Белок ASPM: роль в нейрогенезе и развитии мозга.

Введение

Аномальный белок, подобный веретену, связанный с микроцефалией, также известный как гомолог аномального белка веретена или гомолог Asp, – это белок, который у человека кодируется геном ASPM. ASPM расположен на хромосоме 1, в полосе q31 (1q31). Ген ASPM содержит 28 экзонов и кодирует белок длиной 3477 аминокислот. "ASPM" – это акроним от "Abnormal Spindle like, Microcephaly associated", что отражает его ортологию к гену "аномального веретена" (asp) у Drosophila melanogaster. Экспрессируемый белковый продукт гена asp необходим для нормальной функции митотического веретена в эмбриональных нейробластах и регуляции нейрогенеза. Новый аллель ASPM возник примерно 14 000 лет назад (средняя оценка – 5800 лет) в голоцене и, по-видимому, распространился среди большей части населения Европы и Ближнего Востока. Хотя новый аллель, очевидно, полезен, исследователи пока не знают, как он действует.

Исследования на животных

Ген мыши Aspm экспрессируется в основных участках пренатального нейрогенеза коры головного мозга. Различие между Aspm и ASPM заключается в наличии в последнем единой крупной вставки, кодирующей так называемые IQ-домены. Исследования на мышах также указывают на роль продукта гена Aspm в регуляции митотического веретена. Эта функция сохранена, поскольку белок ASPM 1 из C. elegans локализован в астерах веретена, где он регулирует организацию и вращение веретена, взаимодействуя с кальмодулином, динеином и LIN 5, связанным с NuMA. Одно исследование на мышах, изучающее рост медуллобластомы для изучения гена Aspm, ортолога человеческого ASPM, предполагает, что экспрессия Aspm может стимулировать постнатальный нейрогенез мозжечка. Этот процесс происходит в конце эмбриогенеза и сразу после рождения в течение примерно 2 недель у мышей и 12 месяцев у людей и регулируется экспрессией гена Shh. В пролиферирующих гранулярных нейронных предшественниках мозжечка (CGNP) экспрессия Shh в мышиных моделях оказалась в четыре раза выше, чем у мышей, лишенных экспрессии Shh in vivo. Эта индукция Aspm и повышение его регуляции во время нейрогенеза мозжечка также наблюдались при ПЦР в реальном времени, где его экспрессия была относительно высокой на пике нейрогенеза и значительно ниже в конце нейрогенеза. Кроме того, исследование показало, что Aspm необходим для нейрогенеза мозжечка. При наличии мутаций и делеций Aspm KO экспериментальные мышиные модели демонстрируют уменьшение объема мозжечка при МРТ по сравнению с контрольной группой. Помимо влияния мутировавшего Aspm на нейрогенез, эти мутации также могут играть роль в нейронной дифференцировке. При изучении мозга взрослых мышей Aspm KO наблюдалась тенденция к общему уменьшению размера и различиям в толщине коры между мутантными и дикими типами. В соматосенсорной коре у мышей KO наблюдалась значительно более толстая I корковая пластинка, более тонкая VI корковая пластинка и общее уменьшение толщины коры в корковой пластине. Экспрессия некоторых факторов транскрипции также была аномальной у мышей KO. Например, Tbr1 и Satb2 были повышены в корковой субпластинке, причем первый важен для дифференцировки и миграции нейронов, а второй – регулятор транскрипции и хромосомного ремоделирования. Хотя исследования на мышах установили роль мутаций Aspm при микроцефалии, некоторые из них связали эту мутацию с другими значительными дефектами. Одно исследование показало нарушения нервных волокон, при которых изменялась форма и структура коры и белого вещества. Это было показано после рождения при сравнении мышей KO и контрольной группы, где у мышей KO было уменьшено как количество клеток, так и толщина коры. Используя метод окрашивания клеток для гистологического анализа, исследование также показало более короткие расстояния между соседними нейронами у мышей KO, что указывает на аномалии выравнивания клеток в отсутствие нормального Aspm. Еще одним значительным последствием мутировавшего Aspm является нарушение зародышевой линии в мышиных моделях. Мутации в Aspm снижали фертильность как у самок, так и у самцов мышей, что проявлялось в снижении частоты наступления беременности и, следовательно, количества потомства, а также в уменьшении размера яичников у самок и количества сперматозоидов и размера яичек у самцов. Акцент на тяжелых мутациях зародышевой линии (в отличие от легкой микроцефалии) в этих мышиных моделях поднимает вопрос о том, может ли отбор ASPM у человека быть более тесно связан с репродукцией, чем с размером мозга. Помимо мышиных моделей, исследование на хорьках проливает свет на ASPM и его роль в определении размера и толщины коры. Исследователи выбрали хорьков вместо мышиных моделей из-за несоответствий между эффектами Aspm у мышей и эффектами ASPM у людей. Люди с микроцефалией из-за этой мутации гена, как правило, имеют значительно уменьшенный размер мозга (примерно на 50%), в то время как аналогичная мутация у мышей приводит лишь к незначительному уменьшению размера мозга. В этом исследовании 2018 года исследователи нацелились на экзон 15 Aspm, где мутация у людей связана с тяжелыми случаями микроцефалии. При потере функции Aspm у хорьков с мутациями Aspm наблюдалось уменьшение общего размера мозга на 40% в сочетании с отсутствием уменьшения размера тела, что аналогично эффектам потери ASPM у людей. В исследовании также рассматривались нейроразвивающие пути и механизмы, приводящие к нейрогенезу у хорьков KO по сравнению с контрольными группами WT, в частности, изучались три различных типа нейронных предшественников (NPC), все из которых экспрессируют митотический маркер Ki 67 и подвергаются радиальной глиальной миграции в корковую пластинку. Было обнаружено, что NPC внешней субвентрикулярной зоны (OSVZ) в значительной степени смещены, особенно в лобной и дорсальной областях, что отражает эффекты, наблюдаемые при уменьшении объема коры из-за KO ASPM.

The mouse gene, Aspm, is expressed in the primary sites of prenatal cerebral cortical neurogenesis. The difference between Aspm and ASPM is a single, large insertion coding for so called IQ domains. Studies in mice also suggest a role of the expressed Aspm gene product in mitotic spindle regulation. The function is conserved, the C. elegans protein ASPM 1 was shown to be localized to spindle asters, where it regulates spindle organization and rotation by interacting with calmodulin, dynein and NuMA related LIN 5. One mouse study looking at medulloblastoma growth in mice to study the Aspm gene, an ortholog to human ASPM, suggests that Aspm expression may drive postnatal cerebellar neurogenesis. This process occurs late in embryogenesis and immediately after birth over a time span of about 2 weeks in mice and 12 months in humans, and is regulated by the expression of the Shh gene. In proliferating cerebellar granule neuron progenitors (CGNPs), Shh expression in mouse models showed four times the amount of Aspm expression than those deprived of Shh expression in vivo. This induction of Aspm and up regulation during cerebellar neurogenesis was also seen in real time PCR, where its expression was relatively high at the peak of neurogenesis and much lower at the end of neurogenesis. Additionally, the study indicates that Aspm is necessary for cerebellar neurogenesis. In the presence of Aspm KO mutations and deletions, experimental mice models show decreased cerebellar volume under MRI, compared to the controls. In addition to mutated Aspm effects on neurogenesis, these mutations may also play a role in neural differentiation. When looking at adult brains in Aspm KO mice, there was a trend in overall size reduction, and variations in cortical thickness between mutant and wild type models. In the somatosensory cortex, KO mice had a significantly thicker layer I cortex, thinner layer VI cortex, and an overall decrease in cortical thickness in the cortical plate. Certain transcription factors expressions were also abnormal in the KO mice. For example, Tbr1 and Satb2 had an increased presence in the cortical sub plate, the first of which is important for differentiation and neuronal migration, and the second of which is a regulator of transcription and chromosomal remodeling. While mouse studies have established the role of Aspm mutations in microcephaly, several have linked this mutation to other significant defects. One study showed nerve fiber impairments in which the shape and form of cortex and white matter tissue was altered. This was shown postnatally comparing KO mice and controls, where both cell number and cortical thickness was decreased in KO mice. Using a cell staining methodology for histological analysis, the study also showed shorter distances between adjacent neurons in KO mice, indicating abnormalities in cell alignment in the absence of normal Aspm. Another significant impact of mutated Aspm is seen in germline abnormalities within mouse models. Mutations in Aspm were shown to reduce fertility in both female and male mice, indicated by a decrease in the rate of pregnancy and consequently the number of offspring, as well as a decrease in female ovarian size, as well as male sperm count and testicular size. The focus on severe germline mutations (as opposed to only mild microcephaly) in these mouse models raises the question as to whether or not human ASPM selection may be more significantly linked to reproduction than brain size. In addition to mouse models, a study using ferrets reveals more about ASPM and its role in determining cortical size and thickness. The researchers from this study chose ferrets over mouse models due to incongruencies between Aspm effects in mice versus ASPM effects in humans humans with microcephaly due to this gene mutation tend to have significantly reduced brain sizes (about 50% reduction), whereas the analogous mutation in mice only results in mild brain size reduction. In this 2018 study, researchers targeted Aspm exon 15, where a mutation in humans is linked to severe cases of microcephaly. With a loss of function in Aspm, ferrets with Aspm mutations saw a 40% decrease in overall brain size coupled with no reduction in body size, similar to the effects of loss of ASPM in humans. The study also looked at the neurodevelopmental pathways and mechanisms leading to neurogenesis in the KO ferrets compared to the WT controls, specifically studying three different neuron progenitor cell (NPC) types, all of which express the mitotic marker Ki 67 and undergo radial glial migration to the cortical plate. They found that outer subventricular zone (OSVZ) NPCs were largely displaced, especially frontally and dorsally which mirrors the effects seen in cortical volume reductions due to ASPM KO.

Исследования на людях

Первичная микроцефалия человека (ПМЧ) – это отдельный подтип, который генетически наследуется как аутосомно-рецессивный признак. ПМЧ характеризуется уменьшенным объемом коры головного мозга, связанным с легкой или умеренной умственной отсталостью и отсутствием других неврологических дефицитов. Кроме того, ПМЧ связана с отсутствием факторов окружающей среды, таких как внутриутробные инфекции, воздействие пренатального излучения или лекарственных препаратов, фенилкетонурия матери и асфиксия при рождении. На сегодняшний день у человека обнаружены мутации в шести локусах и четырех генах, ассоциированных с микроцефалией. ASPM, один из этих генов, локализован в локусе MCPH5. Наиболее частой причиной ПМЧ у людей является гомозиготная генетическая мутация гена ASPM, ортологичного гену *abnormal spindle* дрозофилы (asp). Pichon и соавторы получили BAC-клоны с фрагментами, полученными после BamHI-дигестии вставки "RP11 32D17", и использовали флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) для маркировки клонов флуоресцеином 12 dUTP. Этот ген также встречается с необычно высокой частотой среди населения Папуа – Новой Гвинеи (59,4%). В настоящее время существует два аллеля этого гена: более древний (возникший до 5800 лет назад) и более новый (возникший после 5800 лет назад). Примерно 10% людей имеют две копии нового аллеля ASPM, около 50% – две копии старого аллеля, а остальные 40% – по одной копии каждого. Среди носителей нового аллеля 50% имеют идентичные копии. Аллель оказывает влияние на генотип в большом (62 кбп) регионе, что представляет собой так называемый селективный сдвиг, сигнализирующий о быстром распространении мутации (например, нового аллеля ASPM) в популяции; это указывает на то, что мутация каким-то образом выгодна для организма. Исследование IQ людей с новым и без нового аллеля ASPM не выявило различий в среднем IQ, что не подтверждает предположение о том, что этот ген повышает интеллект. Другие гены, связанные с развитием мозга, также подвергались селективному давлению в различных популяциях. Ген DAB1, участвующий в организации клеточных слоев коры головного мозга, демонстрирует признаки селективного сдвига у китайцев. Ген SV2B, кодирующий белок синаптических везикул, также демонстрирует признаки селективного сдвига у афроамериканцев.

Human primary microcephaly (MCPH) is a distinct subtype that is genetically inherited as an autosomal recessive trait. MCPH is characterized by a smaller cerebral cortex associated with mild to moderate mental retardation and no other neurological deficits. Additionally, MCPH is associated with the absence of environmental causes such as intrauterine infections, exposure to prenatal radiation or drugs, maternal phenylketonuria, and birth asphyxia. To date, mutations in six loci and four genes associated with microcephaly have been discovered in humans. ASPM, one of these genes, is found at the MCPH5 locus. The most common cause of MCPH in humans is homozygous genetic mutation of the ASPM gene, orthologous to the Drosophila abnormal spindle gene (asp). Pichon et al. obtained BAC clones with BamHI digestion fragments of the "RP11 32D17" insert and used Fluorescence in situ Hybridization (FISH) in order to label the clones with fluorescein 12 dUTP. It is also found with an unusually high percentage among the people of Papua New Guinea, with a 59.4% occurrence. Currently, two alleles of this gene exist: the older (pre 5,800 years ago) and the newer (post 5,800 years ago). About 10% of humans have two copies of the new ASPM allele, while about 50% have two copies of the old allele. The other 40% of humans have one copy of each. Of those with an instance of the new allele, 50% of them are an identical copy. The allele affects genotype over a large (62 kbp) region, a so called selective sweep which signals a rapid spread of a mutation (such as the new ASPM) through the population; this indicates that the mutation is somehow advantageous to the individual. Testing the IQ of those with and without new ASPM allele has shown no difference in average IQ, providing no evidence to support the notion that the gene increases intelligence. Other genes related to brain development appear to have come under selective pressure in different populations. The DAB1 gene, involved in organizing cell layers in the cerebral cortex, shows evidence of a selective sweep in the Chinese. The SV2B gene, which encodes a synaptic vesicle protein, likewise shows evidence of a selective sweep in African Americans.