Электропорация: метод создания пор в клеточных мембранах.

Введение

Метод в молекулярной биологии для создания пор в клеточных мембранах.

Электропорация, или электропермеабилизация, – это техника, при которой к клеткам прикладывается электрическое поле для повышения проницаемости клеточной мембраны. Это может позволить вводить в клетку химические вещества, лекарства, электродные матрицы или ДНК (также называемое электротрансфером). В микробиологии электропорация часто используется для трансформации бактерий, дрожжей или растительных протопластов путем введения новой кодирующей ДНК. Если бактерии и плазмиды смешиваются, плазмиды могут быть перенесены в бактерии после электропорации, хотя в зависимости от переносимого материала также могут использоваться пептиды, проникающие в клетки, или метод «сжатия клеток». Электропорация осуществляется путем пропускания тысяч вольт (~8 кВ/см) через суспендированные клетки в электропорационной кювете. Электропорация также высокоэффективна для введения чужеродных генов в клетки культуры тканей, особенно млекопитающих. Например, она используется в процессе создания нокаутных мышей, а также при лечении опухолей, генной терапии и клеточной терапии. Процесс введения чужеродной ДНК в эукариотические клетки известен как трансфекция. Электропорация очень эффективна для трансфекции клеток в суспензии с использованием электропорационных кювет. Электропорация также показала свою эффективность при использовании на тканях in vivo, для применений in utero, а также для трансфекции in ovo. Адгезионные клетки также могут быть трансфицированы с помощью электропорации, предоставляя исследователям альтернативу трипсину перед трансфекцией. Однако одним из недостатков электропорации является то, что после процедуры может быть нарушена экспрессия более 7000 генов. Это может вызвать проблемы в исследованиях, где необходимо контролировать экспрессию генов для обеспечения точных и достоверных результатов. Хотя макроэлектропорация имеет много преимуществ по сравнению с физическими методами доставки, такими как микроинъекции и генные пушки, она все еще имеет ограничения, включая низкую жизнеспособность клеток. Была изучена миниатюризация электропорации, что привело к микроэлектропорации и нанотрансфекции тканей с использованием методов, основанных на электропорации, через наноканалы для минимально инвазивной доставки груза в клетки. Электропорация также используется в качестве механизма для запуска клеточного слияния. Искусственно индуцированное клеточное слияние может использоваться для изучения и лечения различных заболеваний, таких как диабет, регенерации аксонов центральной нервной системы и производства клеток с желаемыми свойствами, например, в клеточных вакцинах для иммунотерапии рака. Однако первым и наиболее известным применением клеточного слияния является производство моноклональных антител в технологии гибридом, где гибридные клеточные линии (гибридомы) образуются путем слияния специфических антителопродуцирующих B-лимфоцитов с миеломной клеточной линией (раковой линией B-лимфоцитов).

Electroporation, or electropermeabilization, is a technique in which an electrical field is applied to cells in order to increase the permeability of the cell membrane. This may allow chemicals, drugs, electrode arrays or DNA to be introduced into the cell (also called electrotransfer). In microbiology, the process of electroporation is often used to transform bacteria, yeast, or plant protoplasts by introducing new coding DNA. If bacteria and plasmids are mixed together, the plasmids can be transferred into the bacteria after electroporation, though depending on what is being transferred, cell penetrating peptides or cell squeeze could also be used. Electroporation works by passing thousands of volts (~8 kV/cm) across suspended cells in an electroporation cuvette. Electroporation is also highly efficient for the introduction of foreign genes into tissue culture cells, especially mammalian cells. For example, it is used in the process of producing knockout mice, as well as in tumor treatment, gene therapy, and cell based therapy. The process of introducing foreign DNA into eukaryotic cells is known as transfection. Electroporation is highly effective for transfecting cells in suspension using electroporation cuvettes. Electroporation has proven efficient for use on tissues in vivo, for in utero applications as well as in ovo transfection. Adherent cells can also be transfected using electroporation, providing researchers with an alternative to trypsinizing their cells prior to transfection. One downside to electroporation, however, is that after the process the gene expression of over 7,000 genes can be affected. This can cause problems in studies where gene expression has to be controlled to ensure accurate and precise results. Although bulk electroporation has many benefits over physical delivery methods such as microinjections and gene guns, it still has limitations, including low cell viability. Miniaturization of electroporation has been studied, leading to microelectroporation and nanotransfection of tissue utilizing electroporation based techniques via nanochannels to minimally invasively deliver cargo to the cells. Electroporation has also been used as a mechanism to trigger cell fusion. Artificially induced cell fusion can be used to investigate and treat different diseases, like diabetes, regenerate axons of the central nerve system, and produce cells with desired properties, such as in cell vaccines for cancer immunotherapy. However, the first and most known application of cell fusion is production of monoclonal antibodies in hybridoma technology, where hybrid cell lines (hybridomas) are formed by fusing specific antibody producing B lymphocytes with a myeloma (B lymphocyte cancer) cell line.

Лабораторная практика

Электропорация выполняется с помощью электропораторов – приборов, специально разработанных для создания электростатического поля в клеточном растворе. Суспензию клеток пипетируют в стеклянную или пластиковую кувету с двумя алюминиевыми электродами по бокам. Для бактериальной электропорации обычно используют суспензию объемом около 50 микролитров. Перед электропорацией эту суспензию бактерий смешивают с плазмидой для трансформации. Смесь пипетируют в кувету, устанавливают напряжение и ёмкость, а затем вставляют кувету в электропоратор. Процесс требует непосредственного контакта между электродами и суспензией. Сразу после электропорации к бактериям добавляют 1 миллилитр жидкой среды (в кувете или в пробирке Эппендорфа) и инкубируют пробирку при оптимальной для бактерий температуре в течение часа или более для восстановления клеток и экспрессии плазмиды, после чего проводят культивирование бактерий на агарных пластинах. Успех электропорации во многом зависит от чистоты плазмидного раствора, особенно от его солевого содержания. Растворы с высокой концентрацией соли могут вызывать электрический пробой (известный как дуга), который часто снижает жизнеспособность бактерий. Для более детального изучения процесса следует уделять больше внимания выходному импедансу электропоратора и входному импедансу клеточной суспензии (например, содержанию соли). Поскольку клеточная мембрана не пропускает ток (за исключением ионных каналов), она действует как электрический конденсатор. Воздействие на мембраны высоким напряжением приводит к их временному разрушению, формированию пор, достаточно больших для проникновения макромолекул (таких как ДНК) внутрь или наружу клетки. Кроме того, электропорацию можно использовать для повышения проницаемости клеток при инъекциях и операциях in utero. В частности, электропорация обеспечивает более эффективную трансфекцию ДНК, РНК, shRNA и всех нуклеиновых кислот в клетки мышей и крыс. Успех in vivo электропорации во многом зависит от напряжения, количества повторений, импульсов и продолжительности. Развивающаяся центральная нервная система наиболее эффективна для in vivo электропорации благодаря видимости желудочков для инъекций нуклеиновых кислот и повышенной проницаемости делящихся клеток. Электропорация эмбрионов, введенных in utero, проводится через стенку матки, часто с использованием электродов-форцепсов для минимизации повреждения эмбриона.

Electroporation is performed with electroporators, purpose built appliances that create an electrostatic field in a cell solution. The cell suspension is pipetted into a glass or plastic cuvette which has two aluminium electrodes on its sides. For bacterial electroporation, typically a suspension of around 50 microliters is used. Prior to electroporation, this suspension of bacteria is mixed with the plasmid to be transformed. The mixture is pipetted into the cuvette, the voltage and capacitance are set, and the cuvette is inserted into the electroporator. The process requires direct contact between the electrodes and the suspension. Immediately after electroporation, one milliliter of liquid medium is added to the bacteria (in the cuvette or in an Eppendorf tube), and the tube is incubated at the bacteria's optimal temperature for an hour or more to allow recovery of the cells and expression of the plasmid, followed by bacterial culture on agar plates. The success of the electroporation depends greatly on the purity of the plasmid solution, especially on its salt content. Solutions with high salt concentrations might cause an electrical discharge (known as arcing), which often reduces the viability of the bacteria. For a further detailed investigation of the process, more attention should be paid to the output impedance of the porator device and the input impedance of the cells suspension (e. g. salt content). Since the cell membrane is not able to pass current (except in ion channels), it acts as an electrical capacitor. Subjecting membranes to a high voltage electric field results in their temporary breakdown, resulting in pores that are large enough to allow macromolecules (such as DNA) to enter or leave the cell. Additionally, electroporation can be used to increase permeability of cells during in Utero injections and surgeries. Particularly, the electroporation allows for a more efficient transfection of DNA, RNA, shRNA, and all nucleic acids into the cells of mice and rats. The success of in vivo electroporation depends greatly on voltage, repetition, pulses, and duration. Developing central nervous systems are most effective for in vivo electroporation due to the visibility of ventricles for injections of nucleic acids, as well as the increased permeability of dividing cells. Electroporation of injected in utero embryos is performed through the uterus wall, often with forceps type electrodes to limit damage to the embryo.

Исследования in vitro и на животных

Впервые генная электротрансфера in vivo была описана в 1991 году, и на сегодняшний день существует множество доклинических исследований генной электротрансферы. Метод используется для доставки широкого спектра терапевтических генов для потенциального лечения различных заболеваний, таких как: нарушения иммунной системы, опухоли, метаболические нарушения, моногенные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, обезболивание.

Что касается необратимой электропорации, первое успешное лечение злокачественных кожных опухолей, имплантированных мышам, было проведено в 2007 году группой ученых, которым удалось добиться полной абляции опухоли у 12 из 13 мышей. Это было достигнуто путем подачи 80 импульсов длительностью 100 микросекунд с частотой 0,3 Гц и напряженностью электрического поля 2500 В/см для лечения кожных опухолей. В настоящее время ряд компаний, включая AngioDynamics, Inc. и VoltMed, Inc., продолжают разрабатывать и внедрять технологии, основанные на необратимой электропорации, в клиническую практику. Первую группу, изучавшую электропорацию для медицинских целей, возглавлял Луис М. Мир в Институте Густава Русси. В этом случае они рассматривали использование обратимой электропорации в сочетании с непроницаемыми макромолекулами. Первое исследование, посвященное возможному применению наносекундных импульсов на клетках человека, было проведено исследователями из Медицинской школы Восточной Вирджинии и Университета Олд-Доминион и опубликовано в 2003 году.

Медицинские применения

Первое медицинское применение электропорации было использовано для введения плохо проникающих противораковых препаратов в опухолевые узлы. Вскоре генная электротрансфера также стала представлять особый интерес благодаря своей низкой стоимости, простоте реализации и безопасности. Вирусные векторы могут иметь серьезные ограничения с точки зрения иммуногенности и патогенности при использовании для передачи ДНК. Необратимая электропорация используется и оценивается как терапия абляции сердца для уничтожения очень небольших участков сердечной мышцы, что применяется для лечения нарушений сердечного ритма. Сердечный катетер доставляет серии высоковольтных ультрабыстрых электрических импульсов, которые формируют необратимые поры в клеточных мембранах, приводя к гибели клеток. Считается, что этот метод обеспечивает лучшую селективность, чем предыдущие техники, использовавшие тепло или холод для уничтожения больших объемов мышечной ткани. На свиньях было установлено, что более высокое напряжение электропорации необратимо разрушает целевые клетки в узком диапазоне, не затрагивая соседние, что делает его перспективным новым методом лечения рака, сердечных заболеваний и других состояний, требующих удаления ткани. Необратимая электропорация (IRE) с тех пор доказала свою эффективность в лечении рака у людей, и хирурги в Johns Hopkins и других учреждениях теперь используют эту технологию для лечения рака поджелудочной железы, ранее считавшегося неоперабельным. Также было опубликовано первое клиническое исследование фазы I по генной электротрансфере у пациентов с метастатической меланомой. Была проведена электропорационная доставка плазмиды, кодирующей ген интерлейкина 12 (pIL 12), и осуществлялся мониторинг безопасности, переносимости и терапевтического эффекта. Исследование показало, что генная электротрансфера с pIL 12 безопасна и хорошо переносится. Кроме того, частичный или полный ответ наблюдался также в отдаленных нелеченных метастазах, что указывает на системный эффект лечения. На основании этих результатов планируется переход к клиническому исследованию фазы II. В настоящее время проводится несколько клинических исследований генной электротрансфере, в которых оцениваются безопасность, переносимость и эффективность иммунизации ДНК-вакциной, вводимой с помощью электрических импульсов. Хотя метод является строго локальным, а не системным, он остается наиболее эффективной не вирусной стратегией доставки генов.

The first medical application of electroporation was used for introducing poorly permeant anticancer drugs into tumor nodules. Soon also gene electrotransfer became of special interest because of its low cost, easiness of realization and safety. Namely, viral vectors can have serious limitations in terms of immunogenicity and pathogenicity when used for DNA transfer. Irreversible electroporation is being used and evaluated as cardiac ablation therapy to kill very small areas of heart muscle. This is done to treat irregularities of heart rhythm. A cardiac catheter delivers trains of high voltage ultra rapid electrical pulses that form irreversible pores in cell membranes, resulting in cell death. It is thought to allow better selectivity than the previous techniques, which used heat or cold to kill larger volumes of muscle. A higher voltage of electroporation was found in pigs to irreversibly destroy target cells within a narrow range while leaving neighboring cells unaffected, and thus represents a promising new treatment for cancer, heart disease and other disease states that require removal of tissue. Irreversible electroporation (IRE) has since proven effective in treating human cancer, with surgeons at Johns Hopkins and other institutions now using the technology to treat pancreatic cancer previously thought to be unresectable. Also first phase I clinical trial of gene electrotransfer in patients with metastatic melanoma was reported. Electroporation mediated delivery of a plasmid coding gene for interleukin 12 (pIL 12) was performed and safety, tolerability and therapeutic effect were monitored. Study concluded, that gene electrotransfer with pIL 12 is safe and well tolerated. In addition partial or complete response was observed also in distant non treated metastases, suggesting the systemic treatment effect. Based on these results they are already planning to move to Phase II clinical study. There are currently several ongoing clinical studies of gene electrotransfer where safety, tolerability and effectiveness of immunization with DNA vaccine, which is administered by the electric pulses is monitored. Although the method is not systemic, but strictly local one, it is still the most efficient non viral strategy for gene delivery.

N-TIRE

Недавний метод, называемый нетермической необратимой электропорацией (N TIRE), показал свою эффективность в лечении различных типов опухолей и других нежелательных тканей. Процедура выполняется с использованием небольших электродов (около 1 мм в диаметре), которые помещаются внутрь или вокруг целевой ткани для подачи коротких, повторяющихся импульсов электричества с заранее заданным напряжением и частотой. Эти импульсы электричества повышают потенциал покоя трансмембраны (ТМП), что приводит к образованию нанопор в плазматической мембране. Когда приложенное к ткани электричество превышает электрический порог для данной ткани, клетки становятся необратимо проницаемыми из-за формирования нанопор. В результате клетки не способны восстановить повреждения и погибают из-за нарушения гомеостаза. N TIRE отличается от других методов абляции опухолей тем, что не вызывает термического повреждения окружающих тканей.

Обратная электропорация

Напротив, обратимая электропорация происходит, когда электричество, подаваемое через электроды, ниже электрического порогового значения целевой ткани. Поскольку подаваемое электричество ниже порога чувствительности клеток, это позволяет клеткам восстановить свой фосфолипидный бислой и продолжить нормальное функционирование. Обратимая электропорация обычно используется в методах лечения, направленных на доставку лекарственного препарата или гена (или другой молекулы, которая обычно не проницаема для клеточной мембраны) внутрь клетки. Электрический порог чувствительности различается в разных тканях, поэтому перед лечением необходимо проводить тщательные расчеты для обеспечения безопасности и эффективности. Одним из основных преимуществ использования N TIRE является то, что при правильном выполнении, согласно точным расчетам, он воздействует исключительно на целевую ткань. Белки, внеклеточный матрикс и критически важные структуры, такие как кровеносные сосуды и нервы, остаются неповрежденными и здоровыми после лечения. Это обеспечивает более быстрое восстановление и способствует более быстрой замене погибших опухолевых клеток здоровыми. Перед проведением процедуры ученые должны тщательно рассчитать необходимые параметры и проводить лечение каждого пациента индивидуально. Для этого обычно используются методы визуализации, такие как компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), для создания трехмерного изображения опухоли. На основе этой информации они могут оценить объем опухоли и определить оптимальный план лечения, включая место введения электродов, угол их введения, необходимое напряжение и другие параметры, используя программное обеспечение. Часто КТ используется для помощи в позиционировании электродов во время процедуры, особенно при лечении опухолей головного мозга. Вся процедура выполняется очень быстро, обычно занимает около пяти минут. Показатели успешности этих процедур высоки. Кроме того, было показано, что H FIRE обеспечивает более предсказуемые абляции благодаря меньшей разнице в электрических свойствах тканей при более высоких частотах.

Contrastingly, reversible electroporation occurs when the electricity applied with the electrodes is below the electric field threshold of the target tissue. Because the electricity applied is below the cells' threshold, it allows the cells to repair their phospholipid bilayer and continue on with their normal cell functions. Reversible electroporation is typically done with treatments that involve getting a drug or gene (or other molecule that is not normally permeable to the cell membrane) into the cell. Not all tissue has the same electric field threshold; therefore careful calculations need to be made prior to a treatment to ensure safety and efficacy. One major advantage of using N TIRE is that, when done correctly according to careful calculations, it only affects the target tissue. Proteins, the extracellular matrix, and critical structures such as blood vessels and nerves are all unaffected and left healthy by this treatment. This allows for a quicker recovery, and facilitates a more rapid replacement of dead tumor cells with healthy cells. Before doing the procedure, scientists must carefully calculate exactly what needs to be done and treat each patient on an individual case by case basis. To do this, imaging technology such as CT scans and MRI's are commonly used to create a 3D image of the tumor. From this information, they can approximate the volume of the tumor and decide on the best course of action including the insertion site of electrodes, the angle they are inserted in, the voltage needed, and more, using software technology. Often, a CT machine will be used to help with the placement of electrodes during the procedure, particularly when the electrodes are being used to treat tumors in the brain. The entire procedure is very quick, typically taking about five minutes. The success rate of these procedures is high Furthermore, H FIRE has been demonstrated to produce more predictable ablations due to the lesser difference in the electrical properties of tissues at higher frequencies.

Доставка лекарств и генов

Электропорация также может быть использована для доставки лекарств или генов в клетку путем применения коротких и интенсивных электрических импульсов, которые временно повышают проницаемость клеточной мембраны, тем самым обеспечивая транспорт молекул, которые в противном случае не могли бы пройти через клеточную мембрану. Эта процедура называется электрохимиотерапией, когда транспортируемыми молекулами являются химиотерапевтические агенты, или генной электротрансферей, когда транспортируемой молекулой является ДНК. Ученые из Каролинского института и Оксфордского университета используют электропорацию экзосом для доставки сиРНК, антисмысловых олигонуклеотидов, химиотерапевтических агентов и белков непосредственно к нейронам после их системного введения (в кровь). Поскольку эти экзосомы способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, этот протокол может решить проблему недостаточной доставки лекарств в центральную нервную систему и потенциально лечить болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рак мозга, среди прочих заболеваний. Бактериальная трансформация обычно является самым простым способом получения больших количеств конкретного белка, необходимого для биотехнологических целей или в медицине. Поскольку генная электротрансфера – очень простая, быстрая и высокоэффективная техника, она изначально стала удобной заменой другим процедурам трансформации. Недавние исследования показали, что ударные волны можно использовать для предварительной обработки клеточной мембраны перед электропорацией. Эта синергетическая стратегия позволяет снизить требуемое внешнее напряжение и создавать более крупные поры. Кроме того, применение ударных волн позволяет нацеливаться на определенный участок мембраны. Эта процедура позволяет контролировать размер пор.

Физический механизм

Электропорация обеспечивает введение в клетки крупных высокозаряженных молекул, таких как ДНК, которые не способны пассивно диффундировать через гидрофобный бислойный барьер. Электропоры были визуализированы оптическими методами в моделях липидного бислоя, таких как биляры интерфейса капель и гигантские однослойные везикулы, при этом добавление цитоскелетных белков, таких как актиновые сети, к гигантским однослойным везикулам, по-видимому, предотвращает формирование видимых электропор. Также появились экспериментальные данные, свидетельствующие о роли актиновых сетей в регуляции проницаемости клеточной мембраны. Хотя электропорация и диэлектрический пробой оба являются результатом приложения электрического поля, лежащие в их основе механизмы принципиально различны. При диэлектрическом пробое барьерный материал ионизируется, создавая проводящий путь. Таким образом, изменение материала носит химический характер. В отличие от этого, при электропорации молекулы липидов не претерпевают химических изменений, а лишь смещаются, открывая поры, которые служат проводящим путем через бислой при его заполнении водой. Электропорация – это динамический процесс, зависящий от локального трансмембранного напряжения в каждой точке клеточной мембраны. Обычно считается, что для заданной длительности и формы импульса существует определенный порог трансмембранного напряжения, необходимый для проявления явления электропорации (от 0,5 В до 1 В). Это приводит к определению порогового значения величины электрического поля для электропорации (Eth). То есть, электропорации подвергаются только клетки в областях, где E ≥ Eth. Если достигается или превышается второй порог (Eir), электропорация ставит под угрозу жизнеспособность клеток, то есть происходит необратимая электропорация (IRE). Электропорация – это многоступенчатый процесс, состоящий из нескольких отчетливых фаз. Сначала необходимо приложить короткий электрический импульс. Типичные параметры составляют 300–400 мВ при продолжительности менее 1 мс через мембрану (следует отметить, что напряжения, используемые в клеточных экспериментах, обычно значительно выше, поскольку они прикладываются на больших расстояниях к основному раствору, поэтому результирующее поле через фактическую мембрану составляет лишь небольшую часть приложенного напряжения). При приложении этого потенциала мембрана заряжается как конденсатор за счет миграции ионов из окружающего раствора. После достижения критического поля происходит быстрая локализованная перестройка морфологии липидов. Получающаяся структура считается «предпорой», поскольку она не является электропроводящей, но быстро приводит к образованию проводящей поры. Доказательства существования таких предпор в основном основаны на «мерцании» пор, что указывает на переход между проводящим и изолирующим состояниями. Предполагается, что эти предпоры представляют собой небольшие (~3 Å) гидрофобные дефекты. Если эта теория верна, то переход в проводящее состояние можно объяснить перестройкой на краю поры, при которой липидные головки складываются, образуя гидрофильный интерфейс. Наконец, эти проводящие поры могут либо заживать, восстанавливая целостность бислоя, либо расширяться, в конечном итоге приводя к его разрыву. Дальнейшая судьба зависит от того, был ли превышен критический размер дефекта, что, в свою очередь, зависит от приложенного поля, местного механического напряжения и энергии краев бислоя.

Electroporation allows cellular introduction of large highly charged molecules such as DNA which would never passively diffuse across the hydrophobic bilayer core. Electropores were optically imaged in lipid bilayer models like droplet interface bilayers and giant unilamellar vesicles, while addition of cytoskeletal proteins such as actin networks to the giant unilamellar vesicles seem to prevent the formation of visible electropores. Experimental evidences for actin networks in regulating the cell membrane permeability has also emerged. Although electroporation and dielectric breakdown both result from application of an electric field, the mechanisms involved are fundamentally different. In dielectric breakdown the barrier material is ionized, creating a conductive pathway. The material alteration is thus chemical in nature. In contrast, during electroporation the lipid molecules are not chemically altered but simply shift position, opening up a pore which acts as the conductive pathway through the bilayer as it is filled with water. Electroporation is a dynamic phenomenon that depends on the local transmembrane voltage at each point on the cell membrane. It is generally accepted that for a given pulse duration and shape, a specific transmembrane voltage threshold exists for the manifestation of the electroporation phenomenon (from 0.5 V to 1 V). This leads to the definition of an electric field magnitude threshold for electroporation (Eth). That is, only the cells within areas where E≧Eth are electroporated. If a second threshold (Eir) is reached or surpassed, electroporation will compromise the viability of the cells, i. e., irreversible electroporation (IRE). Electroporation is a multi step process with several distinct phases. First, a short electrical pulse must be applied. Typical parameters would be 300–400 mV for < 1 ms across the membrane (note the voltages used in cell experiments are typically much larger because they are being applied across large distances to the bulk solution so the resulting field across the actual membrane is only a small fraction of the applied bias). Upon application of this potential the membrane charges like a capacitor through the migration of ions from the surrounding solution. Once the critical field is achieved there is a rapid localized rearrangement in lipid morphology. The resulting structure is believed to be a "pre pore" since it is not electrically conductive but leads rapidly to the creation of a conductive pore. Evidence for the existence of such pre pores comes mostly from the "flickering" of pores, which suggests a transition between conductive and insulating states. It has been suggested that these pre pores are small (~3 Å) hydrophobic defects. If this theory is correct, then the transition to a conductive state could be explained by a rearrangement at the pore edge, in which the lipid heads fold over to create a hydrophilic interface. Finally, these conductive pores can either heal, resealing the bilayer or expand, eventually rupturing it. The resultant fate depends on whether the critical defect size was exceeded which in turn depends on the applied field, local mechanical stress and bilayer edge energy.

Электропорация генов

Применение электрических импульсов достаточной силы к клетке вызывает увеличение трансмембранной разности потенциалов, что провоцирует дестабилизацию мембраны. Проницаемость клеточной мембраны повышается, и молекулы, которые обычно не проникают через нее, попадают внутрь клетки. Хотя механизмы электротрансфера генов еще не полностью понятны, было показано, что введение ДНК происходит только в части мембраны, обращенной к катоду, и для успешной трансфекции требуется несколько этапов: электрофоретическая миграция ДНК к клетке, внедрение ДНК в мембрану, транслокация через мембрану, миграция ДНК к ядру, перенос ДНК через ядерную оболочку и, наконец, экспрессия гена. На эффективность электротрансфера генов влияет ряд факторов, таких как: температура, параметры электрических импульсов, концентрация ДНК, используемый буфер для электропорации, размер клетки и способность клеток экспрессировать трансфицированные гены. При in vivo электротрансфере генов также критически важны диффузия ДНК через внеклеточный матрикс, свойства ткани и общая проводимость ткани.

История

В 1960-х годах было известно, что при воздействии внешнего электрического поля можно создать значительный мембранный потенциал на противоположных полюсах клетки. В 1970-х годах было установлено, что при достижении мембранным потенциалом критического уровня мембрана претерпевает пробой, но способна к восстановлению. К 1980-м годам этот пробой стали использовать для доставки различных веществ и молекул внутрь клеток.