Введение
Виды бактерий, используемых в качестве инсектицида
Bacillus thuringiensis (или Bt) – это грамположительная почвенная бактерия, наиболее часто используемый в мире биологический пестицид. B. thuringiensis также естественным образом встречается в кишечнике гусениц различных видов мотыльков и бабочек, а также на поверхности листьев, в водной среде, в фекалиях животных, в местах обитания большого количества насекомых, на мукомольных заводах и в зернохранилищах. Также наблюдалось, что он паразитирует на мотыльках, таких как Cadra calidella – в лабораторных экспериментах с C. calidella многие мотыльки заболевали из-за этого паразита. В процессе спорообразования многие штаммы Bt производят кристаллические белки (белковые включения), называемые дельта-эндотоксинами, обладающими инсектицидным действием. Это привело к их использованию в качестве инсектицидов, а в последнее время – к созданию генетически модифицированных культур, содержащих гены Bt, таких как Bt-кукуруза. Однако многие штаммы Bt, производящие кристаллы, не обладают инсектицидными свойствами. Подвид israelensis обычно используется для борьбы с комарами и личинками грибных комариков. В качестве токсического механизма кри-белки связываются со специфическими рецепторами на мембранах клеток среднего кишечника (эпителия) целевых вредителей, вызывая их разрушение. Другие организмы (включая людей, других животных и нецелевых насекомых), не имеющие соответствующих рецепторов в кишечнике, не подвержены воздействию кри-белка и, следовательно, не страдают от Bt.
Таксономия и открытие
В 1902 году B. thuringiensis впервые был обнаружен в шелкопрядах японским инженером-серикультором Ишиватари Шигетане (石渡 繁胤). Он назвал его B. sotto, используя японское слово (卒倒), здесь подразумевая бациллярный паралич. В 1911 году немецкий микробиолог Эрнст Берлинер повторно открыл его, выделив как причину заболевания, известного как Шлаффсухт, у гусениц мучной моли в Тюрингии (отсюда и видовой эпитет thuringiensis, "тюрингский"). B. sotto впоследствии был классифицирован как B. thuringiensis var. sotto. В 1976 году Роберт А. Захарян сообщил об обнаружении плазмиды в штамме B. thuringiensis и предположил, что плазмида участвует в формировании эндоспор и кристаллов. B. thuringiensis тесно связан с B. cereus, почвенной бактерией, и B. anthracis, возбудителем сибирской язвы; три организма различаются в основном своими плазмидами. Как и другие представители рода, все три способны образовывать эндоспоры.
Расположение в группы по видам
B. thuringiensis относится к группе Bacillus cereus, которая определяется по-разному: либо как семь близкородственных видов: B. cereus sensu stricto (B. cereus), B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. cytotoxicus, либо как шесть видов в Bacillus cereus sensu lato: B. weihenstephanensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. cereus, B. thuringiensis и B. anthracis. Внутри этой группы B. thuringiensis более тесно связана с B. cereus. Она более отдаленно связана с B. weihenstephanensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. cytotoxicus.
Подвиды
Существует несколько десятков признанных подвидов *B. thuringiensis*. Подвиды, обычно используемые в качестве инсектицидов, включают *B. thuringiensis* подвид *kurstaki* (Btk), подвид *israelensis* (Bti) и *aizawa* (Bta). Некоторые линии Bti являются клональными. Cry-токсины обладают специфической активностью против видов насекомых отрядов Чешуекрылые (мотыльки и бабочки), Двукрылые (мухи и комары), Жесткокрылые (жуки) и Перепончатокрылые (осы, пчелы, муравьи и пилильщики), а также против нематод. Конкретным примером использования *B. thuringiensis* против жуков является борьба с колорадским картофельным жуком в посевах картофеля. Таким образом, *B. thuringiensis* служит важным резервуаром Cry-токсинов для производства биологических инсектицидов и генетически модифицированных культур, устойчивых к насекомым. Когда насекомые проглатывают кристаллы токсина, их щелочные пищеварительные тракты денатурируют нерастворимые кристаллы, делая их растворимыми и, следовательно, доступными для расщепления протеазами, содержащимися в кишечнике насекомых, что приводит к высвобождению токсина из кристалла. Насекомое прекращает питаться и погибает от голода; живые бактерии Bt также могут колонизировать насекомое, что может способствовать его гибели. Смерть наступает в течение нескольких часов или недель. Бактерии средней кишки восприимчивых личинок могут быть необходимы для инсектицидной активности *B. thuringiensis*. Малая РНК *B. thuringiensis*, называемая BtsR1, может подавлять экспрессию Cry5Ba-токсина вне организма хозяина, связываясь с RBS-сайтом транскрипта Cry5Ba-токсина, чтобы избежать поведенческих защитных реакций нематод. В результате подавления увеличивается поглощение бактерий *C. elegans*. После попадания внутрь экспрессия BtsR1 снижается, что приводит к выработке Cry5Ba-токсина и гибели хозяина. В 1996 году был открыт еще один класс инсектицидных белков в Bt: вегетативные инсектицидные белки (Vip). Белки Vip не имеют последовательного гомологии с белками Cry, как правило, не конкурируют за одни и те же рецепторы, и некоторые убивают насекомых, отличных от тех, которых убивают белки Cry. Белки параспориновой группы определяются как *B. thuringiensis* и связанные с ними бактериальные параспориновые белки, которые не являются гемолитическими, но способны избирательно уничтожать раковые клетки. По состоянию на январь 2013 года параспорины включают шесть подсемейств: от PS1 до PS6.
Использование споров и белков в борьбе с вредителями
Споры и кристаллические инсектицидные белки, продуцируемые B. thuringiensis, используются для борьбы с насекомыми-вредителями с 1920-х годов и часто применяются в виде жидких спреев. В настоящее время они применяются как специфические инсектициды под торговыми названиями, такими как DiPel и Thuricide. Благодаря своей специфичности эти пестициды считаются экологически безопасными, оказывая незначительное или отсутствие влияния на человека, дикую природу, опылителей и большинство других полезных насекомых, и используются в органическом земледелии. В 2012 году европейский регуляторный экспертный анализ пяти одобренных штаммов показал, что, хотя данные, подтверждающие некоторые заявления о низкой токсичности для человека и окружающей среды, существуют, их недостаточно для обоснования многих из этих заявлений. Новые штаммы Bt разрабатываются и внедряются со временем, поскольку насекомые вырабатывают устойчивость к Bt, или возникает необходимость индуцировать мутации для изменения характеристик организма, или использовать гомологичную рекомбинантную генную инженерию для улучшения размера кристаллов и повышения пестицидной активности, или расширить круг хозяев Bt и получить более эффективные препараты. Каждому новому штамму присваивается уникальный номер и он регистрируется в Агентстве по охране окружающей среды США (U.S. EPA), при этом разрешение на генетическую модификацию может быть выдано в зависимости от "родительских штаммов, предлагаемого режима применения пестицида, а также способа и степени генетической модификации организма". Препараты Bt, одобренные для использования в органическом земледелии в США, перечислены на веб-сайте Института обзора органических материалов (OMRI), а на нескольких сайтах сельскохозяйственных консультативных служб университетов можно найти рекомендации по применению препаратов спор или белков Bt в органическом земледелии. Табак Bt так и не был коммерциализирован; растения табака используются для тестирования генетических модификаций, поскольку они легко поддаются генетическим манипуляциям и не входят в состав пищевых продуктов.
Использование
В 1995 году БТ-картофель был одобрен Агентством по охране окружающей среды как безопасный, что сделало его первой генетически модифицированной культурой, производящей пестициды, одобренной в США, хотя многие растения производят пестициды естественным путем, включая табак, кофейные растения, какао, хлопок и черный орех. Это был картофель "New Leaf", который был снят с рынка в 2001 году из-за отсутствия интереса. В 1996 году была одобрена кукуруза Bt, которая уничтожала европейского кукурузного сверлильщика и родственные виды; впоследствии были внедрены гены Bt, уничтожающие личинок кукурузного корневого жука. Гены Bt, внедренные в культуры и одобренные для использования, включают в себя, по отдельности и в комбинации: Cry1A.105, CryIAb, CryIF, Cry2Ab, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, mCry3A и VIP, а культуры включают кукурузу и хлопок. Кукуруза, генетически модифицированная для производства VIP, была впервые одобрена в США в 2010 году. В Индии к 2014 году более семи миллионов хлопкоробов, обрабатывающих двадцать шесть миллионов акров, перешли на использование БТ-хлопка. Компания Monsanto разработала БТ-сою и ген устойчивости к глифосату для бразильского рынка, который прошел бразильский процесс регулирования в 2010 году. Были разработаны гибриды осины Bt, в частности, Populus. Они меньше повреждаются насекомыми-фитофагами. Однако результаты оказались не полностью положительными: ожидаемый результат – повышение выхода древесины – не был достигнут, преимуществ в росте не наблюдалось, несмотря на снижение повреждений от фитофагов; один из основных вредителей по-прежнему поражает трансгенные деревья; кроме того, их опавшая листва разлагается иначе из-за трансгенных токсинов, что приводит к изменениям в популяциях водных насекомых вблизи.
Исследования безопасности
Использование Bt-токсинов в качестве растительных инсектицидов потребовало всесторонней оценки их безопасности для применения в пищевых продуктах и потенциального нецелевого воздействия на окружающую среду.
Оценка риска в пище
Опасения относительно безопасности потребления генетически модифицированных растительных материалов, содержащих белки Cry, были учтены в ходе обширных исследований оценки диетического риска. В качестве токсического механизма белки Cry связываются со специфическими рецепторами на мембранах клеток среднего кишечника (эпителия) целевых вредителей, вызывая их разрушение. Хотя целевые вредители подвергаются воздействию токсинов главным образом через листья и стебли, белки Cry также экспрессируются в других частях растения, включая незначительное количество в зернах кукурузы, которые в конечном итоге потребляются как людьми, так и животными. Однако другие организмы (включая людей, других животных и нецелевых насекомых), не имеющие соответствующих рецепторов в кишечнике, не подвержены воздействию белков Cry и, следовательно, не затронуты Bt-токсинами. Исследования других известных токсичных белков также свидетельствуют о том, что Bt-токсины не токсичны для млекопитающих. Результаты токсикологических исследований дополнительно подтверждаются отсутствием наблюдаемой токсичности при десятилетиях использования *Bacillus thuringiensis* и его кристаллических белков в качестве инсектицидного спрея.
Исследования аллергенности
Введение нового белка вызвало опасения относительно потенциальной возможности аллергических реакций у восприимчивых людей. Биоинформатический анализ известных аллергенов не выявил риска аллергических реакций при употреблении Bt-токсинов. Кроме того, кожные пробы с использованием очищенного Bt-белка не показали обнаружимой продукции IgE-антител, специфичных к токсину, даже у пациентов с атопическим дерматитом.
Исследования пищеварительности
Были проведены исследования для оценки дальнейшей судьбы Bt-токсинов при употреблении в пищу. Показано, что белки Bt-токсина расщепляются в течение нескольких минут при воздействии имитированных желудочных соков. Нестабильность этих белков в пищеварительных жидкостях является дополнительным свидетельством маловероятности аллергенности белков Cry, поскольку большинство известных пищевых аллергенов устойчивы к расщеплению и в конечном итоге абсорбируются в тонком кишечнике.
Устойчивость в окружающей среде
Исследовались опасения относительно возможного воздействия на окружающую среду, вызванного накоплением Bt-токсинов в тканях растений, распространением пыльцы и прямым выделением из корней. Bt-токсины могут сохраняться в почве более 200 дней, с периодом полураспада от 1,6 до 22 дней. Значительная часть токсина быстро разлагается микроорганизмами в окружающей среде, в то время как некоторая часть адсорбируется органическим веществом и сохраняется дольше. Однако некоторые исследования утверждают, что токсины не сохраняются в почве. Bt-токсины менее склонны к накоплению в водоемах, но пыльца или поверхностный сток могут переносить их в водные экосистемы. Рыбы не чувствительны к Bt-токсинам при воздействии на них.
Влияние на нецелевые организмы
Токсичное действие белков Bt оказывает негативное влияние на многих крупных вредителей сельскохозяйственных культур, однако были проведены некоторые оценки экологического риска для обеспечения безопасности полезных нецелевых организмов, которые могут контактировать с этими токсинами. Токсичность для бабочки монарха, как показали исследования, не достигает опасных уровней. Большинство почвенных организмов, потенциально подвергающихся воздействию Bt-токсинов через корневые выделения, вероятно, не страдают от выращивания Bt-культур.
Устойчивость к насекомым
У многих насекомых развилась устойчивость к *Bacillus thuringiensis*. В ноябре 2009 года ученые компании Monsanto обнаружили, что розовый хлопковый червь приобрел устойчивость к хлопку Bt первого поколения в некоторых районах штата Гуджарат, Индия. Это поколение экспрессирует один ген Bt – Cry1Ac. Это был первый в мире подтвержденный компанией Monsanto случай устойчивости к Bt. В ответ компания Monsanto представила хлопок второго поколения, содержащий несколько белков Bt, который был быстро принят фермерами. Кроме того, устойчивость к Bt была зафиксирована в полевых популяциях капустной моли на Гавайях, в континентальной части США и в Азии. Исследования на капустнице показали, что мутация в мембранном транспортере ABCC2 может обуславливать устойчивость к Bt Cry1Ac.
Вторичные вредители
В нескольких исследованиях зафиксировано всплеск численности "сосущих вредителей" (которые не восприимчивы к Bt-токсинам) в течение нескольких лет после внедрения Bt-хлопка. В Китае основной проблемой стали мириды, которые в некоторых случаях "полностью нивелировали все преимущества от выращивания Bt-хлопка". Увеличение численности сосущих вредителей зависело от местных температурных условий и количества осадков и наблюдалось в половине исследованных деревень. Рост использования инсектицидов для борьбы с этими вторичными вредителями был значительно меньше, чем сокращение общего объема использования инсектицидов благодаря внедрению Bt-хлопка. Другое исследование, проведенное в пяти провинциях Китая, показало, что снижение использования пестицидов при выращивании Bt-сортам хлопка значительно ниже, чем сообщалось в других исследованиях, что соответствует гипотезе, предложенной в недавних работах, о том, что со временем требуется больше обработок пестицидами для борьбы с возникающими вторичными вредителями, такими как тли, паутинные клещи и клопы-лигусы. Аналогичные проблемы были зафиксированы в Индии, как с мучнистыми червецами, так и с тлями, хотя исследование небольших индийских ферм в период с 2002 по 2008 год показало, что внедрение Bt-хлопка привело к повышению урожайности и снижению использования пестицидов, причем со временем это снижение продолжалось.
Противоречия
Споры, связанные с использованием Bt-токсина, являются одними из многочисленных споров вокруг генетически модифицированных продуктов питания в целом.
Токсичность для лепидоптер
Наиболее широко освещаемой проблемой, связанной с Bt-культурами, является утверждение о том, что пыльца Bt-кукурузы может погубить бабочку-монарха. Публикация вызвала общественный резонанс и демонстрации против Bt-кукурузы; однако к 2001 году несколько последующих исследований, координированных USDA, показали, что "наиболее распространенные типы пыльцы Bt-кукурузы не токсичны для личинок монарха в концентрациях, с которыми насекомые могут столкнуться в полевых условиях". Аналогично, B. thuringiensis широко используется для борьбы с личинками Spodoptera littoralis из-за их вредоносной деятельности в Африке и Южной Европе. Однако S. littoralis продемонстрировала устойчивость ко многим штаммам B. thuringiensis и эффективно контролировалась лишь немногими из них.
Генетическое смешивание дикой кукурузы
В исследовании, опубликованном в журнале Nature в 2001 году, сообщалось об обнаружении генов кукурузы, содержащих Bt, в кукурузе в ее центре происхождения, Оахаке (Мексика). В другой статье, опубликованной в Nature в 2002 году, утверждалось, что вывод предыдущей работы был результатом артефакта, вызванного обратной полимеразной цепной реакцией, и что «имеющихся данных недостаточно для обоснования публикации исходной статьи». Вокруг этой статьи и беспрецедентного заявления Nature разгорелись значительные споры. Последующее масштабное исследование, проведенное в 2005 году, не выявило никаких признаков генетического смешения в Оахаке. Исследование 2007 года показало, что «трансгенные белки, экспрессируемые в кукурузе, были обнаружены в двух (0,96%) из 208 образцов, взятых с полей фермеров, расположенных в двух (8%) из 25 отобранных общин». Мексика импортирует значительное количество кукурузы из США, и благодаря формальным и неформальным сетям обмена семенами среди фермеров существует множество потенциальных путей проникновения трансгенной кукурузы в пищевые и кормовые цепи. Одно исследование показало небольшое (около 1%) внедрение трансгенных последовательностей в исследованных полях в Мексике; оно не предоставило доказательств ни в пользу, ни против наследования этого внедренного генетического материала следующим поколением растений. Это исследование сразу же подверглось критике, и рецензент отметил: «Генетически любое растение должно быть либо нетрансгенным, либо трансгенным, следовательно, для листовой ткани одного трансгенного растения ожидается уровень ГМО, близкий к 100%. В своем исследовании авторы решили классифицировать образцы листьев как трансгенные, несмотря на уровни ГМО около 0,1%. Мы полагаем, что такие результаты ошибочно интерпретируются как положительные и, скорее всего, указывают на загрязнение в лаборатории».
Расстройство коллапса колонии
В 2007 году новое явление, известное как расстройство разрушения пчелиных семей (CCD), начало поражать пчелиные ульи по всей Северной Америке. Первоначальные предположения о возможных причинах включали новых паразитов, использование пестицидов и применение трансгенных культур Bt. Консорциум исследований и распространения знаний в области пчеловодства Средней Атлантики не обнаружил доказательств негативного влияния пыльцы культур Bt на пчел. По данным Министерства сельского хозяйства США, "генетически модифицированные (ГМ) культуры, чаще всего кукуруза Bt, рассматривались как причина CCD. Однако не выявлено корреляции между районами выращивания ГМ-культур и распространением случаев CCD. Кроме того, ГМ-культуры широко выращиваются с конца 1990-х годов, но CCD проявилось только в 2006 году. Более того, о CCD сообщалось в странах, где выращивание ГМ-культур запрещено, например, в Швейцарии. Немецкие исследователи в одном исследовании отметили возможную связь между воздействием пыльцы Bt и снижением иммунитета к нозематозу". Фактическая причина CCD оставалась неизвестной в 2007 году, и ученые полагают, что она может иметь несколько усугубляющих факторов.
Бета-экзотоксины
Некоторые изоляты B. thuringiensis продуцируют класс инсектицидных малых молекул, называемых бета-экзотоксинами, общее название которых – тюрингиензин. В итоговом документе, подготовленном ОЭСР, говорится: «Бета-экзотоксины известны своей токсичностью для человека и практически всех других форм жизни, и их присутствие запрещено в микробиологических препаратах на основе B. thuringiensis». Тюрингиензины являются аналогами нуклеозидов. Они ингибируют активность РНК-полимеразы – процесс, общий для всех живых организмов, как у крыс, так и у бактерий.
Другие хозяева
Оппортунистический патоген для животных, отличных от насекомых, вызывающий некроз, легочные инфекции и/или пищевые отравления. Распространенность этого явления неизвестна, поскольку случаи обычно диагностируются как инфекции B. cereus, и крайне редко проводится тестирование на наличие белков Cry и Cyt – единственного признака, отличающего B. thuringiensis от B. cereus.