Жасуша мембранасына тесік жасау әдісі: Электропорация

Кіріспе

Электропорация немесе электропермеабилизация – жасуша мембранасының өткізгіштігін арттыру үшін жасушаларға электр өрісін қолдану әдісі. Бұл химиялық заттардың, дәрілердің, электродтар жиынтығының немесе ДНК-ның жасушаға енгізілуіне мүмкіндік береді (электротрансфер деп те аталады). Микробиологияда электропорация процесі көбінесе бактерияларды, ашытқыларды немесе өсімдіктердің протопласттарын жаңа кодталатын ДНК енгізу арқылы түрлендіру үшін қолданылады. Бактериялар мен плазмидтер бірге араластырылса, плазмидтер электропорациядан кейін бактерияларға көшірілуі мүмкін, бірақ не көшірілетіндігіне байланысты жасушаға енетін пептидтер немесе жасушаны сығу да қолданылуы мүмкін. Электропорация мыңдаған вольт (~8 кВ/см) электрпорация куветі арқылы суспензиядағы жасушалар арқылы өткізіледі. Электропорация тіндердің культуралық жасушаларына, әсіресе сүтқоректі жасушаларына жат гендерді енгізуде де өте тиімді. Мысалы, ол нокаут егешқұрлыларын жасау процесінде, сондай-ақ ісіктерді емдеуде, гендік терапияда және жасушалық терапияда қолданылады. Эукариоттық жасушаларға жат ДНК енгізу процесі трансфекция деп аталады. Электропорация куветтерін қолдану арқылы суспензиядағы жасушаларды трансфекциялау үшін электропорация өте тиімді. Электропорация тіндерде in vivo, in utero қолданыстарында, сондай-ақ in ovo трансфекциясында тиімді екені дәлелденді. Жабысатын жасушаларды да электропорация арқылы трансфекциялауға болады, бұл зерттеушілерге трансфекциядан бұрын жасушаларын трипсинмен өңдеудің баламасын ұсынады. Дегенмен, электропорация процесінің бір кемшілігі – процесс аяқталғаннан кейін 7000-нан астам геннің экспрессиясына әсер етуі мүмкін. Бұл ген экспрессиясын бақылау қажет болатын зерттеулерде нақты және дұрыс нәтижелерді қамтамасыз етуде қиындықтар тудыруы мүмкін. Электропорация микроинъекциялар және гендік қарулар сияқты физикалық жеткізу әдістеріне қарағанда көптеген артықшылықтарға ие болса да, оның әлі де шектеулері бар, соның ішінде жасушалардың төмен тірі қалу деңгейі. Электропорацияны кішірейту зерттелді, нәтижесінде микроэлектропорация және тіндердің нанотрансфекциясы пайда болды. Наноарналар арқылы электропорацияға негізделген әдістерді қолдану арқылы жасушаларға жүк жеткізуге болады. Электропорация жасушалардың бірігуін іске қосу механизмі ретінде де қолданылған. Жасанды түрде туындаған жасушалық бірігу диабет сияқты әртүрлі ауруларды зерттеу және емдеу үшін, орталық нерв жүйесінің аксондарын қалпына келтіру үшін және қажетті қасиеттері бар жасушаларды өндіру үшін, мысалы, қатерлі ісіктерге қарсы иммунотерапияға арналған жасушалық вакциналарда қолданылуы мүмкін. Алайда, жасушалық бірігудің алғашқы және ең танымал қолданылуы – гибридтом технологиясында моноклоналды антиденелерді өндіру, онда гибридтік жасушалық желілер (гибридтомдар) В лимфоциттерін антидене өндіретін ерекше қасиеттерімен миелома (В лимфоциттерінің қатерлі ісігі) жасушалық желісімен біріктіру арқылы қалыптасады.

Method in molecular biology to make pores in cell membranes

Electroporation, or electropermeabilization, is a technique in which an electrical field is applied to cells in order to increase the permeability of the cell membrane. This may allow chemicals, drugs, electrode arrays or DNA to be introduced into the cell (also called electrotransfer). In microbiology, the process of electroporation is often used to transform bacteria, yeast, or plant protoplasts by introducing new coding DNA. If bacteria and plasmids are mixed together, the plasmids can be transferred into the bacteria after electroporation, though depending on what is being transferred, cell penetrating peptides or cell squeeze could also be used. Electroporation works by passing thousands of volts (~8 kV/cm) across suspended cells in an electroporation cuvette. Electroporation is also highly efficient for the introduction of foreign genes into tissue culture cells, especially mammalian cells. For example, it is used in the process of producing knockout mice, as well as in tumor treatment, gene therapy, and cell based therapy. The process of introducing foreign DNA into eukaryotic cells is known as transfection. Electroporation is highly effective for transfecting cells in suspension using electroporation cuvettes. Electroporation has proven efficient for use on tissues in vivo, for in utero applications as well as in ovo transfection. Adherent cells can also be transfected using electroporation, providing researchers with an alternative to trypsinizing their cells prior to transfection. One downside to electroporation, however, is that after the process the gene expression of over 7,000 genes can be affected. This can cause problems in studies where gene expression has to be controlled to ensure accurate and precise results. Although bulk electroporation has many benefits over physical delivery methods such as microinjections and gene guns, it still has limitations, including low cell viability. Miniaturization of electroporation has been studied, leading to microelectroporation and nanotransfection of tissue utilizing electroporation based techniques via nanochannels to minimally invasively deliver cargo to the cells. Electroporation has also been used as a mechanism to trigger cell fusion. Artificially induced cell fusion can be used to investigate and treat different diseases, like diabetes, regenerate axons of the central nerve system, and produce cells with desired properties, such as in cell vaccines for cancer immunotherapy. However, the first and most known application of cell fusion is production of monoclonal antibodies in hybridoma technology, where hybrid cell lines (hybridomas) are formed by fusing specific antibody producing B lymphocytes with a myeloma (B lymphocyte cancer) cell line.

Зертханалық тәжірибе

Электропорация электропораторлармен, арнайы жасалған құрылғылармен орындалады, олар жасушалық ерітіндіде электростатикалық өріс жасайды. Жасуша суспензиясы екі алюминий электродтары бар шыны немесе пластик куветкаға пипеткамен салынады. Бактериялық электропорация үшін әдетте шамамен 50 микролитр суспензия қолданылады. Электропорациядан бұрын, бактериялар суспензиясы трансформацияланатын плазмидпен араластырылады. Аралас суспензия куветкаға салынып, кернеу және сыйымдылық орнатылып, куветка электропораторға енгізіледі. Процесс электродтар мен суспензияның тікелей жанасуын қажет етеді. Электропорациядан кейін бірден бактерияларға 1 миллилитр сұйық орта қосылады (куветкада немесе Эппендорф түтігінде), түтік бактериялардың оңтайлы температурасында бір сағат немесе одан да көп уақытқа инкубацияланады, бұл жасушалардың қалпына келуіне және плазмидтің экспрессиясына мүмкіндік береді, содан кейін агар тақталарында бактериялық мәдениет өсіріледі. Электропорацияның сәттілігі плазмид ерітіндісінің тазалығына, әсіресе оның тұз концентрациясына тікелей байланысты. Жоғары тұз концентрациясы бар ерітінділер электр разрядына (арка деп аталады) әкелуі мүмкін, бұл көбінесе бактериялардың тірі қалу қабілетін төмендетеді. Процестің егжей-тегжейлі зерттеуі үшін портор құрылғысының шығыс импедансына және жасуша суспензиясының кіріс импедансына (мысалы, тұз концентрациясы) көбірек назар аудару керек. Жасуша мембранасы ток өткізбейтіндіктен (иондық каналдардан басқа), ол электрлік конденсатор ретінде әрекет етеді. Мембрананы жоғары кернеулі электр өрісіне ұшырату олардың уақытша бұзылуына әкеледі, нәтижесінде макромолекулалардың (мысалы, ДНК) жасушаға кіруіне немесе одан шығуына жеткілікті үлкен тесіктер пайда болады. Сонымен қатар, электропорация жатын ішіндегі инъекциялар мен хирургиялық операциялар кезінде жасушалардың өткізгіштігін арттыру үшін де қолданылуы мүмкін. Атап айтқанда, электропорация ДНК, РНК, shRNA және барлық нуклеин қышқылының егешқұйрықтар мен тышқандардың жасушаларына тиімді трансфекциясын қамтамасыз етеді. In vivo электропорацияның сәттілігі кернеуге, қайталауға, импульстарға және ұзақтығына байланысты. Дамушы орталық нерв жүйесі in vivo электропорация үшін ең тиімді, себебі нуклеин қышқылын инъекциялау үшін қарыншалардың көрінуіне, сондай-ақ бөлінетін жасушалардың өткізгіштігінің жоғарылауына байланысты. Жатырдағы эмбриондарға инъекция жасалатын электропорация көбінесе эмбрионға зиян келтіруді азайту үшін форцепс тәрізді электродтарды қолдана отырып, жатыр қабырғасы арқылы жүргізіледі.

Electroporation is performed with electroporators, purpose built appliances that create an electrostatic field in a cell solution. The cell suspension is pipetted into a glass or plastic cuvette which has two aluminium electrodes on its sides. For bacterial electroporation, typically a suspension of around 50 microliters is used. Prior to electroporation, this suspension of bacteria is mixed with the plasmid to be transformed. The mixture is pipetted into the cuvette, the voltage and capacitance are set, and the cuvette is inserted into the electroporator. The process requires direct contact between the electrodes and the suspension. Immediately after electroporation, one milliliter of liquid medium is added to the bacteria (in the cuvette or in an Eppendorf tube), and the tube is incubated at the bacteria's optimal temperature for an hour or more to allow recovery of the cells and expression of the plasmid, followed by bacterial culture on agar plates. The success of the electroporation depends greatly on the purity of the plasmid solution, especially on its salt content. Solutions with high salt concentrations might cause an electrical discharge (known as arcing), which often reduces the viability of the bacteria. For a further detailed investigation of the process, more attention should be paid to the output impedance of the porator device and the input impedance of the cells suspension (e. g. salt content). Since the cell membrane is not able to pass current (except in ion channels), it acts as an electrical capacitor. Subjecting membranes to a high voltage electric field results in their temporary breakdown, resulting in pores that are large enough to allow macromolecules (such as DNA) to enter or leave the cell. Additionally, electroporation can be used to increase permeability of cells during in Utero injections and surgeries. Particularly, the electroporation allows for a more efficient transfection of DNA, RNA, shRNA, and all nucleic acids into the cells of mice and rats. The success of in vivo electroporation depends greatly on voltage, repetition, pulses, and duration. Developing central nervous systems are most effective for in vivo electroporation due to the visibility of ventricles for injections of nucleic acids, as well as the increased permeability of dividing cells. Electroporation of injected in utero embryos is performed through the uterus wall, often with forceps type electrodes to limit damage to the embryo.

In vitro және жануарлар зерттеулері

In vivo гендік электротрансфері алғаш рет 1991 жылы сипатталды және бүгінде гендік электротрансферге қатысты көптеген клиникаға дейінгі зерттеулер жүргізілуде. Бұл әдіс иммундық жүйенің аурулары, ісіктер, метаболизмдік бұзылыстар, моногендік аурулар, жүрек-қан тамырлары аурулары, ауырсынуды басу сияқты бірнеше ауруларды емдеу үшін әртүрлі терапевтік гендерді жеткізуге қолданылады.

Керілмейтін электропорацияға қатысты, 2007 жылы егеуқұйрықтарға имплантацияланған қатерлі тері ісіктерін емдеудегі алғашқы сәтті нәтижеге ғалымдар тобы қол жеткізді, олар 13 егеуқұйрықтың 12-сінде ісіктің толық жойылуын қамтамасыз етті. Олар мұны 0,3 Гц жиілігінде, 2500 В/см электр өрісі күшімен 100 микросекундтық 80 импульс жіберіп, тері ісіктерін емдеу арқылы іске асырды. Қазіргі уақытта AngioDynamics, Inc. және VoltMed, Inc. сияқты бірқатар компаниялар клиникалық жағдайда керілмейтін электропорация технологияларын әзірлеуді және енгізуді жалғастыруда. Медициналық қолданыс үшін электропорацияны зерттеген алғашқы топты Густав Русси институтында Льюис М. Мир басқарды. Олар өткізбейтін макромолекулалармен бірге қайтымды электропорацияны қолдануды қарастырды. Наносекундтық импульстерді адам жасушаларында қолдану мүмкіндігін зерттеген алғашқы зерттеуді Шығыс Вирджиния медицина мектебінің және Олд-Доминьон университетінің ғалымдары жүргізіп, 2003 жылы жариялады.

Медициналық қолдану

Электропорация әдісі алғаш рет медицинада ісік түйіндеріне нашар сіңетін қатерлі ісікке қарсы препараттарды енгізу үшін қолданылды. Көп ұзамай гендік электротрансфер де арзан құны, оңай іске асырылуы және қауіпсіздігіне байланысты ерекше қызығушылық тудырды. Атап айтқанда, ДНҚ-ны жеткізу үшін вирустық векторлар қолданылғанда иммуногенділік және патогенділік тұрғысынан маңызды шектеулер болуы мүмкін. Қайталанбайтын электропорация жүрек бұлшықетінің өте шағын аймақтарын жою мақсатында жүрек абляциясы терапиясы ретінде қолданылады және зерттеледі. Бұл жүрек ырғағының бұзылуын емдеуге бағытталған. Жүрек катетері жоғары кернеулі, өте жылдам электр импульстарын жеткізеді, олар жасуша мембраналарында қайталанбайтын тесіктер құрады, нәтижесінде жасушалар өледі. Бұл әдіс алдыңғы техникаларға қарағанда жақсы таңдаулылықты қамтамасыз етеді деп саналады, себебі олар жылу немесе суық арқылы жасушалардың үлкен көлемін жойған. Шошқаларда жүргізілген зерттеулерде электропорацияның жоғары кернеуі мақсатты жасушаларды тар аумақта қайталанбайтын жоюға, ал көрші жасушаларға әсер етпеуге мүмкіндік беретіні анықталды, демек бұл қатерлі ісік, жүрек аурулары және тіндерді алып тастауды талап ететін басқа да аурулар үшін перспективті жаңа емдеу болып табылады. Кері қайтарылмайтын электропорация (IRE) адамдардағы қатерлі ісіктерді емдеуде тиімді екенін дәлелдеді, ал Джонс Хопкинс және басқа да мекемелердегі хирургтар бұрын операцияға келмейтін деп саналған бүйрек безінің қатерлі ісігін емдеу үшін осы технологияны қолдануда. Сонымен қатар, метастаздық меланомамен ауыратын науқастардағы гендік электротрансфердің бірінші фазалық клиникалық сынағының нәтижелері жарияланды. Интерлейкин 12 (pIL 12) кодын кодтаған плазмидті электропорация арқылы жеткізу жүзеге асырылды және қауіпсіздік, төзімділік және терапиялық әсері бақыланды. Зерттеу нәтижелері гендік электротрансфердің pIL 12 қауіпсіз және жақсы төзімді екенін көрсетті. Бұған қоса, емделмеген алыс метастазда да жартылай немесе толық жауап байқалды, бұл емнің жүйелік әсерін көрсетеді. Осы нәтижелерге сүйене отырып, олар қазірдің өзінде ІІ фазалық клиникалық зерттеуге көшуді жоспарлап отыр. Қазіргі уақытта гендік электротрансфердің бірнеше клиникалық зерттеулері жүргізілуде, онда электр импульстары арқылы енгізілетін ДНҚ вакцинасымен иммундаудың қауіпсіздігі, төзімділігі және тиімділігі бақыланады. Бұл әдіс жүйелік емес, тек жергілікті болғанымен, гендерді жеткізудің ең тиімді вирустық емес стратегиясы болып табылады.

The first medical application of electroporation was used for introducing poorly permeant anticancer drugs into tumor nodules. Soon also gene electrotransfer became of special interest because of its low cost, easiness of realization and safety. Namely, viral vectors can have serious limitations in terms of immunogenicity and pathogenicity when used for DNA transfer. Irreversible electroporation is being used and evaluated as cardiac ablation therapy to kill very small areas of heart muscle. This is done to treat irregularities of heart rhythm. A cardiac catheter delivers trains of high voltage ultra rapid electrical pulses that form irreversible pores in cell membranes, resulting in cell death. It is thought to allow better selectivity than the previous techniques, which used heat or cold to kill larger volumes of muscle. A higher voltage of electroporation was found in pigs to irreversibly destroy target cells within a narrow range while leaving neighboring cells unaffected, and thus represents a promising new treatment for cancer, heart disease and other disease states that require removal of tissue. Irreversible electroporation (IRE) has since proven effective in treating human cancer, with surgeons at Johns Hopkins and other institutions now using the technology to treat pancreatic cancer previously thought to be unresectable. Also first phase I clinical trial of gene electrotransfer in patients with metastatic melanoma was reported. Electroporation mediated delivery of a plasmid coding gene for interleukin 12 (pIL 12) was performed and safety, tolerability and therapeutic effect were monitored. Study concluded, that gene electrotransfer with pIL 12 is safe and well tolerated. In addition partial or complete response was observed also in distant non treated metastases, suggesting the systemic treatment effect. Based on these results they are already planning to move to Phase II clinical study. There are currently several ongoing clinical studies of gene electrotransfer where safety, tolerability and effectiveness of immunization with DNA vaccine, which is administered by the electric pulses is monitored. Although the method is not systemic, but strictly local one, it is still the most efficient non viral strategy for gene delivery.

N-TIRE

Соңғы кездегі термиялық емес қайталанбайтын электропорация (N TIRE) деп аталатын техника, көптеген ісік түрлері мен басқа да қажетсіз тіндерді емдеуде сәттілік көрсетті. Бұл процедура мақсатты тіндің ішіне немесе оны қоршап тұрған шағын электродтар (диаметрі шамамен 1 мм) арқылы жүзеге асырылады, олар алдын ала белгіленген кернеу және жиілікте қысқа, қайталама электр импульстарын қолданады. Бұл импульстар жасуша мембранасының тыныш күйдегі трансмембраналық потенциалын (ТМП) арттырады, нәтижесінде плазмалық мембранада наносаңылаулар пайда болады. Тіндерге қолданылатын электр өрісі мақсатты тіндік электр өрісі шегінен асып кеткенде, жасушалар наносаңылаулардың қалыптасуынан тұрақты түрде өткізгіш болады. Соның салдарынан жасушалар зақымды қалпына келтіре алмайды және гомеостаз жоғалғандықтан өледі. N TIRE басқа ісіктерді жою әдістерінен айырмашылығы, ол айналадағы тіндерге жылулық зақым келтірмейді.

Қайталанатын электропорация

Керісінше, кері электропорация электродтар арқылы қолданылатын электр қуаты мақсатты тіндердің электр өрісі шегінен төмен болғанда жүзеге асады. Қолданылған электр қуаты жасушалардың шекті деңгейінен төмен болғандықтан, жасушаларға фосфолипидтік екі қабатты қалпына келтіруге және қалыпты жасушалық функцияларын жалғастыруға мүмкіндік береді. Кері электропорация көбінесе дәрі немесе генді (немесе жасуша мембранасы үшін қалыпты түрде өткізбейтін басқа молекулаларды) жасушаға енгізуді қамтитын емдеулерде қолданылады. Барлық тіндердің электр өрісі шегі бірдей болмайды, сондықтан емдеу алдында қауіпсіздігі мен тиімділігін қамтамасыз ету үшін мұқият есептеулер жасау қажет. N TIRE қолданудың басты артықшылығы – мұқият есептеулерге сәйкес дұрыс орындалғанда, ол тек мақсатты тіндерге ғана әсер етеді. Ақуыздар, жасушадан тыс матрица және қан тамырлары мен жүйкелер сияқты маңызды құрылымдар бұл емдеудің әсерінен зақымдалмайды және сау күйде қалады. Бұл тез жазылуға мүмкіндік береді және өлі ісік жасушаларын сау жасушалармен жылдам алмастыруға көмектеседі. Процедураны жасамас бұрын ғалымдар не істеу керектігін мұқият есептеп, әр науқасты жеке-жеке қарауы керек. Осы үшін КТ және МРТ сияқты бейнелеу технологиялары көбінесе ісіктің 3D бейнесін жасау үшін қолданылады. Осы ақпарат негізінде олар ісіктің көлемін шамамен анықтап, электродтарды енгізу орнын, енгізу бұрышын, қажетті кернеуді және басқа да шараларды бағдарламалық қамтамасыз етуді пайдаланып шеше алады. Көбінесе КТ аппараты процедура кезінде электродтарды орналастыруға көмектеседі, әсіресе электродтар ми ісіктерін емдеу үшін қолданылғанда. Бүкіл процедура өте жылдам, әдетте бес минутқа созылады. Бұл процедуралардың сәттілік деңгейі жоғары. Сонымен қатар, H FIRE жоғары жиіліктерде тіндердің электрлік қасиеттерінің айырмашылығы азайғандықтан, көзделген абляцияларды жасауға мүмкіндік береді.

Contrastingly, reversible electroporation occurs when the electricity applied with the electrodes is below the electric field threshold of the target tissue. Because the electricity applied is below the cells' threshold, it allows the cells to repair their phospholipid bilayer and continue on with their normal cell functions. Reversible electroporation is typically done with treatments that involve getting a drug or gene (or other molecule that is not normally permeable to the cell membrane) into the cell. Not all tissue has the same electric field threshold; therefore careful calculations need to be made prior to a treatment to ensure safety and efficacy. One major advantage of using N TIRE is that, when done correctly according to careful calculations, it only affects the target tissue. Proteins, the extracellular matrix, and critical structures such as blood vessels and nerves are all unaffected and left healthy by this treatment. This allows for a quicker recovery, and facilitates a more rapid replacement of dead tumor cells with healthy cells. Before doing the procedure, scientists must carefully calculate exactly what needs to be done and treat each patient on an individual case by case basis. To do this, imaging technology such as CT scans and MRI's are commonly used to create a 3D image of the tumor. From this information, they can approximate the volume of the tumor and decide on the best course of action including the insertion site of electrodes, the angle they are inserted in, the voltage needed, and more, using software technology. Often, a CT machine will be used to help with the placement of electrodes during the procedure, particularly when the electrodes are being used to treat tumors in the brain. The entire procedure is very quick, typically taking about five minutes. The success rate of these procedures is high Furthermore, H FIRE has been demonstrated to produce more predictable ablations due to the lesser difference in the electrical properties of tissues at higher frequencies.

Дәрілік заттар мен гендерді жеткізу

Электропорация сонымен қатар қысқа және қарқынды электр импульстерін қолдану арқылы дәрілерді немесе гендерді жасушаға жеткізуге көмектеседі, бұл жасуша мембранасын уақытша өткізгіш етеді, осылайша жасуша мембранасы арқылы әдетте тасымалданбайтын молекулалардың тасымалына мүмкіндік береді. Көмектесе алады. Егер тасымалданатын молекулалар химиотерапиялық агенттер болса, бұл процедура электрохимиялық терапия деп аталады, ал егер молекула ДНК болса, гендік электротрансфер деп аталады. Каролинска институты мен Оксфорд университетінің ғалымдары жүйелі түрде (қанға) енгізгеннен кейін siRNA, антисенс олигонуклеотидтер, химиотерапиялық агенттер және белоктарды экзосомалардың электропорациясы арқылы нейрондарға жеткізеді. Экзосомалар қан-миы барлық кедергісінен өте алатындықтан, бұл протокол орталық нерв жүйесіне дәрі-дәрмектерді жеткізудегі қиындықтарды шеше алады және Альцгеймер ауруы, Паркинсон ауруы және ми рагы сияқты жағдайларды емдеуге мүмкіндік береді. Бактериялық трансформация, әдетте, биотехнологияда немесе медицинада қажетті белгілі бір белоктың үлкен көлемін жасаудың ең оңай жолы болып табылады. Гендік электротрансфер өте қарапайым, жылдам және тиімді техника болғандықтан, ол алдымен басқа трансформация процедураларына ыңғайлы жаңартпа болды. Жақындағы зерттеулер электропорациядан бұрын жасуша мембранасын алдын ала өңдеу үшін соққы толқындарын қолдануға болатынын көрсетті. Бұл синергиялық стратегия сыртқы кернеуді азайтуға және үлкен тесіктер жасауға көмектеседі. Соққы толқындарын қолдану мембрананың қажетті жерін бағыттауға мүмкіндік береді. Бұл процедура тесіктің мөлшерін бақылауға мүмкіндік береді.

Физикалық механизм

Электропорация жасушаға ДНҚ сияқты ірі, жоғары зарядталған молекулаларды енгізуге мүмкіндік береді, мұндай молекулалар гидрофобтық екі қабаттың ядросы арқылы пассивті түрде диффузиялай алмайды. Электропорлар липидтік екі қабатты модельдерде, мысалы, тамшы интерфейсіндегі екі қабаттар мен алып біржапыралы везикулаларда оптикалық түрде бейнеленді, ал алып біржапыралы везикулаларға актин желілері сияқты цитоскелеттік ақуыздарды қосу көрінетін электропорлардың пайда болуын болдырмайды. Сондай-ақ, актин желілерінің жасуша мембранасының өткізгіштігін реттеуге қатысатындығына қатысты эксперименталдық дәлелдер де бар. Электропорация мен диэлектрлік бұзылудың екеуі де электр өрісін қолдану нәтижесінде пайда болғанымен, олардың механизмдері түбірінен өзгеше. Диэлектрлік бұзылу кезінде кедергі материал иондалады, өткізгіш жол құрылады. Материалдың өзгеруі химиялық сипатта болады. Керісінше, электропорация кезінде липид молекулалары химиялық жағынан өзгере қоймайды, жай ғана орналасуын өзгертеді, бұл екі қабатты сумен толтырғанда өткізгіш жол ретінде әрекет ететін тесік ашуға алып келеді. Электропорация – жасуша мембранасының әрбір нүктесіндегі жергілікті трансмембраналық кернеуге байланысты динамикалық құбылыс. Белгілі бір импульстің ұзақтығы мен пішіні үшін электропорация құбылысының пайда болуы үшін (0,5 В-тан 1 В-қа дейін) белгілі бір трансмембраналық кернеу шегі бар екендігі қабылданған. Бұл электропорация үшін электр өрісінің шамасының шегін (Eth) анықтауға әкеледі. Яғни, тек E ≧ Eth болатын аймақтардағы жасушалар электропорацияланады. Егер екінші шек (Eir) жетілсе немесе асып кетсе, электропорация жасушалардың тірі қалу қабілетіне нұқсан келтіреді, яғни қайтымсыз электропорация (IRE) болады. Электропорация – бірнеше ерекше фазалары бар көп сатылы процесс. Біріншіден, қысқа электр импульсі қолданылуы керек. Типик параметрлер мембрана арқылы < 1 мс үшін 300–400 мВ құрайды (жасушалық эксперименттерде қолданылатын кернеулер көбінесе әлдеқайда жоғары болады, себебі олар ірі ерітіндіге үлкен қашықтықтан қолданылады, сондықтан нақты мембрана арқылы алынған өріс қолданылған кернеудің шағын бөлігі ғана). Бұл потенциалды қолданғанда мембрана конденсатор сияқты айналадағы ерітіндіден иондардың қозғалысы арқылы зарядтанады. Критикалық өріске жеткеннен кейін липид морфологиясында жылдам локальды өзгеріс болады. Пайда болған құрылым "алдын ала тесік" деп саналады, себебі ол электр өткізгіш емес, бірақ өткізгіш тесік құрылуына жылдам алып келеді. Мұндай алдын ала тесіктердің бар екендігіне дәлел көбінесе тесіктердің "жыпылықтауынан" көрінеді, бұл өткізгіш және оқшаулағыш күйлер арасындағы ауысуды көрсетеді. Бұл алдын ала тесіктердің шағын (~3 Å) гидрофобтық ақаулар екендігі болжанады. Егер бұл теория дұрыс болса, онда өткізгіш күйге көшуді тесік шетіндегі қайта орналасумен түсіндіруге болады, онда липидтік бас бөліктері гидрофильді интерфейсті құру үшін бүктеледі. Соңында, бұл өткізгіш тесіктер жазылып, екі қабатты қайта жабуы немесе кеңейіп, ақырында оны жыртылуы мүмкін. Пайда болған нәтиже сынған ақаудың мөлшерінен асып кеткеніне байланысты, бұл өз кезегінде қолданылатын өріске, жергілікті механикалық кернеуге және екі қабаттың жиек энергиясына байланысты.

Electroporation allows cellular introduction of large highly charged molecules such as DNA which would never passively diffuse across the hydrophobic bilayer core. Electropores were optically imaged in lipid bilayer models like droplet interface bilayers and giant unilamellar vesicles, while addition of cytoskeletal proteins such as actin networks to the giant unilamellar vesicles seem to prevent the formation of visible electropores. Experimental evidences for actin networks in regulating the cell membrane permeability has also emerged. Although electroporation and dielectric breakdown both result from application of an electric field, the mechanisms involved are fundamentally different. In dielectric breakdown the barrier material is ionized, creating a conductive pathway. The material alteration is thus chemical in nature. In contrast, during electroporation the lipid molecules are not chemically altered but simply shift position, opening up a pore which acts as the conductive pathway through the bilayer as it is filled with water. Electroporation is a dynamic phenomenon that depends on the local transmembrane voltage at each point on the cell membrane. It is generally accepted that for a given pulse duration and shape, a specific transmembrane voltage threshold exists for the manifestation of the electroporation phenomenon (from 0.5 V to 1 V). This leads to the definition of an electric field magnitude threshold for electroporation (Eth). That is, only the cells within areas where E≧Eth are electroporated. If a second threshold (Eir) is reached or surpassed, electroporation will compromise the viability of the cells, i. e., irreversible electroporation (IRE). Electroporation is a multi step process with several distinct phases. First, a short electrical pulse must be applied. Typical parameters would be 300–400 mV for < 1 ms across the membrane (note the voltages used in cell experiments are typically much larger because they are being applied across large distances to the bulk solution so the resulting field across the actual membrane is only a small fraction of the applied bias). Upon application of this potential the membrane charges like a capacitor through the migration of ions from the surrounding solution. Once the critical field is achieved there is a rapid localized rearrangement in lipid morphology. The resulting structure is believed to be a "pre pore" since it is not electrically conductive but leads rapidly to the creation of a conductive pore. Evidence for the existence of such pre pores comes mostly from the "flickering" of pores, which suggests a transition between conductive and insulating states. It has been suggested that these pre pores are small (~3 Å) hydrophobic defects. If this theory is correct, then the transition to a conductive state could be explained by a rearrangement at the pore edge, in which the lipid heads fold over to create a hydrophilic interface. Finally, these conductive pores can either heal, resealing the bilayer or expand, eventually rupturing it. The resultant fate depends on whether the critical defect size was exceeded which in turn depends on the applied field, local mechanical stress and bilayer edge energy.

Гендік электропорация

Клеткаға жеткілікті күшті электр импульстерін қолдану трансмембраналық потенциалдың айырмашылығын арттырады, бұл мембрананың тұрақсыздығына себеп болады. Жасуша мембранасының өткізгіштігі жоғарылайды және әдетте өтпейтін молекулалар жасушаға еніп келеді. Гендік электротрансфердің механизмдері әлі толыққанды түсіндірілмегенімен, ДНК енгізу мембрананың катодқа қараған бөлігінде ғана жүзеге асатыны және табысты трансфекция үшін бірнеше қадам қажет екені анықталды: ДНК-ның жасушаға қарай электрофоретикалық қозғалысы, ДНК-ның мембранаға енуі, мембрана арқылы транслокация, ДНК-ның ядроға қарай қозғалысы, ДНК-ның ядролық қабықша арқылы өтуі және соңында гендік экспрессия. Гендік электротрансфердің тиімділігіне температура, электр импульстерінің параметрлері, ДНК концентрациясы, қолданылған электропорация буфері, жасушаның мөлшері және жасушалардың трансфекцияланған гендерді экспресстеу қабілеті сияқты бірқатар факторлар әсер етеді. In vivo гендік электротрансферде клеткадан тыс матрица арқылы ДНК-ның таралуы, тіндердің қасиеттері және тіндердің жалпы өткізгіштігі де маңызды рөл атқарады.

Тарих

1960 жылдары сыртқы электр өрісін қолдану арқылы жасушаның екі полюсінде үлкен мембраналық потенциал тудыруға болатыны белгілі болды. 1970 жылдары мембраналық потенциал белгілі бір шегіне жеткенде мембрананың бұзылып, кейін қалпына келе алатыны анықталды. 1980 жылдары осы құбылысты пайдаланып, түрлі материалдар мен молекулаларды жасушалардың ішіне енгізуге қолданыла бастады.