Екі өлшемді электрофорез (2-DE) – ақуыздарды талдауға арналған әдіс. Изоэлектрлік нүктесі бойынша ажыратылып, 2D гельде көрсетіледі. 1975 ж. енгізілген.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Екі өлшемді гельдік электрофорез, 2-DE немесе 2D электрофорез деп қысқартылатын, белоктарды талдау үшін кеңінен қолданылатын гельдік электрофорездің бір түрі. Белок қоспалары 2D гельдерде екі қасиеті бойынша екі өлшемде бөлінеді. 2-DE алғаш рет 1975 жылы О'Фаррелл және Клозе есімді ғалымдар тәуелсіз түрде ұсынған.
Two dimensional gel electrophoresis, abbreviated as 2 DE or 2 D electrophoresis, is a form of gel electrophoresis commonly used to analyze proteins. Mixtures of proteins are separated by two properties in two dimensions on 2D gels. 2 DE was first independently introduced by O'Farrell and Klose in 1975.
Бөлудің негізі
2D электрофорез бірінші өлшемдегі электрофорезден басталады, содан кейін молекулаларды екінші өлшемдегі электроферограмма жасау үшін бірінші өлшемнен перпендикуляр бөлінеді. Бірінші өлшемдегі электрофорез кезінде молекулалар олардың изоэлектрлік нүктесіне сәйкес сызықтық түрде бөлінеді. Екінші өлшемде молекулалар молекулалық массаға сәйкес бірінші электроферограммадан 90 градусқа бұрылып бөлінеді. Екі молекуланың екі түрлі қасиеті бірдей болуы сирек болғандықтан, 2D электрофорезде молекулалар 1D электрофорезге қарағанда тиімдірек бөлінеді. Бұл техниканы қолдану арқылы ақуыздарды екі өлшем бойынша бөлуге болады: изоэлектрлік нүкте, нативтік күйдегі ақуыз кешенінің массасы немесе ақуыз массасы. Изоэлектрлік нүкте бойынша бөлінуді изоэлектрлік фокус деп атайды. Осы үшін гельге pH градиенті және гель бойымен электрлік потенциал қолданылады, бір жағын екіншісінен оң немесе теріс етеді. pH-тың изоэлектрлік нүктеден басқа барлық мәндерінде ақуыздар зарядталған болады. Олар оң зарядталған болса, гельдің теріс жағына, ал теріс зарядталған болса, оң жағына тартылады. Бірінші өлшемде қолданылған ақуыздар гель бойымен қозғалып, өздерінің изоэлектрлік нүктесінде жиналады, яғни ақуыздың жалпы заряды 0 (бейтарап заряд) болатын нүктеде. Ақуыз кешендерінің массасы бойынша бөлу нативтік ПАЖ арқылы жүзеге асырылады, онда ақуыздар өздерінің нативтік күйінде қалады және электр өрісінде массасы мен кешендерінің массасына сәйкес бөлінеді. Таза заряд бойынша емес, өлшем бойынша бөлуді алу үшін Coomassie brilliant blue немесе литий додецилсульфаты (LDS) қолданылып, ақуыздарға қосымша заряд беріледі. Ақуыз кешендерін білу клеткадағы ақуыздардың жұмыс істеуін талдау үшін маңызды, өйткені ақуыздар көбінесе толыққанды жұмыс істеу үшін кешендерде бірігіп әрекет етеді. Клетканың осы суборганеллалық ұйымдалуын талдау үшін ақуыз кешендерінің нативтік күйін сақтайтын әдістер қажет. Тек масса бойынша бөлуді әдетте SDS-PAGE арқылы жүзеге асырады. SDS ақуыздарды денатурациялайды, көптеген кешендерді ыдыратады және масса мен заряд арақатынастарын шамамен теңестіреді. SDS екінші, перпендикуляр өлшем ретінде қолданылуы керек, өйткені ол кешендерді ыдыратып (нативтік ПАЖ-ды мүмкінсіз етеді) және масса мен заряд арақатынастарын теңестіреді (изоэлектрлік фокустауды мүмкінсіз етеді).
2 D electrophoresis begins with electrophoresis in the first dimension and then separates the molecules perpendicularly from the first to create an electropherogram in the second dimension. In electrophoresis in the first dimension, molecules are separated linearly according to their isoelectric point. In the second dimension, the molecules are then separated at 90 degrees from the first electropherogram according to molecular mass. Since it is unlikely that two molecules will be similar in two distinct properties, molecules are more effectively separated in 2 D electrophoresis than in 1 D electrophoresis. The two dimensions that proteins are separated into using this technique can be isoelectric point, protein complex mass in the native state, or protein mass. The separation by isoelectric point is called isoelectric focusing. Thereby, a pH gradient is applied to a gel and an electric potential is applied across the gel, making one end more positive than the other. At all pH values other than their isoelectric point, proteins will be charged. If they are positively charged, they will be pulled towards the more negative end of the gel and if they are negatively charged they will be pulled to the more positive end of the gel. The proteins applied in the first dimension will move along the gel and will accumulate at their isoelectric point; that is, the point at which the overall charge on the protein is 0 (a neutral charge). Separation by protein complex mass is done via native PAGE, in which proteins remain in their native state and are separated in the electric field following their mass and the mass of their complexes respectively. To obtain a separation by size and not by net charge, as in IEF, an additional charge is transferred to the proteins by the use of Coomassie brilliant blue or lithium dodecyl sulfate. Knowledge of protein complex is important for the analysis of the functioning of proteins in a cell, as proteins mostly act together in complexes to be fully functional. The analysis of this sub organelle organisation of the cell requires techniques conserving the native state of the protein complexes. Separate just by mass is commonly achived using SDS PAGE. SDS denatures the proteins, breaks apart most complexes, and approximately equalizes the mass to charge ratios. SDS must be done as the second, perpendicular dimension, as it breaks apart complexes (rendering native PAGE impossible) and equalizes mass to charge ratios (rendering IEF impossible).
Белоктарды анықтау
Нәтижесінде, бетіне протеиндер таратылған гель пайда болады. Бұл протеиндерді әр түрлі жолдармен анықтауға болады, бірақ ең көп қолданылатын бояулар – күміс және Кумассидің жарқын көк бояуы. Бірінші жағдайда, гельге күміс коллоиды жағылады. Күміс протеин ішіндегі цистеин топтарымен байланысады. Күміс ультракүлгін сәулеге ұшырағанда қараңғыланады. Күміс мөлшері қараңғылық деңгейімен байланысты, демек, гельдің белгілі бір жеріндегі протеин мөлшерімен. Бұл өлшеу шамамен мәлімет береді, бірақ көптеген жағдайларда жеткілікті. Күміс бояуы Кумассидің жарқын көк бояуынан 100 есе сезімтал, ал сызықтық диапазоны 40 есеге жетеді. 2D электрофорез арқылы протеиндерден басқа молекулаларды да бөлуге болады. Суперспиральдік сынақтарда, спиральға оралған ДНК бірінші өлшемде бөлінеді, ал екінші өлшемде ДНК интеркаляторымен (мысалы, этидий бромиді немесе аз канцерогенді хлороквин) денатурацияланады. Бұл протеин бөлінісіндегі туасынан PAGE/SDS PAGE комбинациясына ұқсас.
The result of this is a gel with proteins spread out on its surface. These proteins can then be detected by a variety of means, but the most commonly used stains are silver and Coomassie brilliant blue staining. In the former case, a silver colloid is applied to the gel. The silver binds to cysteine groups within the protein. The silver is darkened by exposure to ultra violet light. The amount of silver can be related to the darkness, and therefore the amount of protein at a given location on the gel. This measurement can only give approximate amounts, but is adequate for most purposes. Silver staining is 100x more sensitive than Coomassie brilliant blue with a 40 fold range of linearity. Molecules other than proteins can be separated by 2D electrophoresis. In supercoiling assays, coiled DNA is separated in the first dimension and denatured by a DNA intercalator (such as ethidium bromide or the less carcinogenic chloroquine) in the second. This is comparable to the combination of native PAGE/SDS PAGE in protein separation.
IPG-DALT
Жалпы қолданылатын әдіс – бірінші өлшемде тұрақтандырылған pH градиентін (IPG) пайдалану. Бұл әдіс IPG DALT деп аталады. Үлгі алдымен IPG гелінде (коммерциялық түрде қол жетімді) бөлінеді, содан кейін әрбір үлгі үшін гель тілімдерге кесіліп, SDS меркаптоэтанолында тепе-теңдікке келтіріліп, екінші өлшемде ажырату үшін SDS PAGE геліне жағылады. Әдетте IPG DALT ақуыздардың мөлшерін анықтау үшін қолданылмайды, себебі SDS PAGE геліне көшіру кезінде төмен молекулалық салмақты компоненттер жоғалады.
A common technique is to use an Immobilized pH gradient (IPG) in the first dimension. This technique is referred to as IPG DALT. The sample is first separated onto IPG gel (which is commercially available) then the gel is cut into slices for each sample which is then equilibrated in SDS mercaptoethanol and applied to an SDS PAGE gel for resolution in the second dimension. Typically IPG DALT is not used for quantification of proteins due to the loss of low molecular weight components during the transfer to the SDS PAGE gel.
2D гельді талдау бағдарламалық жасақтамасы
Санақтық протеомикада бұл құралдар негізінен биомаркерлерді жеке ақуыздарды мөлшерлеу арқылы талдайды және 2-DE гельінің сканерленген суретіндегі бір немесе бірнеше ақуыз "дақтың" арасындағы ажыратымды көрсетеді. Сонымен қатар, бұл құралдар ұқсас үлгілердің гельдері арасындағы дақтарды салыстырып, мысалы, аурудың ерте және озық сатыларындағы протеомикалық айырмашылықтарды көрсетеді. Бағдарламалық пакеттерге Delta2D (тоқтатылды), ImageMaster (тоқтатылды), Melanie, PDQuest (тоқтатылды), SameSpots және REDFIN – және тағы басқалары кіреді. Бұл технология кеңінен қолданылса да, оның интеллектуалдық деңгейі әлі толық жетілдірілмеген. Мысалы, PDQuest және SameSpots жақсы анықталған, жақсы ажыратылған ақуыз дақтарын мөлшерлеу және талдау бойынша келісімге бейім болса да, олар нашар анықталған, нашар ажыратылған дақтарда әртүрлі нәтижелер мен талдау тенденцияларын көрсетеді. Бұрын салыстырмалы зерттеулер жарияланып, зерттеушілерге олардың талдауы үшін "ең жақсы" бағдарламалық қамтамасыз етуді таңдауға көмектеседі. Әдетте стандартты гельдік электрофорез үшін қолданылса да, Sciugo суреттер жасау және мөлшерлеу үшін де пайдаланылуы мүмкін. Автоматты бағдарламалық талдаудың қиындықтары: толық ажыратылмаған (үстіне жапсарлас) дақтар (нашар анықталған немесе ажыратылмаған), әлсіз дақтар / қырыну (мысалы, "көлеңке дақтар"), гельдер арасындағы жүгіру айырмашылықтары (мысалы, ақуыз әртүрлі гельдерде әртүрлі орындарға жылжып барады), сәйкес келмейтін/табылмаған дақтар, нәтижесінде мәндердің жоғалуы, дұрыс емес сәйкес келетін дақтар, мөлшерлеу қателіктері (бірнеше ерекше дақтар бағдарламалық қамтамасыз етумен бір дақ ретінде қате анықталуы мүмкін және дақтың бөліктері мөлшерлеуден шығарылуы мүмкін), бағдарламалық алгоритмдердегі айырмашылықтар және осыған байланысты талдау тенденциялары. Дақтарды автоматты түрде гельде қорыту және одан кейін массалық спектрометрия арқылы ақуыздарды анықтау үшін жасалған тізімдерді пайдалануға болады. Массалық спектрометриялық талдау 1000–4000 атомдық массалық бірліктер диапазонындағы пептидтердің тізбегімен бірге нақты массалық өлшемдерді анықтауға мүмкіндік береді. 2DE гель суреттерін бағдарламалық талдаудың қазіргі тәсілдеріне шолу үшін Berth et al. немесе Bandow et al. еңбектерін қараңыз.
In quantitative proteomics, these tools primarily analyze bio markers by quantifying individual proteins, and showing the separation between one or more protein "spots" on a scanned image of a 2 DE gel. Additionally, these tools match spots between gels of similar samples to show, for example, proteomic differences between early and advanced stages of an illness. Software packages include Delta2D (discontinued), ImageMaster (discontinued), Melanie, PDQuest (discontinued), SameSpots and REDFIN – among others. While this technology is widely utilized, the intelligence has not been perfected. For example, while PDQuest and SameSpots tend to agree on the quantification and analysis of well defined well separated protein spots, they deliver different results and analysis tendencies with less defined less separated spots. Comparative studies have previously been published to guide researchers on the "best" software for their analysis. Although typically used for standard gel electrophoresis, Sciugo can also be used for figure creation and quantification. Challenges for automatic software based analysis include incompletely separated (overlapping) spots (less defined or separated), weak spots / noise (e. g., "ghost spots"), running differences between gels (e. g., protein migrates to different positions on different gels), unmatched/undetected spots, leading to missing values, mismatched spots, errors in quantification (several distinct spots may be erroneously detected as a single spot by the software and parts of a spot may be excluded from quantification), and differences in software algorithms and therefore analysis tendencies
Generated picking lists can be used for the automated in gel digestion of protein spots, and subsequent identification of the proteins by mass spectrometry. Mass spectrometry analysis can identify precise mass measurements along with the sequencing of peptides that range from 1000–4000 atomic mass units. For an overview of the current approach for software analysis of 2DE gel images, see Berth et al. or Bandow et al.