Введение
Техника, используемая для усиления визуального контраста образцов, наблюдаемых под микроскопом.
Окрашивание – это техника, применяемая для повышения контрастности образцов, как правило, на микроскопическом уровне. Красители и реагенты для окрашивания часто используются в гистологии (микроскопическом изучении биологических тканей), цитологии (микроскопическом изучении клеток), а также в медицинских областях – гистопатологии, гематологии и цитопатологии, которые специализируются на изучении и диагностике заболеваний на микроскопическом уровне. Окрашивание может применяться для выявления биологических тканей (например, мышечных волокон или соединительной ткани), клеточных популяций (классификации различных клеток крови) или органелл внутри отдельных клеток. В биохимии это предполагает добавление красителя, специфичного к определенному классу веществ (ДНК, белки, липиды, углеводы), к субстрату для качественного или количественного определения наличия конкретного соединения. Окрашивание и флуоресцентная маркировка могут служить схожим целям. Биологическое окрашивание также используется для маркировки клеток в проточной цитометрии и для выявления белков или нуклеиновых кислот при электрофорезе в геле. Для наблюдения окрашенных образцов при высоком увеличении обычно используются световые микроскопы с использованием светлого поля или эпифлуоресцентного освещения. Окрашивание не ограничивается только биологическими материалами, поскольку его также можно использовать для изучения структуры других материалов, например, ламеллярных структур полукристаллических полимеров или доменных структур блок-сополимеров.
In vivo и In vitro
Ин виво окрашивание (также называемое витальным окрашиванием или интравитальным окрашиванием) – это процесс окрашивания живых тканей. Путем придания определенных клеткам или структурам контрастных цветов, их форма (морфология) или положение внутри клетки или ткани становятся легко видимыми и подлежащими изучению. Основная цель – выявление цитологических деталей, которые иначе могли бы остаться незамеченными; однако окрашивание также может показать, где происходят определенные химические вещества или специфические химические реакции в клетках или тканях. Окрашивание in vitro включает окрашивание клеток или структур, удаленных из их биологического контекста. Определенные красители часто комбинируют для выявления большего количества деталей и особенностей, чем при использовании одного красителя. В сочетании со специфическими протоколами фиксации и подготовки образцов, ученые и врачи могут использовать эти стандартные методы как последовательные и воспроизводимые диагностические инструменты. Контркраситель – это краситель, который делает клетки или структуры более заметными, когда они недостаточно хорошо видны при использовании основного красителя. Кристаллический фиолетовый окрашивает как грамположительные, так и грамотрицательные организмы. Обработка спиртом удаляет кристаллический фиолетовый цвет только из грамотрицательных организмов. Сафранин используется в качестве контркрасителя для окрашивания грамотрицательных организмов, которые были обесцвечены спиртом. В условиях ex vivo многие клетки продолжают жить и метаболизировать до момента их "фиксации". Некоторые методы окрашивания основаны на этом свойстве. Красители, которые исключаются живыми клетками, но поглощаются уже мертвыми клетками, называются витальными красителями (например, трипан синий или пропидиум-йодид для эукариотических клеток). Красители, которые проникают и окрашивают живые клетки, называются суправитальными красителями (например, новый метиленовый синий и блестящий крезил синий для окрашивания ретикулоцитов). Однако эти красители в конечном итоге токсичны для организма, некоторые – в большей степени, чем другие. Отчасти из-за их токсического воздействия внутри живой клетки, при попадании суправитальных красителей в живую клетку они могут создавать характерный рисунок окрашивания, отличный от окрашивания уже фиксированной клетки (например, вид "ретикулоцитов" в отличие от диффузной "полихромазии"). Для достижения желаемого эффекта красители используются в очень разбавленных растворах в диапазоне от до (Howey, 2000). Следует отметить, что многие красители могут использоваться как в живых, так и в фиксированных клетках.
Грамм
Грам-окраска используется для определения грам-статуса с целью широкой классификации бактерий на основе состава их клеточной стенки. Грам-окраска использует кристаллический фиолетовый для окрашивания клеточных стенок, йод (в качестве мордента) и фуксин или сафранин в качестве противоокраски для окрашивания всех бактерий. Грам-статус позволяет разделить образцы бактерий на две группы, обычно отражающие их основную филогенетическую принадлежность. Эта характеристика, в сочетании с другими методами, делает ее полезным инструментом в клинических микробиологических лабораториях, где она может быть важна для раннего выбора подходящих антибиотиков. В большинстве препаратов, окрашенных по Граму, грамотрицательные организмы выглядят красными или розовыми из-за противоокраски. Благодаря более высокому содержанию липидов, после обработки спиртом увеличивается пористость клеточной стенки, что позволяет комплексу КФИ (кристаллический фиолетовый – йод) проходить сквозь нее. Таким образом, основная окраска не задерживается. Кроме того, в отличие от большинства грамположительных бактерий, грамотрицательные бактерии имеют лишь несколько слоев пептидогликана и вторичную клеточную мембрану, состоящую преимущественно из липополисахаридов.
Эндоспора
Окрашивание эндоспор используется для определения наличия или отсутствия эндоспор, которые делают бактерии очень трудными для уничтожения. Бактериальные споры сложно окрашивать, поскольку они непроницаемы для водных растворов красителей. Окрашивание эндоспор особенно полезно для идентификации эндоспорообразующих бактериальных патогенов, таких как Clostridium difficile. До разработки более эффективных методов, это окрашивание выполнялось методом Вирца с использованием тепловой фиксации и контркрасителя. Применение малахитового зеленого и разбавленного раствора карболфуксина, а также фиксация бактерий в осмиевой кислоте, обеспечивали предотвращение смешивания красителей. Однако, новые, усовершенствованные методы окрашивания значительно сократили время, необходимое для получения результатов. В ходе усовершенствования карболфуксин был заменен водным сафранином в сочетании с новым 5%-ным раствором малахитового зеленого. Этот новый и улучшенный состав красителей использовался так же, как и ранее, с применением тепловой фиксации, промывки и просушивания для последующего исследования. При исследовании все бактерии, образующие эндоспоры, будут окрашены в зеленый цвет, а все остальные клетки – в красный.
Зиль-Нилсен
Окраска по Цилю-Нильсену – это метод кислотоустойчивого окрашивания, используемый для выявления видов Mycobacterium tuberculosis, которые не окрашиваются стандартными лабораторными методами, такими как окраска по Граму. Окраска выполняется с использованием красного карболфуксина, который окрашивает бактерии, и противоокраски, например, метиленового синего.
Гематоксилин и эозин (Г&Е)
Гематоксилин и эозин – широко используемый метод окрашивания в гистологии для изучения тонких срезов тканей. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, в то время как эозин окрашивает цитоплазму, соединительную ткань и другие внеклеточные структуры в розовый или красный цвет. В его состав входят гематоксилин, Оранжевый G, эозин Y, Светло-зеленый SF желтоватого оттенка и, иногда, Бисмарк-коричневый Y.
ПСП
Периодическая кислота Шифф – это специальный гистологический краситель, используемый для выявления углеводов (гликоген, гликопротеины, протеогликаны). Окраска по Шиффу (PAS) часто применяется при исследовании тканей печени для обнаружения отложений гликогена, что позволяет дифференцировать различные типы болезней накопления гликогена. Окраска по Шиффу важна, поскольку позволяет выявлять гранулы гликогена в опухолях яичников и поджелудочной железы эндокринной системы, а также в мочевом пузыре и почках. Базальные мембраны также могут быть видны при окраске по Шиффу и имеют значение при диагностике заболеваний почек. Благодаря высокому содержанию углеводов в клеточной стенке гиф и дрожжевых форм грибов, окраска по Шиффу помогает обнаружить эти микроорганизмы в образцах тканей человека.
Массон
Трихром Массона (как следует из названия) – это протокол окрашивания, использующий три красителя. Рецептура эволюционировала от оригинальной методики Массона для различных специфических применений, но все варианты хорошо подходят для дифференциации клеток от окружающей соединительной ткани. В большинстве случаев в результате окрашивания получают красный цвет для кератина и мышечных волокон, синий или зеленый – для коллагена и костной ткани, светло-красный или розовый – для цитоплазмы, а ядра клеток окрашиваются в черный цвет.
Романовский
Красители Романовского рассматриваются как полихромный эффект окрашивания и основаны на комбинации эозина плюс (химически восстановленного эозина) и деметилированного метиленового синего (содержащего его продукты окисления азур А и азур В). Этот краситель проявляет различные цвета для всех клеточных структур («эффект Романовского-Гиемзы») и поэтому использовался для окрашивания полиморфноядерных нейтрофилов и клеточных ядер. Распространенные варианты включают красители Райта, Дженнера, Мей-Грюнвальда, Лейшмана и Гиемзы. Все они используются для исследования образцов крови или костного мозга. Они предпочтительнее окраски гематоксилином и эозином для осмотра клеток крови, поскольку различные типы лейкоцитов (белых кровяных клеток) могут быть легко различимы. Все они также подходят для исследования крови с целью выявления паразитов, переносимых с кровью, таких как малярия.
Серебряный
Серебряное окрашивание – это использование серебра для окрашивания гистологических срезов. Этот вид окрашивания важен для выявления белков (например, коллагена III типа) и ДНК. Оно используется для визуализации веществ как внутри, так и вне клеток. Серебряное окрашивание также применяется в температурно-градиентном гельном электрофорезе. Аргентаффинные клетки восстанавливают раствор серебра до металлического серебра после фиксации формалином. Этот метод был открыт итальянским ученым Камилло Голджи, посредством реакции между нитратом серебра и дихроматом калия, что приводит к осаждению хромата серебра в некоторых клетках (см. Метод Голджи). Аргирофильные клетки восстанавливают раствор серебра до металлического серебра после обработки красителем, содержащим восстановитель, например, гидрохинон или формалин.
Судан
Суданское окрашивание использует суданские красители для окрашивания суданофильных веществ, часто включающих липиды. Обычно применяются Судан III, Судан IV, Красный Ойл, тетраоксид осмия и Судан Черный B. Суданское окрашивание часто используется для определения содержания жира в кале при диагностике стеаторреи.
Виртц-Конклин
Окраска по Вирцу-Конклину – это специальная техника, разработанная для окрашивания истинных эндоспор с использованием малахитового зеленого в качестве основного красителя и сафранина в качестве противокрасителя. Окрашенные таким образом эндоспоры не обесцвечиваются. Важную роль в процессе окрашивания играет нагревание. Оно способствует раскрытию мембраны споры, обеспечивая проникновение красителя внутрь. Основное назначение этой окраски – визуализация прорастания бактериальных спор. Если происходит прорастание, спора окрашивается в зеленый цвет благодаря малахитовому зеленому, а окружающая клетка – в красный цвет сафранином. Окраска также позволяет определить положение споры внутри бактериальной клетки: терминальное (на конце клетки), субтерминальное (внутри клетки) или центральное (в центре клетки).
Пептид гибридизирующий коллаген
Окрашивание коллагеногибридизирующим пептидом (CHP) обеспечивает простой и прямой способ окрашивания денатурированного коллагена любого типа (I, II, IV и т.д.), независимо от того, был ли он поврежден или деградирован ферментативным, механическим, химическим или термическим воздействием. Пептиды CHP работают, восстанавливая структуру тройной спирали коллагена, используя доступные одиночные цепи в ткани. Визуализация CHP возможна с помощью обычного флуоресцентного микроскопа.
Обычные биологические пятна
Различные красители реагируют или концентрируются в разных частях клетки или ткани, и эти свойства используются для выявления специфических структур или областей. Ниже приведен список некоторых из наиболее распространенных биологических красителей. Если не указано иное, все эти красители могут применяться к фиксированным клеткам и тканям; красители для живых клеток (пригодные для использования с живыми организмами) отмечены.
Акридин оранжевый
Акридин оранжевый (AO) — это флуоресцентный катионный краситель, селективный к нуклеиновым кислотам, полезный для определения фаз клеточного цикла. Он проникает в клетки и взаимодействует с ДНК и РНК посредством интеркаляции или электростатического притяжения. При связывании с ДНК его спектральные характеристики очень схожи с флуоресцеином. Как и флуоресцеин, он также может использоваться в качестве неспецифического красителя для подсветки обычным способом окрашенных клеток на поверхности твердого образца ткани (флуоресцентная подсветка окрашенных препаратов).
Бисмарк коричневый
Коричневый Бисмарка (также коричневый Бисмарка Y или коричневый Манчестер) окрашивает кислые муцины в желтый цвет, а тучные клетки – в интенсивный коричневый. Один из недостатков этого красителя заключается в том, что он маскирует окружающие структуры и снижает контрастность изображения. Для получения полезных результатов его необходимо использовать в сочетании с другими красителями. В качестве дополнительных красителей, используемых вместе с коричневым Бисмарка, часто применяют гематоксилин и толуидиновый синий, которые обеспечивают лучший контраст в гистологическом препарате.
Кармин
Кармин — интенсивно-красный краситель, используемый для окрашивания гликогена, а кармин с квасцами — краситель для ядер. Окрашивание кармином требует использования мордванта, обычно алюминия.
Синий кумасси
Синий кумасси (также бриллиантовый синий) неспецифически окрашивает белки в интенсивно-синий цвет. Он часто используется в гельном электрофорезе.
Виолетовый кресил
Крезилфиолетовый окрашивает кислые компоненты цитоплазмы нейронов в фиолетовый цвет, в особенности тельца Ниссля. Часто используется в исследованиях мозга.
Кристальная фиолетовая
Кристаллический фиолетовый, в сочетании с подходящим мордантом, окрашивает клеточные стенки в пурпурный цвет. Кристаллический фиолетовый является красителем, используемым в окраске по Граму.
ДАПИ
DAPI — это флуоресцентный краситель для ядер, возбуждаемый ультрафиолетовым светом и демонстрирующий яркую синюю флуоресценцию при связывании с ДНК. DAPI связывается с A=T-богатыми повторами хромосом. DAPI не виден в обычной световой микроскопии. Его можно использовать как в живых, так и в фиксированных клетках. Клетки, окрашенные DAPI, особенно хорошо подходят для подсчета клеток.
Эозин
Эозин чаще всего используется в качестве противоокраски гематоксилину, придавая розовый или красный цвет цитоплазме, клеточным мембранам и некоторым внеклеточным структурам. Он также интенсивно окрашивает красные кровяные клетки в красный цвет. Эозин может также применяться в качестве противоокраски в некоторых вариантах окраски по Граму и во многих других протоколах. Фактически, под названием "эозин" обычно подразумевают два очень близких по составу соединения. Наиболее часто используется эозин Y (также известный как эозин Y ws или эозин желтоватый), который имеет слегка желтоватый оттенок. Другое соединение – эозин B (эозин синеватый или имперский красный), обладающий очень слабым синеватым оттенком. Эти два красителя взаимозаменяемы, и выбор между ними – скорее вопрос предпочтений и сложившейся практики.
Бромид этидия
Бромид этидия интеркалирует в ДНК и окрашивает ее, создавая флуоресцентное красно-оранжевое окрашивание. Хотя он не окрашивает здоровые клетки, его можно использовать для выявления клеток, находящихся на конечной стадии апоптоза – у таких клеток значительно более проницаемые мембраны. Следовательно, бромид этидия часто применяется в качестве маркера апоптоза в клеточных популяциях и для локализации полос ДНК при гелевом электрофорезе. Этот краситель также может использоваться в сочетании с акридиновым оранжевым (AO) при подсчете жизнеспособных клеток. Комбинация красителей EB/AO вызывает флуоресценцию живых клеток зеленым цветом, в то время как апоптотические клетки сохраняют характерную красно-оранжевую флуоресценцию.
Кислотный фуксин
Кислотный фуксин может использоваться для окрашивания коллагена, гладкой мускулатуры или митохондрий. Кислотный фуксин применяется как ядерный и цитоплазматический краситель в трихромном методе Мэллори. Кислотный фуксин окрашивает цитоплазму в некоторых вариантах трихрома Массона. В пикрофуксине Ван Гизона кислотный фуксин придает красный цвет коллагеновым волокнам. Кислотный фуксин также является традиционным красителем для митохондрий (метод Альтмана).
Гематоксилин
Гематоксилин (гематоксилин в Северной Америке) — это краситель для ядер.
Малахитовый зеленый
Малахитовый зеленый (также известный как алмазный зеленый B или зеленый Виктория B) может использоваться в качестве сине-зеленого встречного красителя к сафранину в технике окраски по Хименесу для бактерий. Он также может применяться для прямого окрашивания спор.
Метил зеленый
Метилзеленый обычно используется как в световой микроскопии с ярким полем, так и во флуоресцентной микроскопии для окрашивания хроматина клеток, облегчая их визуализацию.
Метиленовый синий
Метиленовый синий используется для окрашивания клеток животных, например, клеток слизистой оболочки щеки человека, чтобы лучше визуализировать их ядра. Также применяется для окрашивания мазков крови в цитологии.
Нейтральный красный
Нейтральный красный (или толуидиновый красный) окрашивает вещество Ниссля в красный цвет. Обычно используется в качестве контркрасителя в сочетании с другими красителями.
Ниловый
Нильский синий (или Нильский синий А) окрашивает ядра в синий цвет. Его можно применять к живым клеткам.
Нильский красный
Ниловый красный (также известный как ниловый оксазон) образуется при кипячении нилового синего с серной кислотой. В результате получается смесь нилового красного и нилового синего. Ниловый красный – это липофильный краситель, который накапливается в липидных шариках внутри клеток, окрашивая их в красный цвет. Ниловый красный можно использовать с живыми клетками. Он сильно флуоресцирует при переходе в липиды, но практически не флуоресцирует в водном растворе.
Осмовый тетроксид (официальное название: осмовый тетраоксид)
Тетроксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов. Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия – легко видимого чёрного вещества.
Йодидистый пропидиум
Йодид пропидия – флуоресцентный интеркалятор, который можно использовать для окрашивания клеток. Йодид пропидия применяется в качестве красителя ДНК в проточной цитометрии для оценки жизнеспособности клеток или содержания ДНК при анализе клеточного цикла, а также в микроскопии для визуализации ядра и других органелл, содержащих ДНК. Йодид пропидия не проникает через мембрану живых клеток, что делает его полезным для дифференцирования некротических, апоптотических и здоровых клеток. PI также связывается с РНК, поэтому для различения окрашивания РНК и ДНК требуется обработка нуклеазами.
Родамин
Родамин — это флуоресцентный краситель, специфичный для белков, который обычно используется в флуоресцентной микроскопии.
Сафранин
Сафранин (или Сафранин О) — красный катионный краситель. Он связывается с ядрами (ДНК) и другими тканевыми полианионами, включая гликозаминогликаны в хрящевой и тучных клетках, а также компоненты лигнина и пластид в растительных тканях. Сафранин не следует путать с шафраном — дорогим натуральным красителем, который используется в некоторых методах для придания жёлтого цвета коллагену, чтобы контрастировать с синим и красным цветами, которые другие красители придают ядрам и цитоплазме в тканях животных (включая ткани человека). Неправильное написание "сафранин" широко распространено. Окончание "-ine" уместно для сафранина О, поскольку этот краситель является амином.
Стабильность тканей
Ткани, воспринимающие красители, называются хроматическими. Хромосомы получили свое название из-за их способности поглощать фиолетовый краситель. Склонность к определенному красителю может обозначаться суффиксом "фильный". Например, ткани, окрашивающиеся лазурным красителем, могут называться азурофильными. Этот суффикс также может использоваться для обозначения более общих свойств окрашивания, таких как ацидофильный – для тканей, окрашивающихся кислыми красителями (в частности, эозином), базофильный – при окрашивании щелочными красителями, и амфофильный – при окрашивании как кислыми, так и щелочными красителями. В отличие от них, хромофобные ткани плохо воспринимают красители.
Электронная микроскопия
Как и в световой микроскопии, красители могут быть использованы для увеличения контраста в просвечивающей электронной микроскопии. Обычно используются электронно-плотные соединения тяжелых металлов.
Фосфотунгостическая кислота
Фосфовольфрамовая кислота — распространенный реагент для негативного контрастирования вирусов, нервов, полисахаридов и других биологических тканей. Чаще всего её используют в виде 0,5–2% водного раствора, что делает её нейтральной. Фосфовольфрамовая кислота содержит большое количество электроноплотных частиц, которые окрашивают фон вокруг образца в темный цвет, а сам образец – в светлый. Этот метод отличается от обычной позитивной техники окрашивания, при которой образец окрашивается в темный цвет, а фон остается светлым.
Тетроксид осмия
Тетроксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов. Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия – легко видимого черного вещества. Будучи тяжелым металлом, поглощающим электроны, он является, пожалуй, наиболее распространенным красителем, используемым для изучения морфологии в биологической электронной микроскопии. Он также применяется для окрашивания различных полимеров с целью изучения их морфологии методом просвечивающей электронной микроскопии (TEM). Тетроксид осмия очень летуч и чрезвычайно токсичен. Это сильный окислитель, поскольку осмий имеет степень окисления +8. Он агрессивно окисляет многие материалы, оставляя после себя отложения нелетучего осмия в более низкой степени окисления.