Двумерный электрофорез: разделение белков по изоэлектрической точке и молекулярной массе.

Введение

Двумерный гель-электрофорез, сокращенно 2-DE или 2D-электрофорез, — это разновидность гель-электрофореза, широко используемая для анализа белков. Смеси белков разделяются по двум характеристикам в двух измерениях на 2D-гелях. Метод 2-DE был впервые независимо предложен О’Фарреллом и Клозе в 1975 году.

Основание для разделения

2D электрофорез начинается с электрофореза в первом измерении, а затем разделяет молекулы перпендикулярно к разделению в первом измерении, создавая электроферограмму во втором измерении. В электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии со своей изоэлектрической точкой. Во втором измерении молекулы затем разделяются под углом 90 градусов к первой электроферограмме в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут схожи по двум различным свойствам, разделение молекул в 2D электрофорезе более эффективно, чем в 1D электрофорезе. Два измерения, в которых белки разделяются с использованием этой техники, могут быть изоэлектрической точкой, массой белкового комплекса в нативном состоянии или массой белка. Разделение по изоэлектрической точке называется изоэлектрическим фокусированием. Для этого к гелю прикладывается градиент pH, а также электрический потенциал, делающий один конец геля более положительным, чем другой. При всех значениях pH, отличных от их изоэлектрической точки, белки будут нести заряд. Если они положительно заряжены, они будут притягиваться к более отрицательному концу геля, а если отрицательно заряжены – к более положительному. Белки, нанесенные в первом измерении, будут перемещаться вдоль геля и накапливаться в своей изоэлектрической точке, то есть в точке, где суммарный заряд белка равен 0 (нейтральный заряд). Разделение по массе белкового комплекса осуществляется с помощью нативной ПАГЭ, при которой белки остаются в нативном состоянии и разделяются в электрическом поле в соответствии со своей массой и массой их комплексов. Для получения разделения по размеру, а не по чистому заряду, как в IEF, к белкам добавляется дополнительный заряд с использованием бриллиантового синего Кумасси или литийдодецилсульфата. Знание о составе белковых комплексов важно для анализа функционирования белков в клетке, поскольку белки в основном действуют вместе в комплексах для обеспечения полной функциональности. Анализ этой субклеточной организации клетки требует методов, сохраняющих нативное состояние белковых комплексов. Разделение только по массе обычно достигается с помощью SDS-PAGE. SDS денатурирует белки, разрушает большинство комплексов и приблизительно уравнивает отношение массы к заряду. SDS необходимо проводить как второе, перпендикулярное измерение, поскольку он разрушает комплексы (делая нативную ПАГЭ невозможной) и выравнивает отношение массы к заряду (делая IEF невозможным).

2 D electrophoresis begins with electrophoresis in the first dimension and then separates the molecules perpendicularly from the first to create an electropherogram in the second dimension. In electrophoresis in the first dimension, molecules are separated linearly according to their isoelectric point. In the second dimension, the molecules are then separated at 90 degrees from the first electropherogram according to molecular mass. Since it is unlikely that two molecules will be similar in two distinct properties, molecules are more effectively separated in 2 D electrophoresis than in 1 D electrophoresis. The two dimensions that proteins are separated into using this technique can be isoelectric point, protein complex mass in the native state, or protein mass. The separation by isoelectric point is called isoelectric focusing. Thereby, a pH gradient is applied to a gel and an electric potential is applied across the gel, making one end more positive than the other. At all pH values other than their isoelectric point, proteins will be charged. If they are positively charged, they will be pulled towards the more negative end of the gel and if they are negatively charged they will be pulled to the more positive end of the gel. The proteins applied in the first dimension will move along the gel and will accumulate at their isoelectric point; that is, the point at which the overall charge on the protein is 0 (a neutral charge). Separation by protein complex mass is done via native PAGE, in which proteins remain in their native state and are separated in the electric field following their mass and the mass of their complexes respectively. To obtain a separation by size and not by net charge, as in IEF, an additional charge is transferred to the proteins by the use of Coomassie brilliant blue or lithium dodecyl sulfate. Knowledge of protein complex is important for the analysis of the functioning of proteins in a cell, as proteins mostly act together in complexes to be fully functional. The analysis of this sub organelle organisation of the cell requires techniques conserving the native state of the protein complexes. Separate just by mass is commonly achived using SDS PAGE. SDS denatures the proteins, breaks apart most complexes, and approximately equalizes the mass to charge ratios. SDS must be done as the second, perpendicular dimension, as it breaks apart complexes (rendering native PAGE impossible) and equalizes mass to charge ratios (rendering IEF impossible).

Обнаружение белков

В результате получается гель с белками, распределенными по его поверхности. Эти белки можно обнаружить различными методами, но наиболее часто используются окрашивание серебром и окрашивание бриллиантовым синим Кумасси. В первом случае на гель наносят коллоид серебра. Серебро связывается с цистеиновыми группами в белке. Под воздействием ультрафиолетового света серебро темнеет. Интенсивность окраски серебром пропорциональна его количеству, а следовательно, и количеству белка в данной точке геля. Это измерение дает лишь приблизительные значения, но для большинства задач этого достаточно. Окрашивание серебром в 100 раз чувствительнее, чем окрашивание бриллиантовым синим Кумасси, и имеет 40-кратный диапазон линейности. Помимо белков, методом двухмерного электрофореза можно разделять и другие молекулы. В анализах суперспирализации коильная ДНК разделяется в первом измерении, а затем денатурируется интеркалирующим агентом ДНК (например, бромидом этидия или менее канцерогенным хлорохином) во втором. Это аналогично сочетанию нативной ПАГЭ и ПАГЭ в SDS при разделении белков.

IPG-DALT

Общим методом является использование иммобилизованного pH-градиента (IPG) в первом измерении. Эта методика называется IPG DALT. Образец сначала разделяют на IPG-геле (который коммерчески доступен), затем гель разрезают на фрагменты для каждого образца, которые затем уравновешивают в растворе SDS и меркаптоэтанола и наносят на SDS-PAGE гель для разделения во втором измерении. Как правило, IPG DALT не используется для количественного определения белков из-за потери низкомолекулярных компонентов при переносе на SDS-PAGE гель.

Программное обеспечение для анализа геля 2D

В количественной протеомике эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры, количественно определяя отдельные белки и демонстрируя разделение между одним или несколькими белковыми "пятнами" на сканированном изображении 2DE-геля. Кроме того, эти инструменты сопоставляют пятна между гелями схожих образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранними и поздними стадиями заболевания. Программные пакеты включают Delta2D (прекращено), ImageMaster (прекращено), Melanie, PDQuest (прекращено), SameSpots и REDFIN – среди прочих. Хотя эта технология широко используется, её интеллектуальные возможности ещё не совершенны. Например, PDQuest и SameSpots, как правило, согласуются в количественной оценке и анализе хорошо определенных и четко разделенных белковых пятен, но дают различные результаты и демонстрируют разные тенденции анализа при работе с менее определенными и хуже разделенными пятнами. Ранее были опубликованы сравнительные исследования, чтобы помочь исследователям выбрать "лучшее" программное обеспечение для их анализа. Sciugo, хотя обычно используется для стандартного гелевого электрофореза, также может применяться для создания изображений и количественной оценки. Сложности автоматического анализа на основе программного обеспечения включают неполностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее четкие или разделенные), слабые пятна / шум (например, "фантомные пятна"), различия в прохождении гелей (например, белок мигрирует в разные позиции на разных гелях), несовпадающие / необнаруженные пятна, приводящие к отсутствующим значениям, несоответствующие пятна, ошибки в количественном определении (программное обеспечение может ошибочно обнаруживать несколько отдельных пятен как одно, а части пятна могут быть исключены из количественного определения), а также различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, в тенденциях анализа.

Сгенерированные списки выбора могут использоваться для автоматического внутригельного расщепления белковых пятен и последующей идентификации белков с помощью масс-спектрометрии. Масс-спектрометрический анализ позволяет определить точные измерения массы, а также секвенировать пептиды в диапазоне от 1000 до 4000 атомных единиц массы. Обзор современного подхода к программному анализу изображений 2DE-гелей см. в работах Berth et al. или Bandow et al.