacterium tuberculosis. Изониазид является пролекарством, которое, попадая в бактерии, активируется ферментом пероксидазой, окисляющим соединение до формы свободного радикала. Этот радикал затем реагирует с NADH, образуя аддукты, являющиеся мощными ингибиторами ферментов эноил-ацилпереносчика белка редуктазы и дигидрофолатредуктазы. Учитывая, что многие оксидоредуктазы используют NAD и NADH в качестве субстратов и связывают их с помощью высококонсервативного структурного мотива, возможность создания ингибиторов на основе NAD, специфичных для одного фермента, может показаться неожиданной. Однако это возможно: например, ингибиторы на основе микофеноловой кислоты и тиазофурина ингибируют IMP-дегидрогеназу в месте связывания NAD. Ввиду важности этого фермента в метаболизме пуринов, эти соединения могут быть полезны в качестве противоопухолевых, противовирусных или иммуносупрессивных средств. Другие препараты не ингибируют ферменты, а активируют ферменты, участвующие в метаболизме NAD. Сиртуины представляют собой особенно интересную мишень для таких препаратов, поскольку активация этих NAD-зависимых деацетилаз продлевает продолжительность жизни в некоторых моделях животных. Соединения, такие как ресвератрол, повышают активность этих ферментов, что может играть роль в их способности замедлять старение как у позвоночных, так и у беспозвоночных модельных организмов. В одном эксперименте у мышей, получавших NAD в течение недели, наблюдалось улучшение ядерно-митохондриальной коммуникации. Различия в метаболических путях биосинтеза NAD у разных организмов, например, у бактерий и человека, делают эту область метаболизма перспективной для разработки новых антибиотиков. Например, фермент никотинамидаза, превращающий никотинамид в никотиновую кислоту, является мишенью для разработки лекарств, поскольку он отсутствует у человека, но присутствует в дрожжах и бактериях.

The enzymes that make and use NAD and NADH are important in both pharmacology and the research into future treatments for disease. Drug design and drug development exploits NAD in three ways: as a direct target of drugs, by designing enzyme inhibitors or activators based on its structure that change the activity of NAD dependent enzymes, and by trying to inhibit NAD biosynthesis. Because cancer cells utilize increased glycolysis, and because NAD enhances glycolysis, nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAD salvage pathway) is often amplified in cancer cells. It has been studied for its potential use in the therapy of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's disease as well as multiple sclerosis. NAD is also a direct target of the drug isoniazid, which is used in the treatment of tuberculosis, an infection caused by Mycobacterium tuberculosis. Isoniazid is a prodrug and once it has entered the bacteria, it is activated by a peroxidase enzyme, which oxidizes the compound into a free radical form. This radical then reacts with NADH, to produce adducts that are very potent inhibitors of the enzymes enoyl acyl carrier protein reductase, and dihydrofolate reductase. Since many oxidoreductases use NAD and NADH as substrates, and bind them using a highly conserved structural motif, the idea that inhibitors based on NAD could be specific to one enzyme is surprising. However, this can be possible: for example, inhibitors based on the compounds mycophenolic acid and tiazofurin inhibit IMP dehydrogenase at the NAD binding site. Because of the importance of this enzyme in purine metabolism, these compounds may be useful as anti cancer, anti viral, or immunosuppressive drugs. Other drugs are not enzyme inhibitors, but instead activate enzymes involved in NAD metabolism. Sirtuins are a particularly interesting target for such drugs, since activation of these NAD dependent deacetylases extends lifespan in some animal models. Compounds such as resveratrol increase the activity of these enzymes, which may be important in their ability to delay aging in both vertebrate, and invertebrate model organisms. In one experiment, mice given NAD for one week had improved nuclear mitochrondrial communication. Because of the differences in the metabolic pathways of NAD biosynthesis between organisms, such as between bacteria and humans, this area of metabolism is a promising area for the development of new antibiotics. For example, the enzyme nicotinamidase, which converts nicotinamide to nicotinic acid, is a target for drug design, as this enzyme is absent in humans but present in yeast and bacteria.

История

История ранней энзимологии, учебник XIX века.